不同抗性青稞材料接種大麥黃矮病毒后防御酶活性變化研究

羊海珍，頓珠加布，旺 姆，巴桑玉珍*

(1.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏拉薩850032；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，西藏拉薩850032)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)是藏族人民糧食和畜牧飼料的主要來源，在高原農(nóng)牧業(yè)中一直占據(jù)舉足輕重的地位[1]。大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus，BYDV)是世界范圍內(nèi)分布最廣泛、危害最大的禾本科作物病毒之一，由特定的蚜蟲傳播[2]。作物感染BYDV后，通常表現(xiàn)出矮化、葉片退綠等癥狀，導(dǎo)致減產(chǎn)，嚴(yán)重情況下甚至?xí)^收[3]。近年來，黃矮病在西藏多個青稞種植區(qū)均有報道[4]，部分地區(qū)危害嚴(yán)重，制約了青稞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

植物受到病原物侵染后，防御酶會催化一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)。很多研究表明，SOD、POD、CAT 、PPO、PAL等多種防御酶與植物的抗病原物侵染能力密切相關(guān)，其活性變化一定程度上可以反映寄主與病原的互作關(guān)系[5-9]。目前，對于青稞黃矮病抗病機制缺少系統(tǒng)研究，國內(nèi)外也鮮見BYDV影響青稞生理學(xué)的報道。鑒于此，筆者選用黃矮病抗性不同的2個青稞材料，測定接種BYDV后青稞葉片SOD、POD、CAT 、PPO、PAL的活性，分析其變化與青稞抗性之間的關(guān)系，為進一步揭示青稞抗黃矮病的生理生化機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試青稞材料為高抗黃矮病品系C280、高感品種康青3號。供試毒源為大麥黃矮病毒GAV株系，傳毒介體為麥長管蚜(Sitobionavenae)，由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所姚小波副研究員提供。

1.2 病毒接種供試青稞種子催芽后，在溫度21 ℃/18 ℃、光周期 16 h/8 h(晝/夜)的人工氣候室內(nèi)進行育苗。接種前用毛筆將無毒麥長管蚜接到感染BYDV-GAV的青稞病株上，飼毒72 h，獲得帶毒蚜蟲。待青稞苗生長至2～3葉期時，將帶毒蚜蟲轉(zhuǎn)接至供試植株的第2片葉子上，每株接種10頭蚜蟲，以不接蚜蟲植株作為對照。接種后每個盆分別罩上防蟲罩，傳毒7 d后噴灑吡蟲啉進行滅蚜。

1.3 酶活性測定于接種后第0、10、20、30和40天采集相同位置的青稞葉片，每個處理選取10株混合取樣，重復(fù)3次，液氮速凍后放入-80 ℃冰箱中保存，參照李合生等[10]的方法進行酶活性測定。SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)還原法測定，以抑制NBT光化學(xué)還原50%為1個酶活性單位(U)；POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定，以每分鐘OD470變化1為1個酶活單位；CAT活性采用紫外吸收法測定，以每分鐘OD240減少1為1個酶活單位；PPO 活性采用鄰苯二酚法測定，以1 min內(nèi)OD398變化0.001為1個酶活性單位；PAL活性采用苯丙氨酸法測定，以O(shè)D290變化0.01為1個酶活性單位。每個酶活性指標(biāo)重復(fù)測定3次，取其平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析采用 Microsoft Excel 2013軟件作圖；采用SPSS 20.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗性青稞材料SOD活性的變化由圖1可知，接種BYDV后，2個青稞材料葉片的SOD活性均顯著高于未接種對照。隨著接種后時間的延長，SOD活性總體均呈現(xiàn)上升趨勢，接種前期(0～20 d)的增加幅度明顯高于接種后期。抗病材料的酶活性在各時間段均高于感病材料，除接種10 d外，差異均達(dá)到了顯著水平。抗病材料和感病材料在接種40 d時，分別比接種前(0 d)增加了6.12和3.65倍，抗性材料的增加幅度明顯高于感病材料。

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：Different lowercases indicated significant differences at 0.05 level. 圖1 接種BYDV后青稞葉片SOD活性的變化 Fig.1 Changes of SOD activity in leaves of hulless barley inoculated with BYDV

2.2 不同抗性青稞材料POD活性的變化由圖2可知，接種處理的2個青稞材料的POD活性均顯著高于對照。接種BYDV后，抗病和感病材料葉片的POD活性均呈先升高后下降的趨勢，且峰值均出現(xiàn)在接種后10 d，此時酶活性分別是對照的2.46和1.75倍，抗病材料顯著高于感病材料。在隨后的10～40 d，抗病材料POD活性急劇下降，感病材料下降則相對平緩。

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：Different lowercases indicated significant differences at 0.05 level. 圖2 接種BYDV后青稞葉片POD活性的變化 Fig.2 Changes of POD activity in leaves of hulless barley inoculated with BYDV

2.3 不同抗性青稞材料CAT活性的變化由圖3可知，2個材料未接種處理下，各時期葉片CAT活性變化不大；接種BYDV后，CAT活性呈先升高后下降的趨勢。相比之下，抗病材料的CAT活性上升更為劇烈，在接種后20 d達(dá)到最大值，是對照的2.48倍。感病材料在接種前期CAT活性上升較為緩慢，峰值在第30天出現(xiàn)，晚于抗病材料。在各時間段，抗病材料的CAT活性均顯著高于感病材料。

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：Different lowercases indicated significant differences at 0.05 level. 圖3 接種BYDV后青稞葉片CAT活性的變化 Fig.3 Changes of CAT activity in leaves of hulless barley inoculated with BYDV

2.4 不同抗性青稞材料PAL活性的變化由圖4可知，與SOD活性變化趨勢相同，2個青稞材料的PAL活性呈現(xiàn)上升趨勢。接種前20 d，對照和接種處理的PAL活性均迅速上升，之后對照變化趨于平緩，接種處理則持續(xù)上升。抗病材料在各時間段的PAL活性均顯著高于感病材料，試驗期間抗病材料的PAL活性增加幅度高于感病材料，40 d時分別比接種前增加了1.22和0.91倍。

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：Different lowercases indicated significant differences at 0.05 level. 圖4 接種BYDV后青稞葉片PAL活性的變化 Fig.4 Changes of PAL activity in leaves of hulless barley inoculated with BYDV

2.5 不同抗性青稞材料PPO活性的變化由圖5可知，接種處理的PPO活性在各時間段均顯著高于對照處理。接種BYDV后，抗病材料PPO的活性急劇上升，10 d達(dá)到最大值，此時活性顯著高于感病材料，為對照的1.85倍，之后逐漸下降。感病材料峰值出現(xiàn)的時間(20 d)晚于抗病材料，且升高幅度小于抗性材料，但接種后期PPO活性與抗病材料無顯著差異。

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：Different lowercases indicated significant differences at 0.05 level.圖5 接種BYDV后青稞葉片PPO活性的變化 Fig.5 Changes of PPO activity in leaves of hulless barley inoculated with BYDV

3 結(jié)論與討論

植物遭受病原物侵染后，會富集大量的活性氧，引起細(xì)胞代謝功能異常[11]。SOD、CAT、POD是植物體內(nèi)關(guān)鍵的活性氧清除酶，對保護自身免受活性氧和自由基的傷害有著重要作用[12]。該研究結(jié)果顯示，無論是青稞抗病材料還是感病材料，在受BYDV侵染后，SOD、CAT、POD共3種防御酶的活性較不接種對照均有明顯提高，但抗病和感病材料對BYDV的反應(yīng)存在差異。SOD活性呈持續(xù)上升趨勢，抗病材料增加幅度高于抗病材料；POD、CAT活性則先上升后下降，活性峰值均顯著高于抗病材料。綜合考慮各時間點活性差異、峰值出現(xiàn)時間，3種活性氧清除酶中，CAT活性在抗、感材料中的差異最大，猜測CAT在抗性材料C280的自身保護系統(tǒng)中發(fā)揮了更重要的作用。

PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，能將苯丙氨酸脫氨基最終轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素[13]。當(dāng)病原物入侵時，PAL活性增加，產(chǎn)生的木質(zhì)素沉積在細(xì)胞壁周圍，阻礙病原物的進一步擴散[14]。PPO能催化酚類物質(zhì)的氧化，促進醌類物質(zhì)的產(chǎn)生，從而抑制病蟲害的侵染[15]。該研究中，在BYDV脅迫下，青稞葉片中的PAL活性呈持續(xù)上升趨勢，表明寄主青稞與BYDV的抗?fàn)庍^程中，PAL持續(xù)發(fā)揮作用。PPO活性呈先上升后下降的趨勢，抗病材料PPO活性峰值出現(xiàn)時間早于感病材料，可能是由于抗病材料的酶促反應(yīng)速度較快，醌類物質(zhì)產(chǎn)生和積累較早，對病毒的擴散起到了較好的抑制作用。

綜上所述，大麥黃矮病毒侵染對不同抗性青稞材料葉片SOD、POD、CAT、PAL、PPO防御酶活性有顯著影響，不同抗性材料防御酶活性變化存在明顯差異，因此接種BYDV后SOD、POD、CAT、PAL、PPO活性的變化可作為反映青稞黃矮病抗性的生理指標(biāo)之一。