HPLC-DPPH法在線分析遠(yuǎn)志抗氧化活性成分研究*

邸 學(xué),曲浩源,王海波,裴帥龍,魯茂盛

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

傳統(tǒng)的天然抗氧化活性產(chǎn)物研究，一般是通過(guò)一系列的成分分離和和純化技術(shù)得到提取物或單體成分，再進(jìn)行體內(nèi)或體外活性測(cè)定，因此，研究周期長(zhǎng)、效率低，又較為盲目，而且不利于性質(zhì)不穩(wěn)定化合物的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)[6-7]。HPLC-DPPH在線篩選抗氧化成分，是將色譜柱分離后的樣品溶液與DPPH 溶液混合，反應(yīng)后流入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，抗氧化活性化合物與DPPH反應(yīng)，使其吸收減弱從而形成倒峰；通過(guò)對(duì)比樣品HPLC色譜圖和DPPH自由基清除反應(yīng)后HPLC圖譜，即可進(jìn)行不同成分抗氧化活性的在線分析[8-9]。該方法能夠直觀反映混合樣品中不同成分清除自由基能力，實(shí)現(xiàn)混合樣品中不同成分分離和抗氧化活性的同步測(cè)定，具有高效、原位、簡(jiǎn)捷、快速等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)已逐漸應(yīng)用于天然抗氧化活性成分的篩選分析。

遠(yuǎn)志的皂苷、多糖、黃酮等組分的抗氧化活性已有相關(guān)研究，但其中的糖酯類(lèi)活性成分的抗氧化活性的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)研究通過(guò)HPLC-DPPH法在線分析、全面篩選遠(yuǎn)志的抗氧化活性成分，并采用對(duì)照樣品對(duì)照量化其抗氧化活性的效應(yīng)，方法操作簡(jiǎn)便、高效，為遠(yuǎn)志的藥效活性物質(zhì)成分研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1100液相色譜儀；Boltimate C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)；柱后反應(yīng)器(0.25 mm×20 m，儀佳科技有限公司)；RPL-D2000 柱溫箱(大連日普利科技儀器有限公司)。

1.2 材料與試劑

2-聯(lián)苯基-1-苦基腈基(DPPH)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)，均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇(色譜純)，購(gòu)于天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；磷酸(色譜純)、乙腈(色譜純)，購(gòu)于天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；過(guò)硫酸鉀、L(+)-抗壞血酸，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；西伯利亞遠(yuǎn)志糖酯A6(SA6)、3,6’-二芥子酰基蔗糖(DSS)，購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；純凈水，購(gòu)于杭州娃哈哈公司。遠(yuǎn)志，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬植物遠(yuǎn)志(Polygala tenuifolia Willd.)的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

供試品溶液的制備：取遠(yuǎn)志藥材適量，加8倍量水，煎煮提取2次，每次 2 h，合并提取液；減壓濃縮至 20 mg/mL，加甲醇稀釋至 10 mg/mL，微孔濾膜濾過(guò)，備用。

對(duì)照樣品溶液的制備：精密稱取DSS、SA6對(duì)照品適量，分別加入甲醇配制成質(zhì)量濃度為 0.1 mg/mL 的對(duì)照品溶液，備用。精密稱取Trolox對(duì)照樣品，加入甲醇分別配制成質(zhì)量濃度為 0.01 mg/mL 的對(duì)照樣品溶液，備用。

DPPH反應(yīng)液的制備：精密稱取DPPH試劑適量，加入甲醇配制成質(zhì)量濃度為 10 μmol/L 的溶液，備用。

2.2 HPLC-DPPH法分析條件

分析試驗(yàn)裝置及流程：參考文獻(xiàn)并優(yōu)化試驗(yàn)裝置流程，試驗(yàn)流路體系分別為樣品高效分離路徑(A)和DPPH自由基清除檢測(cè)系統(tǒng)路徑(B)。待測(cè)樣品由路徑A 經(jīng)液相色譜法分離后與DPPH自由基溶液經(jīng)三通連接管混合，進(jìn)入規(guī)格為 0.25 mm×20 m 的反應(yīng)器充分反應(yīng)。再經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)獲得樣品反應(yīng)后的色譜圖。分別以甲醇溶液、DPPH溶液或?qū)φ諛悠啡芤簽閷?duì)照，對(duì)比分析遠(yuǎn)志成分抗氧化活性。

遠(yuǎn)志成分分析：色譜柱為Agilent C18柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)；柱溫 40 ℃；流速 0.25 mL/min；進(jìn)樣量 5 μL；流動(dòng)相為0.05%磷酸水(A)-0.05%磷酸乙腈(B)。梯度洗脫條件：0～5 min 8%～20%(B),10～32 min 26%～32%(B),35～42 min 55%～8%(B)。檢測(cè)波長(zhǎng)為 320 nm。

HPLC-DPPH在線分析：為保證色譜分離效果和抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度，對(duì)DPPH反應(yīng)液濃度(5、10、20 μmol/L)、遠(yuǎn)志洗脫液與DPPH溶液的體積比(2∶3、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、混合及反應(yīng)時(shí)間(0.6、0.8、1.2 min)、反應(yīng)溫度(25、30、40 ℃)等多種因素影響進(jìn)行優(yōu)化，確定反應(yīng)條件為DPPH反應(yīng)液濃度為 10 μmol/L，流速為 1 mL/min，反應(yīng)器規(guī)格為 0.25 mm×20 m，反應(yīng)物的質(zhì)量比1∶4、反應(yīng)時(shí)間 0.8 min，反應(yīng)溫度 40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)是 517 nm。

2.3 遠(yuǎn)志抗氧化活性成分在線篩選

取遠(yuǎn)志供試品溶液，按2.2項(xiàng)進(jìn)行遠(yuǎn)志成分及抗氧化活性效應(yīng)分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。遠(yuǎn)志樣品抗氧化活性效應(yīng)分析圖上可觀察到8個(gè)倒峰出現(xiàn)，其中2、5號(hào)峰位置處倒峰強(qiáng)度較大，其他位置處倒峰強(qiáng)度較小。根據(jù)倒峰強(qiáng)度判斷，抗氧化活性最強(qiáng)成分為5號(hào)位置成分，2號(hào)位置成分次之，6號(hào)等其他位置處成分抗氧化活性較弱。

A.遠(yuǎn)志樣品成分分析圖；B.遠(yuǎn)志樣品-DPPH譜圖； C.Trolox-DPPH譜圖圖1 HPLC-DPPH在線分析色譜圖

2.4 遠(yuǎn)志成分抗氧化活性強(qiáng)度分析

取對(duì)照品溶液按2.2項(xiàng)進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。保留時(shí)間對(duì)照、外標(biāo)法計(jì)算遠(yuǎn)志中的DSS(5號(hào))、SA6(2號(hào))含量。再以SA6為對(duì)照，采用歸一化法計(jì)算抗氧化活性成分近似含量。采用倒峰的峰面積與成分含量的比值,衡量抗氧化活性的強(qiáng)度；再以Trolox活性為對(duì)照，計(jì)算遠(yuǎn)志成分抗氧化活性效應(yīng)比值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 遠(yuǎn)志成分抗氧化活性效應(yīng)分析表

結(jié)果表明，采用對(duì)照樣品對(duì)照方法進(jìn)行遠(yuǎn)志成分抗氧化活性的半定量測(cè)定，量化分析不同成分的抗氧化活性的情況，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志藥材中抗氧化活性排序?yàn)镈SS、SA6。

3 結(jié)論與討論

本研究利用HPLC-DPPH在線分析法，進(jìn)行遠(yuǎn)志抗氧化活性成分篩選研究，能夠快速實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)志中DSS與SA6等抗氧化活性成分的篩選。方法簡(jiǎn)捷、高效，能夠快速篩選復(fù)雜中藥樣品的藥效活性成分。

遠(yuǎn)志藥材化學(xué)成分種類(lèi)復(fù)雜，成分眾多，對(duì)色譜分離條件要求較高。進(jìn)行遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，需要應(yīng)用全面、準(zhǔn)確的多成分共同測(cè)定方法，綜合考慮色譜柱載樣量、色譜分離效果和分析周期等多種因素，最后篩選確定分析條件。

本研究表明，遠(yuǎn)志主要抗氧化活性成分3,6’-二芥子酰基蔗糖、西伯利亞遠(yuǎn)志糖酯A6，也是遠(yuǎn)志主要藥效活性組分[10-12]。對(duì)遠(yuǎn)志藥材中各成分抗氧化活性的全面評(píng)價(jià)，有助于更準(zhǔn)確分析遠(yuǎn)志藥材多種藥效成分之間的藥效作用關(guān)聯(lián)機(jī)制，為遠(yuǎn)志的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供研究支持。