復合微生物菌劑對靈芝菌、青枯雷爾氏菌的抑菌對比研究

DOI：10.20023/j.cnki.2095-5774.2023.05.013

收稿日期：2023-06-12

基金項目：廈門市科技局資助項目（3502Z20226016）；福建省科技廳STS計劃配套項目（2023T3021）

作者簡介：劉泉林（1988-），男，農藝師，主要從事園林養護與管理工作，E-mail：1253352667@qq.com

摘要要：【目的】對比復合微生物菌劑對靈芝菌、青枯雷爾氏菌的抑菌效果，為開展有效防治植物的靈芝根腐病和青枯病提供參考。【方法】從鳳凰木上分離獲得2株靈芝菌，購買青枯雷爾氏菌，分別在PDA、SPA培養基上加入復合微生物菌劑進行培養，以無復合微生物菌劑培養的菌株為對照，觀察抑菌效果。【結果】復合微生物菌劑對靈芝菌的抑菌圈直徑為0.50和0.67 cm，平均抑菌率為97.69%，對青枯雷爾氏菌的抑菌圈直徑為2.50、2.70和2.90cm，平均抑菌率為30.00%。【結論】復合微生物菌劑對真菌類的鳳凰木根腐病靈芝菌抑菌率在95.37%～100.00%，生防效果好；對細菌類的青枯雷爾氏菌的抑制作用差。

關鍵詞：鳳凰木；復合微生物菌劑；靈芝菌；青枯雷爾氏菌；抑菌率

中圖分類號：S144.1；S567.31? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2095-5774（2023）05-0381-04

A Comparative Study on Bacteriostasis of Compound Microbial Agents against

Ganoderma lucidum and Ralstonia solanacearum

Liu Quanlin

（Xiamen Jimei Gardening and Landscaping Co.，Ltd.，Xiamen Muhicipal Group，Xiamen，Fujian 361021，China）

Abstract：【Objective】The aim of this study was to compare the bacteriostatic effects of compound microbial agents on Ganoderma lucidum and Ralstonia solanacearum in order to provide references for their effective control. 【Method】Two strains of Ganoderma lucidum were isolated from Delonix regia. Ralstonia Solanacearum was cultured on PDA and SPA media，respectively，with the addition of the compound microbial agent，and the strains cultured without the compound microbial agent were used as the control to observe the comparative bacteriostasis effect.【Result】The average diameter of inhibition zone of compound microbial agents against Ganoderma lucidum was 0.50 cm and 0.67 cm，respectively. The average bacteriostatic rate was 97.69%. The average diameter of inhibition zone of compound microbial agents against Ralstonia solanacearum was 2.50 cm，2.70 cm and 2.90 cm，respectively. The bacteriostatic rate was 30.00%.【Conclusion】The bacteriostatic rate of the compound microbial agent against the root rot of Ganoderma lucidum was 95.37%-100.00%. The bacteriostatic effect of the compound microbial agent was good against Ganoderma lucidum and not good against Ralstonia solanacearum.

Key words： Delonix regia；Compound microbial agent；Ganoderma lucidum；Ralstonia solanacearum；Bacteriostatic rate

復合微生物菌劑的核心菌群主要包括芽孢桿菌等有益菌群，在逆境中對維持植物和土壤健康起著重要作用，因而被用來代替化學農藥成為城市園林植物病蟲害防治的熱點方向。復合微生物菌劑施加后對土壤生態系統的改善體現在三個方面，一是可以增強植物對土壤中磷元素的吸收、利用、轉化；二是可以提高土壤中功能酶的活性，將養分轉換為更易被植物吸收的形態；三是能抑制土壤中病原菌的活性［1］。

鳳凰木（Delonix regia）根腐病的病原腐菌屬靈芝菌是一種弱寄生真菌，常以菌絲體或厚壁孢子在病殘體或土壤中越冬，分生孢子通過雨水、灌溉水或土壤耕作傳播［2］，根據文獻報道常見的有4種，靈芝（Ganoderma lucidum）、熱帶靈芝（Ganoderma tropicum）、南方靈芝（Ganoderma australe）、韋伯氏靈芝（Ganoderma weberianum）。靈芝菌子實體大型，高8～12 cm，1 a生，木栓質至木質，一般在高溫多雨的7-9月出現，往往是多個子實體同時長出，其傳播途徑主要是子實體釋放的擔子孢子借由土壤、水或風進行遠距離傳播，遇到樹木根頸部或根部的傷口即行侵染；近距離傳播則是由林木根際之間的相互接觸，由病根上的菌絲體傳至健康株的根部，并繁殖形成新的侵染。靈芝根腐病的發生不是突發性的，而是經過侵染2～3 a甚至5～6 a后，才逐漸表現出癥狀。在鳳凰木的靈芝根腐病發病初期，林木生長緩慢，樹冠稀疏，并呈現出黃化現象；待到病害中期，鳳凰木的生長幾乎停滯，葉片大量脫落，樹冠稀疏更加明顯，此時常能發現有白色菌絲或赤褐色的子實體生長在病株的地際部，或是在露出地表的根部，從病根的細根到粗根的表面都布滿了菌絲體，呈現為蜘蛛網狀、扇狀、氈狀等，且組織腐朽，材部組織也長有菌絲體；在靈芝根腐病的病害末期，立木會萎枯死亡，地際部的根長出許多子實體。另外也有可能是二孢假芝（Amauroderma subresinosum）造成的根腐病［3］。青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）是一種土傳植物病原細菌，會引發植物青枯病，被認為是植物上最具破壞性的病原細菌，可侵染250多個物種，包括番茄、馬鈴薯、煙草、香蕉、辣椒、茄子等在內的多種重要農作物，造成巨大的經濟損失［4］。由于施用復合微生物菌劑對真菌和細菌作用可能存在差異，為探明其抑菌效果，本文以復合微生物菌劑對靈芝菌和青枯雷爾氏菌開展離體試驗研究，觀察對比二者的抑菌和生防效果，以期制定防治方案，為有效防治植物的靈芝根腐病和青枯病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗所用的靈芝菌是通過采集鳳凰木上的靈芝菌子實體，經分離培養獲得；青枯雷爾氏菌購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心（https：//cgmcc.net）；云集合益植得寶復合微生物菌劑購買于廈門云創生物科技有限公司（https：//flbook.com.cn/c/9ndepkpPTe#page/ 16），含有紫紅曲霉（Monascus purpureus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等活菌。

1.1.1靈芝菌采集

2022年3月在廈門市集美區道路兩旁，從已露出地表的鳳凰木根腐病的病根（封三? 圖2）上采集靈芝菌子實體（封三? 圖3）。

1.1.2靈芝菌分離培養

1.1.2.1配置馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基

將去皮馬鈴薯200 g切成小塊，用600 mL蒸餾水大火煮開，小火煮約20 min，兩層紗布過濾，去渣，加入葡萄糖20 g、瓊脂17 g，加水定容至1 L，pH自然，高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min后，冷卻至60℃左右，每20 mL培養基中加入經0.22 μm過濾器過濾的50 mg/mL氨芐青霉素溶液20 μL。

1.1.2.2分離純化

先將成熟的靈芝菌子實體表面用70%酒精擦拭消毒，然后將其撕開，從內層解剖刀切取0.5 mm大小的內層幼嫩組織，置于PDA平板中心，在30℃黑暗條件下培養5～7 d，待擔孢子長出白色菌絲后，挑取單個擔孢子長出的生長旺盛健壯、無雜菌污染的菌落進行轉換培養，再不斷選優純化后保存。

1.1.2.3菌種保藏

將分離純化后的靈芝菌菌株液體培養基（不含瓊脂的PDA培養基）經搖床培養成菌絲球后，轉入2 mL凍存管，將液體培養基與滅菌后的甘油按12渦旋混勻，封口后貼標簽置于-20 ℃冰箱保藏。使用前在PDA培養基上活化備用。所有器材均為事先經高溫滅菌。

1.2離體培養

將靈芝菌（LZ1和LZ2菌株）和青枯雷爾氏菌分別置于PDA、胰蛋白胨蔗糖（SPA）培養基（液/固）上進行離體培養，待得到液態菌絲體后，再開展離體試驗觀測。其中SPA液體培養基：胰蛋白胨10 g，蔗糖20 g，K2HPO4? 0.5 g，MgSO4? 0.25 g，加水定容至1L，121℃高溫滅菌備用；另備各材料加水定容至1 L后加入15 g瓊脂，121℃高溫滅菌備用，則為SPA固體培養基。

1.3 抑制靈芝菌試驗

1.3.1培養基制備

稱取0.2 g復合微生物菌劑，直接加入100 mL

PDA培養基中，制成處理組培養基；以不加復合微生物菌劑的PDA培養基為對照組。每種處理3組重復（處理1、2、3）。

1.3.2抑菌處理

從生長狀況良好的靈芝菌菌株的菌落邊緣取直徑0.5 cm的菌餅，置于上述1.3.1制備的平板培養基中心位置。25℃黑暗培養4 d后，以十字交叉法測得菌落直徑［5］。計算靈芝菌抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.4 抑制青枯雷爾氏菌試驗

1.4.1培養基與菌液制備

在100 mL液體SPA 培養基中加入20 μL青枯雷爾氏菌菌株樣品，28℃，150 rpm，過夜培養。稱取0.2 g復合微生物菌劑，直接加入100 mL SPA液體培養基中備用。用移液槍吸取過夜培養菌液測量OD600值，再定容到OD600=1.000，并按照每700 mL 培養基加10 mL菌液的比例，加入融化后適溫（50℃左右）的SPA固體培養基，再倒入平板中，制成菌液混合SPA培養基。在已凝固的培養基上做打洞處理。

1.4.2菌餅培養與數據處理

對照組為空白SPA培養基孔洞中加入50 μL復合微生物菌劑；菌液處理組為菌液混合SPA培養基的孔洞中加入50 μL空白 SPA 液體培養基；復合微生物菌劑處理組為菌液混合SPA培養基孔洞中加入50 μL復合微生物菌劑，3組重復處理（處理1、2、3），每組處理中設置3個孔洞（孔洞1、2、3）。

經28℃黑暗培養3 d，十字交叉法測得菌落直

徑［6］。由于青枯菌的對比培養是在直徑9.00 cm的整個培養基中，所以根據抑菌圈占整個培養基的比例，計算青枯雷爾氏菌抑菌率（%）=抑菌圈直徑/培養基直徑×100%。

2結果與分析

2.1復合微生物菌劑對靈芝菌的抑菌效果

對比試驗處理可得，LZ1和LZ2在 PDA 培養基中生長狀態良好（封三? 圖5）。由表1可見，培養4 d后，LZ1和LZ2的抑菌圈平均直徑分別為0.50、0.67 cm，而對照組的抑菌圈平均直徑是4.13、

4.18 cm，求得復合微生物菌劑對靈芝菌的平均抑菌率為97.69%，生防效果好。

2.2復合微生物菌劑對青枯雷爾氏菌的抑制效果

經28℃黑暗培養3 d后，青枯雷爾氏菌在SPA培養基中生長狀態良好。復合微生物菌劑對于青枯菌的生長有一定抑制作用，其表現為在菌液混合培養基倒板中，孔洞周圍有一定的抑菌圈表現，且培養基顏色較淺。通過十字交叉法測得其抑菌圈平均直徑為2.50、2.70和2.90 cm（表2）。在對照處理組中，加入復合微生物菌劑處理的孔洞附近有一定的微生物生長情況，可能為復合微生物菌劑中有益菌生長產生（封三? 圖6）。

3 結論與討論

目前國內市場“以菌抑菌”在重大植物疾病防治上采用的是普通微生物菌劑，其多為單一菌種或復配菌種，因為抗逆性不強對環境適應性有限、與有害菌的競爭力不足等原因，而鮮有成功案例。復合微生物菌劑的應用能夠提高土壤微生物群落多樣性，增加OTU 數量和Chao1、Shannon指

數［7，8］，從而改善根際微生物區系減低病害發生程度。本試驗選用云集合益植得寶復合微生物菌劑分別對靈芝菌、青枯雷爾氏菌進行抑菌試驗，效果對比結果表明，對真菌類的鳳凰木根腐病靈芝菌有較好的抑菌效果，抑菌率在95.37%～100.00%，生防效果好，而對細菌類的青枯雷爾氏菌的抑菌作用差。

在此研究基礎上，后續將繼續開展盆栽試驗，評估復合微生物菌劑和有機肥聯合施用對土壤理化性質的影響，試圖探明土壤微生物群落對復合微生物菌劑的響應變化，尋求針對不同健康程度的鳳凰木靈芝根腐病解決方案，用于有效防治鳳凰木靈芝根腐病。

參考文獻：

［1］尹淑麗，張蕾，麻耀華. 復合微生態菌劑對連作黃瓜根際土壤微生物數量及酶活的影響研究//中國園藝學會全國設施園藝與園藝作物標準化生產技術交流會［C］ . 2014.

［2］單金雪，李增平，張宇，等. 一種木麻黃靈芝莖腐病病原鑒定及生物學特性［J］.熱帶生物學報. 2021，12（1）：88-95.

［3］蔡吉堂，林麗超，王開輝，等. 靈芝侵染鳳凰木根腐病研究初報［J］. 中國森林病蟲，2019，38（5）：28-31.

［4］吳如慧，李增平，程樂樂，等.臺灣相思假芝根腐病病原菌的鑒定及其生物學特性測定［J］.熱帶作物學報. 2019，40（8）： 1590-1597.

［5］張陽，劉重喜，王相晶，等. 微生物代謝產物在植物病害防治中的應用［J］. 世界農藥，2013，35（3）：34-40.

［6］王志丹，王樹桐，胡同樂，等. 柑橘青枯病的發生規律及防治措施［J］. 河北果樹，2018（1）：17-19.

［7］張志良，孔麗麗，王鵬. 微生物肥料的研究進展及其應用現狀［J］. 土壤通報，2019，50（4）：997-1003.

［8］王立華，王建玲，曾祥英. 微生物肥料的作用機制及應用現狀研究進展［J］. 安徽農業科學，2020，48（9）：17-21.

（責任編輯：許? ? 玲）