前列腺癌EpCAM特異性分子探針的構建及其在體MR成像研究

仲津漫，丁健科，劉朵朵，陳欣，楊全新

前列腺癌是嚴重威脅男性健康的泌尿生殖系惡性腫瘤之一，約占前列腺惡性腫瘤的95%[1]。臨床診斷前列腺癌的方法主要有直腸指檢、血清前列腺特異性抗原測定以及超聲、MRI等影像診斷方法，其中MRI具有極高的軟組織分辨率，可以多方位、多參數成像，是目前公認的診斷前列腺癌理想的檢查手段[2,3]。但對于早期前列腺癌，MRI診斷缺乏特異性，易與一些前列腺良性病變相混淆。近年來，基于細胞分子水平的靶向對比劑研究逐漸成為熱點。

上皮細胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是一種跨膜糖蛋白，在正常上皮細胞中表達極低[4]。研究表明EpCAM在前列腺癌及癌旁組織中均呈過表達，且表達水平與前列腺癌的術前和術后Gleason評分呈正相關，與無復發生存率呈負相關。過表達EpCAM可顯著增強前列腺癌細胞增殖、侵襲的能力[5,6]。金磁納米微粒是一種以氧化鐵為核心，表面被覆金作為殼的新型核/殼結構復合微粒[7]，不僅具有膠體金的光學性質和偶聯性能，還兼具超順磁性氧化鐵核心的磁響應性及其衍生的分離純化能力，在MR分子影像學中具有極大的應用前景。本研究利用GoldMag金磁納米微粒的理化性質，將其與本課題組先前制備的EpCAM特異性核酸適配體Ep1[8]偶聯，構建分子探針Ep1-GoldMag，檢測其對EpCAM陽性的前列腺癌細胞的靶向親和性，進一步探討其在活體內MR成像的可行性，為前列腺癌的早期靶向診療研究奠定實驗基礎。

材料與方法

1.主要儀器和試劑

人前列腺癌細胞系LNCap、PC-3以及人正常前列腺基質細胞系WPMY-1購自中國科學院上海生命科學研究所細胞庫；核酸適配體Ep1在本人研究生期間的課題實驗中已成功制備并保存；DMEM、RPMI-1640培養基購自Gibco公司；進口胎牛血清購自ZETA LIFE公司；GoldMagTM-CS金磁納米微粒試劑盒購自西安金磁納米生物有限公司；其他試劑均為進口分裝或國產分析純試劑。

其他儀器還包括磁性分離器(西安金磁納米生物技術有限公司)、FACS Calibur流式細胞儀(BD美國)、熒光顯微鏡及照相系統(Olympus日本)、激光共聚焦熒光顯微鏡(Nikon日本)、紫外分光光度計(Bio-Rad公司)、3.0T磁共振掃描儀(Siemens Magnetom Tim Trio 3.0 T MRI)。

2.核酸適配體在金磁納米微粒表面的固定化效率檢測

將100 μL 1 mg/mL GoldMagTM-CS金磁納米微粒懸液加入500 μL偶聯緩沖液振蕩混勻，磁性分離5 min。將Ep1分別稀釋成0 μg/μL、20 μg/μL、40 μg/μL、60 μg/μL、80 μg/μL、100 μg/μL、120 μg/μL、140 μg/μL、160 μg/μL等一系列濃度，加入偶聯緩沖液混勻，留取部分Ep1溶液標記為pre。將余下Ep1溶液重懸上述磁性分離后的金磁納米微粒，37℃孵育1 h，磁性分離后留取上清液，標記為post。加入1000 μL PBST緩沖液洗滌、重懸偶聯產物，磁性分離，留取部分上清液，標記為wash，以PBST緩沖液作為空白對照，分別測量pre、post和wash樣品在260 nm處的吸光度值(optical density,OD)，用如下公式計算Ep1在金磁納米微粒表面的固定化效率：固定化效率(%)=(ODpre-ODpost-ODwash)/ODpre×100%。

3.分子探針Ep1-GoldMag-tBid構建

將100 μL金磁納米微粒懸液加入500 μL偶聯緩沖液充分振蕩混勻，磁性分離5 min，棄上清。將40 μg核酸適配體Ep1加入500 μL偶聯緩沖液充分混勻，并以此重懸上述磁性分離后的金磁納米微粒溶液，37℃孵育30 min后磁性分離。洗滌后再加入封閉緩沖液封閉1 h，PBS重復洗滌后磁性分離，所得沉淀即為目的分子探針Ep1-GoldMag。用同樣方法制備ssDNA-GoldMag作為陰性對照組。

4.免疫熒光實驗檢測Ep1-GoldMag的細胞特異性

將LNCap、PC-3及WPMY-1細胞分別接種于20 mm激光共聚焦培養皿中培養，待細胞生長至培養皿底面積約75%時，吸棄上清液，PBS洗滌，向培養皿中加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，50 g/L BSA室溫封閉1 h，用PBS洗滌后加入200 pmol FAM標記的分子探針Ep1-GoldMag溶液，置于4℃避光孵育8 h，再加入DAPI室溫避光孵育10 min襯染細胞核，PBS重復洗滌后封片，用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察各細胞的熒光顯示比例。

5.前列腺癌荷瘤裸鼠模型構建

制備前列腺癌PC-3細胞懸液，調整其濃度為5×106/200 μL。4～6周齡Bab/c雄性裸鼠(體重范圍：14.5～21.0 g)12只，隨機分為兩組，每組各6只，每只裸鼠右側皮下注射瘤細胞懸液200 μL，隔天追加注射200 μL/只1次，置于SPF級環境飼養，隔日觀察并記錄裸鼠及其腫瘤的生長情況。在相同條件下實驗重復3次。

6.檢測EpCAM在前列腺癌荷瘤裸鼠腫瘤及重要臟器組織中的表達

待荷瘤裸鼠腫瘤平均直徑達0.8～1.0 cm時，將裸鼠麻醉后脫臼處死，取其腫瘤及心、肝、脾、肺、腎等重要臟器組織浸泡于4%多聚甲醛固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制成石蠟組織塊，切片后依次經過烘烤、脫蠟復水、抗原修復、封閉，向組織切片加入兔抗人EpCAM抗體4℃孵育過夜，再加入兔超敏二步法免疫組化檢測試劑室溫孵育20 min，洗片后加入Poly-HRP anti-Rabbit IgG，室溫孵育20 min，再用DAB溶液顯色。用蘇木素染核5 min，依次經過分化、返藍、脫水、透明，用中性樹脂封片，加蓋蓋玻片封固，在光學顯微鏡下觀察、取照。

7.組織免疫熒光實驗檢測Ep1-GoldMag的組織特異性

將50 μL FAM標記的Ep1-GoldMag經內眥靜脈注入裸鼠體內，隨后將裸鼠麻醉后脫臼處死，取其腫瘤及心、肝、脾、肺、腎等重要臟器組織迅速冷凍，OCT包埋后制備冰凍組織切片。加入5% BSA室溫封閉1 h，用DAPI染核，甘油-滅菌雙蒸水封片，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察、取照。

8.前列腺癌荷瘤裸鼠MR特異性成像

將裸鼠麻醉后置于西門子3.0T MRI小動物專用線圈進行MRI掃描，采用俯臥位、頭先進、T2WI冠狀位方向掃描，掃描參數：TR 7400 ms，TE 66 ms，視野200 mm×200 mm，層厚2.0 mm，層數15，翻轉角150°，平均采集次數4次。將50 μL Ep1-GoldMag經裸鼠內眥靜脈注入其體內，分別在注射后1 h、6 h及12 h對裸鼠行MRI掃描，體位和掃描參數均與注射前MRI掃描相同。掃描完成后對圖像和數據進行后處理，測量裸鼠腫瘤的信號強度。采用Graph Pad Prism 6.0軟件進行統計學分析，利用One-way Anova和t檢驗比較各組裸鼠腫瘤在注入分子探針前后不同時間點的信號強度差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.核酸適配體Ep1在金磁納米微粒表面的固定化效率

采用紫外分光光度計檢測Ep1在金磁納米微粒表面的固定化效率，結果顯示隨著加入Ep1的含量逐漸增加，其在金磁納米微粒表面的固定化效率逐漸下降(圖1)。當Ep1加入40 μg時，其在金磁納米微粒表面的固定化效率約為92%，當Ep1加入50 μg時，其在金磁納米微粒表面的固定化效率約為86%。

2.Ep1-GoldMag的細胞特異性檢測

將Ep1-GoldMag分別與LNCap、PC-3和WPMY-1細胞孵育后，采用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察熒光在細胞的分布情況，結果顯示與Ep1-GoldMag作用的兩種EpCAM陽性的前列腺癌細胞膜上均可見明顯的綠色熒光，而與對照組ssDNA-GoldMag作用的細胞膜上未見明顯綠色熒光顯示(圖2)，結果表明Ep1-GoldMag具有良好的EpCAM靶向親和性。

圖1 核酸適配體Ep1在金磁納米微粒表面的固定化效率。 圖2 激光共聚焦熒光顯微鏡觀察Ep1-GoldMag的細胞特異性。

3.EpCAM在前列腺癌荷瘤裸鼠腫瘤及重要臟器組織中的表達

用免疫組織化學染色實驗檢測前列腺癌PC-3荷瘤裸鼠腫瘤組織及心、肝、脾、肺、腎等重要臟器組織中EpCAM的表達情況。結果顯示，荷瘤裸鼠腫瘤組織中EpCAM呈高表達，而心、肝、脾、肺、腎等臟器組織中EpCAM表達不明顯(圖3)。

圖3 免疫組化染色檢測前列腺癌荷瘤裸鼠腫瘤組織及其重要臟器組織中EpCAM的表達。 圖4 激光共聚焦熒光顯微鏡觀察Ep1-GoldMag的組織特異性。

4.Ep1-GoldMag的腫瘤組織特異性檢測

將50 μL分子探針經內眥靜脈注入裸鼠體內，隨后將裸鼠麻醉后予以脫臼處死，分別取其腫瘤組織及心、肝、脾、肺、腎等重要臟器組織制成冰凍組織切片。采用組織免疫熒光實驗檢測Ep1-GoldMag在裸鼠腫瘤組織及重要組織器官的分布情況。結果顯示Ep1-GoldMag可以特異性集聚于荷瘤裸鼠的腫瘤組織，而在心、肝、脾、肺、腎等重要組織臟器中未見明顯分布(圖4)。

5.Ep1-GoldMag對前列腺癌荷瘤裸鼠的MR特異性成像

對荷瘤裸鼠行MRI掃描，隨后將Ep1-GoldMag經內眥靜脈注入其體內，分別在注射后1 h、6 h和12 h對裸鼠再次行MRI掃描。結果顯示注入Ep1-GoldMag 1 h后，腫瘤組織T2WI信號明顯減低，注入6 h后腫瘤組織T2WI信號持續減低，注入12 h后腫瘤組織T2WI信號強度略有升高，但與注射前相比仍呈明顯低信號；而ssDNA-GoldMag注射前后T2WI信號強度未見明顯減低(圖5a)，實驗組與對照組在分子探針注入后各時間點之間的信號強度差異均具有統計學意義；此外，實驗組內部注射前與注射后各時間點的信號強度差異均具有統計學意義(圖5b，表1、2)，實驗結果表明Ep1-GoldMag可以在體內特異性靶向并結合EpCAM陽性的前列腺腫瘤組織，并使其在MR上成像。

圖5 Ep1-GoldMag注射前與注射后1h、6h和12h前列腺癌荷瘤裸鼠的MR成像。a) 注入分子探針Ep1-GoldMag 1h后進行MRI掃描，可見裸鼠腫瘤組織T2WI信號強度明顯減低，注入分子探針6 h后，腫瘤組織T2WI信號強度進一步減低，注入分子探針12h后，腫瘤組織T2WI信號強度略有回升，但與注射前相比仍呈明顯低信號，而對照組分子探針ssDNA-GoldMag注射前后腫瘤組織T2WI信號強度未見明顯減低; b) 箱式圖顯示Ep1-GoldMag實驗組與ssDNA-GoldMag對照組兩組之間的T2WI信號強度差異具有統計學意義。

表1 實驗組與對照組在注入分子探針前后不同時間點的腫瘤T2WI信號強度比較

表2 分子探針2組1h、6h和12h裸鼠腫瘤T2WI信號強度比較

討 論

前列腺癌是中老年男性最常見的泌尿生殖系惡性腫瘤之一。傳統的治療手段如手術多適用于早期前列腺癌。內分泌治療是進展期前列腺癌最有效的治療方法，但在歷經2～3年的有效期，病情終將進展為雄激素非依賴性難治階段，使內分泌治療失效，患者預后較差[9]。因此，早期發現并準確診斷前列腺癌對于改善患者預后、延長生存期至關重要。

與傳統的影像學相比，新興的分子影像學是將分子生物學等基礎學科引入到影像醫學領域中來，可以從細胞分子層面探查疾病在活體的發展過程[10]。MRI以其高軟組織分辨率及成像參數多元化而成為理想的分子影像學診斷媒介[11-13]，但其特異度和靈敏度相對較低。通過尋找具有磁響應性的MR對比劑，再聯合核酸適配體的高親和力特性可以制備兼具特異性靶向病灶并使其MR成像的分子探針，為腫瘤的靶向診斷和精準治療提供了新方法。

在先前的研究中[8]，本課題組利用細胞指數富集配基的系統進化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技術已成功制備靶向EpCAM分子的特異性核酸適配體Ep1，并通過一系列實驗驗證了Ep1對EpCAM陽性組織細胞的特異性和親和性，為下一步分子探針的構建奠定了實驗基礎。

超順磁性氧化鐵納米微粒(super paramagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)是一類新型的納米級材料，具有良好的超順磁性、生物相容性、生物降解性以及表面特性[14]，在生物醫學領域如腫瘤細胞MRI顯像等方面應用前景廣闊。基于其超順磁性的物理特性，SPIONs可以明顯縮短T2和T2*馳豫時間，從而降低SPIONs聚集處組織細胞的MR信號強度[15]。SPIONs對MR馳豫性能的影響主要由磁鐵礦芯的尺寸、組成、結晶度和表面被覆涂層等物理化學性質決定。增大SPIONs直徑以及在其表面涂覆聚合物涂層均可增加T2馳豫性能、增加組織中SPIONs的局部濃度、降低背景組織產生的信號噪聲[16]。本研究采用的GoldMag金磁納米微粒以氧化鐵為主體，本質上屬于SPIONs，具有超順磁性氧化鐵的磁響應性能[17]。為了權衡尺寸及其MR成像馳豫性能，本研究采用的金磁納米微粒直徑約40～50 nm，這種金磁納米微粒在表面涂覆了金被膜，可以在保證MR成像質量的同時兼具偶聯性能。經過固定化效率檢測，1 mg金磁納米微粒表面可偶聯約40 μg核酸適配體Ep1，可滿足本實驗偶聯微量核酸適配體的需要。

分子探針進入體內以后，在血循環中需要有合適的清除期，以便既能有效成像，又不會產生高本底。先前一系列小動物活體MR成像研究顯示，在注射對比劑后平均2～5 h左右，目標病灶呈現明顯的特異性強化，延遲成像時間可達20 h[18,19]。本研究分別選擇在注射后1 h、6 h以及12 h對荷瘤裸鼠行MRI掃描，發現早在對比劑注入1 h時，病灶已有明顯信號改變，6 h后病灶特異性顯像更為顯著，延遲至12 h，雖然信號強度較6 h時有所回升，但仍呈現特異性強化，與注入對比劑前相比有統計學差異。

本研究制備的分子探針Ep1-GoldMag具有良好的理化性能，不僅具有EpCAM組織細胞特異性，還能使前列腺癌EpCAM荷瘤裸鼠在MR上特異性成像，但對于其生物相容性、半衰期及代謝途徑等藥代動力學特性還有待進一步研究。