基于網絡藥理學和分子對接探討智腦膠囊改善阿爾茨海默病的作用機制

余郭芳，田麗偉，趙晨玲，吳夢婷，楊文明，董婷*

(1.安徽中醫藥大學 第一臨床醫學院，安徽 合肥 230038;2.安徽中醫藥大學 第一附屬醫院，安徽合肥230031)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一類以記憶功能下降和認知受損為主要臨床特征的神經系統變性病，多發病于老年人[1]。有調查報道AD在60歲以上人群中發病率高達為2.22%[2]，已嚴重威脅老年人的生活質量。但時至今日，AD的發病機制尚未明確，化學藥物抗AD的效果仍不顯著，且不良反應多，因此研發安全有效的藥物刻不容緩。

安徽中醫藥大學第一附屬醫院以黨參、黃精、川芎、石菖蒲為主要藥材，研發了智腦膠囊[3]。君藥為黨參，起養血生津、榮養腦竅之效，臣藥為石菖蒲和黃精，行益精填髓、益智化痰之功，佐用川芎活血行氣，共湊補腎益髓、益智化瘀、健脾豁痰之效[4]。此復方抗AD作用在臨床及動物實驗中均已證實[5-6]。但智腦膠囊治療AD的作用機制在分子層面上缺乏系統的生物學分析，故本研究運用網絡藥理學進一步分析藥物與疾病的相互關系，對智腦膠囊治療AD的可能機理進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 篩選智腦膠囊有效成分和AD靶點

在TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數據庫中，以智腦膠囊中各單味中藥的名稱(黨參、川芎、黃精、石菖蒲) 為關鍵詞進行檢索，確定口服生物利用度( oral bioavailability，OB) ≥30% 和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為設置標準，在Uniprot數據庫(https://www.Uniprot.org/)幫助下，將篩選出的每種中藥有效成分和相對應的可能靶點進行修正，并轉換成標準的基因名，設置限定物種為人類，由此獲得了智腦膠囊活性成分靶點。

在TTD數據庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd.asp/)、OMIM數據庫(http://www.omim.org/)、GeneCards 數據庫(https://www.genecards.org/)中檢索“Alzheimer′s disease”，在獲得AD相關靶點數據后,再對每個靶位進行合并去重。

1.2 構建智腦膠囊與AD相關靶標的交集

為了深入研究智腦膠囊與AD之間的關系，本文采用Venny 2.1在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)獲取AD和智腦膠囊活性成分的交互靶標，最后運用軟件Cytoscape3.7.1制作中藥-活性成分-靶點網絡模型。

1.3 構架蛋白質-蛋白質相互作用網絡

導入AD的潛在作用靶點至STRING (https://string-db. org/)數據庫，定義物種為人類，獲取蛋白與蛋白之間的交互信息，接著把獲得的數據導入軟件 Cytoscape3.7.1，繪制蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡圖。最后通過CytoNCA 插件分析度數中心性(degree centrality，DC)、間隔中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)等內容，根據多次中位數篩選獲得核心基因。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析

運用 Metascape數據庫(https://metascape.org)對交集基因實施 GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes )富集分析?；蚬δ芊謩e從細胞組成(cell composition，CC)，生物過程(biological process，BP)和分子功能(molecular function，MF)等多個層面進行注釋。過濾條件為P<0.05，輸出分析結果。然后借用微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)將結果可視化處理，并繪制相應的條形圖與氣泡圖。

1.5 分子對接

為檢驗上述分析結果的準確性，利用分子對接計算出1.2節得到的智腦膠囊關鍵活性成分與AD認知障礙的核心靶點之間的結合能，評價其結合活性。首先選取度值前3的核心靶點，找到其對應的關鍵成分，再在TCMSP數據庫中下載關鍵成分的小分子配體文件，使用AutoDockTools 1.5.6加氫處理后輸出為pdbqt格式。大分子受體文件首先在Uniprot數據庫中搜尋核心靶點，經已驗證及人類物種篩選后，復制核心靶點的基因ID，利用基因ID在PDB數據庫中下載對應的大分子，輸出為pdb格式，同樣使用軟件AutoDockTools 1.5.6進行脫水加氫處理，以pdbqt格式輸出。將配體受體文件經利用 Autodock Vina進行對接，計算各靶點之間的結合能，最后利用Pymol 2.4.2軟件將結果可視化分析。

2 結果與分析

2.1 收集智腦膠囊有效成分及靶點

通過TCMSP數據庫的收集篩選并結合文獻數據，去重整理后共得到智腦膠囊活性成分24個，主要活性成分見表1，全表見OSID科學數據與內容附表1。其中黨參10個，黃精6個，石菖蒲4個，川芎3個，川芎與石菖蒲共同成分1個。

表1 智腦膠囊主要活性成分信息Table 1 Information on the active ingredients of Zhinao Capsules

2.2 中藥-活性成分-靶點網絡圖

將智腦膠囊的有效成分和藥物基因靶點導入Cytoscape3.7.1軟件中繪制中藥-有效成分-靶點網絡結構圖，見OSID科學數據與內容附圖1。

該圖由198個節點、315個邊組成，其中包括有效成分24個，靶點170個。平均單個節點作用1.5個靶點，單個有效成分對應7個靶點。這也揭示了智腦膠囊治療的AD是采用多成分、多靶點、多路徑方法來發揮作用的。用CytoNCA 插件對該網絡圖進行拓撲分析后，選取DC值最高的的木犀草素、山奈酚、黃芩苷，表明這些有效活性成分可能為智腦膠囊關鍵成分。

2.3 預測智腦膠囊治療AD的靶點

以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞在OMIM、GeneCards 、TTD等數據庫中分別檢索到相關靶點1 329個、 1 735個、1 844個，去重后取其交集基因，得到

疾病基因靶點共645個，最后利用維恩圖，如圖1所示，將上述疾病基因靶點與藥物靶點進行匹配，最終獲得交集靶點58個。

圖1 疾病與藥物交集靶點圖Fig.1 Matching target between disease and drug

2.4 PPI網絡圖的構建

將篩選出的58個AD基因靶點和智腦膠囊藥物靶點導入STRING數據庫進行PPI分析，選擇人類為研究物種，設置最低置信區間<0.9，并把無關聯的游離點隱藏起來，繪制出靶蛋白的PPI網絡圖，最后導入Cytoscape3.7.1可視化處理，見OSID科學數據與內容附圖2，節點越大，顏色越深，代表其相關度越高，根據度值選取排名前3的靶點，分別為AKT1(degree=49)、IL-6(degree=47)、TNF(degree=46)。

2.5 智腦膠囊治療AD靶點的GO、KEGG富集分析

借助Metaspace數據庫，將共同靶點導入后進行生物通路過程分析，得到1 225條BP、65條CC、99條MF，KEGG富集分析得到174條目錄。以P值為篩選條件選取GO功能BP、CC、MF各前10條目錄。如OSID科學數據與內容附圖3所示，得出智腦膠囊生物功能主要涉及激素反應、氮化合物、磷酸化正調控、活性氧反應等，細胞組分以膜筏、膜小凹、突觸后膜、樹突等為主，分子功能涉及泛素樣蛋白連接酶結合和磷酸酶結合等。前20條的KEGG信號通路主要包含脂質與動脈硬化、TNF信號通路，見OSID科學數據與內容附圖4。

2.6 分子對接驗證

依據2.2和2.4結果，選擇度值前三的智腦膠囊關鍵有效成分木犀草素、山奈酚、黃芩苷以及靶點AKT1、IL-6、TNF，運用Autodock Vina軟件將其分別進行對接，計算結合能，得到TNF與山奈酚、黃芩苷、木犀草素分別為-8.0、-7.3、-7.1 kcal/mol(1 cal=4.186 J)，AKT1與山奈酚、黃芩苷、木犀草素分別為-5.5、-6.7、-6.0 kcal/mol，IL-6與山奈酚、黃芩苷、木犀草素分別為-6.1、-6.2、-6.3 kcal/mol,見表2。選取結合能前三的山奈酚與TNF、黃芩苷與TNF、木犀草素與TNF利用Pymol軟件將其結合位點進一步可視化分析，結果見圖2。

表2 關鍵活性成分與核心靶點的結合能Table 2 Binding energy of key active ingredients to core targets

圖2 關鍵成分與核心靶點分子對接圖Fig.6 Docking diagram of key ingredients and core target molecules

3 討論

AD被認為屬于中醫 “呆病”“健忘”等疾病范疇。《素問》云“腎封藏之本，精之處也”?！秱摗酚涊d“……本有久瘀血，故令善忘”。朱丹溪提出“健忘……多亦有痰”。故中醫以為“腎精虧虛，髓減腦消”是該病病機基礎，“痰瘀互結”是病機關鍵。智腦膠囊作為本院內制劑，善于填精益髓的同時兼備豁痰化瘀。臨床用于改善患者記憶功能[7]，動物實驗亦證明智腦膠囊通過調控膽堿能通路[8]、下調淀粉APP mRNA的表達來改善小鼠記憶功能[9]。

淀粉樣蛋白(Amyloid-β , Aβ)可以激活神經膠質細胞釋放大量炎性細胞因子和毒性介質形成神經炎癥，引起神經細胞死亡，這會進一步刺激加重AD患者腦內的炎癥反應，致使患者病情進一步加重。且有學者發現AD患者TNF-α和IL-6水平有明顯升高的趨勢[10]，抗炎也是西藥治療AD的重要手段。因此炎癥反應與AD發病機制密切相關。

(1)山奈酚、黃芩苷、木犀草素是智腦膠囊治療AD的關鍵有效成分

本研究發現山奈酚、黃芩苷、木犀草素與AD相關靶點作用最為密切，相關文獻證實其可以通過抗炎抗氧化等途徑來改善記憶功能[11-14]。黃芩苷通過促進Beclin1和微管結合蛋白1輕鏈3分子(LC3)的生成并減少淀粉肽的生成來發揮保護神經細胞的作用[11-13]。山奈酚可以增強NF-κB、磷酸化 p38 絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)等信號通路的表達，來實現抗炎抗氧化作用[15-17]。作為山奈酚同分異構體的木犀草素，同樣具備抗炎抗氧化作用，通過激活Akt信號表達，降低氧化應激水平，達到抗氧化作用[18-20]。因此，可以推測它們是智腦膠囊治療AD的關鍵有效成分。

(2)AKT1、IL-6、TNF為智腦膠囊治療AD的核心靶點

依據PPI網絡分析的結果， AKT1、IL-6、TNF可能是智腦膠囊治療AD的核心靶點。AKT作為蛋白激酶，AKT1是其中一種亞型，位于PI3k蛋白下游，具有調節細胞功能，抑制細胞凋亡等作用[21]。例如當AKT蛋白被激活時，促進下游NF-κB在細胞質中的表達，增強細胞存活[22]；還可以上調mTOR的表達來減少Aβ40的生成[23]；此外AKT還可以抑制GSK-3β的表達，繼而抑制Tau蛋白磷酸化，改善小鼠的記憶能力[24]。TNF分為TNF-α和TNF-β，和IL-6相似，同為促炎癥因子，可以誘導神經元的凋亡，上調淀粉樣前體蛋白( amy-loid protein precursor，APP)的表達[25]。因此抑制炎癥通路的表達可以提升一定的學習記憶能力，改善AD癥狀[26]。

(3)智腦膠囊治療AD的可能機制

GO功能富集分析，結果表明智腦膠囊通過激素反應、磷酸化調控和氧化應激等BP，泛素樣蛋白連接酶結合、細胞因子受體結合、磷酸酶結合等MF，神經細胞的膜筏、膜小凹、突觸后膜、樹突等CC治療AD。KEGG結果顯示智腦膠囊治療AD的核心通路涉及脂質與動脈硬化、TNF信號通路。APP通過α 分泌酶和β 分泌酶切割后形成Aβ淀粉樣蛋白，動物實驗證實脂質的降低可以上調分泌酶的表達，促進 Aβ的生成。動脈粥樣硬化則可引起腦部缺血，增加腦部淀粉樣蛋白的沉積以及神經炎癥因子的釋放。因此抑制脂質與動脈硬化通路的表達，可以減少Aβ的沉積、減輕神經炎癥，緩解認知障礙[27]。TNF信號通路誘導細胞凋亡并促進炎癥因子產生。智腦膠囊的關鍵成分山奈酚、木犀草素和黃芩苷均具有抗炎能力，由此推測智腦膠囊主要是通過調控TNF信號發揮抗炎作用，減輕神經炎癥反應，達到治療AD的效果。分子對接結果表明，TNF靶點對山奈酚、木犀草素和黃芩苷顯示出良好的結合能力。其中山奈酚結合能力更佳，結合能-8.0 kcal/mol。這恰好符合網絡藥理學的分析結果。

4 結語

本研究利用網絡藥理學方法和分子對接技術，對智腦膠囊治療AD的作用機理開展了初步探討。結果顯示，山奈酚、黃芩苷、木犀草素是智腦膠囊的關鍵有效成分，并作用核心靶點TNF，并通過脂質與動脈硬化和TNF信號通路抑制Aβ生成，減輕炎癥反應。這奠定了大智腦膠囊在臨床使用的理論依據,同時也為今后更進一步的實驗研究打下了基礎。