羅氏沼蝦3個不同群體線粒體COⅠ基因序列變異及遺傳多樣性分析

蔣 飛 ，戴習林

(1.上海市水產研究所，上海市水產技術推廣站，上海 200433；2.上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，農業部淡水水產種質資源重點實驗室，水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，上海 201306)

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)，俗稱泰國蝦或馬來西亞大蝦等，原產于東南亞、南亞和西太平洋島嶼，在我國有兩大主要產區，包括兩廣地區和江浙滬一帶。因其營養豐富、體型較大、生長速度快，抗病能力強，羅氏沼蝦已成為我國主要的淡水養殖蝦類[1]。雖然人工育苗技術的突破和養殖技術的提升提高了羅氏沼蝦的養殖產量，但是近年來羅氏沼蝦的種質退化現象日益凸顯，影響了我國羅氏沼蝦養殖業的健康可持續發展。因此，需要開展不同地區羅氏沼蝦種群的遺傳多樣性分析，以更好地指導羅氏沼蝦養殖生產。

近年來，國內外關于羅氏沼蝦在細胞遺傳學、生化遺傳學以及分子遺傳學等方面的研究都已有報道[2-5]。線粒體脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)具有結構簡單、分子量小、呈母系遺傳、進化速度快等優點，在水產動物群體遺傳學和系統進化研究中已得到廣泛應用，其中COⅠ基因長度適宜、進化速率適中且遺傳信息量較大，也常被用于種群分析[6-8]。本實驗擬通過線粒體COⅠ基因序列分析，對上海選育群體(SC)、浙江養殖群體(ZJ)和泰國野生群體(TL)進行遺傳多樣性分析，以期在線粒體水平上了解羅氏沼蝦的遺傳背景，為羅氏沼蝦遺傳改良和可持續健康發展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

上海選育群體(SC)：2014年7月采自上海申漕特種水產開發公司養殖基地(上海漕涇鎮)。浙江養殖群體(ZJ)來源于2014年7月浙江南太湖種業有限公司。泰國野生群體(TL)采自2014年7月泰國天然水域中。

上海選育群體(SC)和浙江養殖群體(ZJ)各隨機采樣90尾，泰國野生群體(TL)隨機采樣雌、雄各15尾，所有樣本浸泡于無水乙醇中，帶回實驗室，-80℃保存備用。

1.2 基因組DNA提取并檢測

從3個羅氏沼蝦群體中分別隨機選取10個樣本，共計30個樣本，羅氏沼蝦基因組DNA的提取主要參考Moore D D等[9]的方法并稍作改進。采用蛋白酶K裂解液消化、酚-氯仿法抽提并純化DNA、-20℃無水乙醇沉淀的方法提取肌肉組織中的DNA，TE緩沖液稀釋后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 PCR擴增和序列測定

COⅠ基因片段擴增引物為COⅠ-F(5′-ATTGTCACTGCCCACGCATT-3′ )、COⅠ-R(5′-TGTTGGTAGAGGATCGGGTC-3′ )。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增產物經1.0% EB-瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證，結果符合測序要求，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化和測序。

1.4 數據處理與分析

將測得的序列用BioEdit 7.0.5.2進行序列比對，并輔以人工校對，去除兩端冗余序列；用DNSP 5.1軟件計算群體遺傳變異參數：單倍型數量(Number of haplotypes)、單倍型多樣性指數(Haplotype diversity index,Hd)、核苷酸多樣性指數(Nucleotide diversity index，π)和平均核苷酸差異數(Average number of nucleotide differences，K)；用Arlequin 3.1軟件統計分子多態性指數，并對群體遺傳變異進行分子方差分析(Analysis of molecular variance，AMOVA)和遺傳分化系數(Fixation index statistics，Fst)檢驗。用MEGA 5.0軟件中的Kimura雙參數模型計算各群體內和群體間遺傳距離，并基于遺傳距離構建群體間的分子系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 羅氏沼蝦線粒體COⅠ序列特征

對測得的序列采用BioEdit軟件進行比對分析，去除兩端多余序列，得到458 bp有效長度的序列，并對其進一步分析。在458 bp COⅠ基因序列中，共檢測到8個變異位點，并且全部單堿基突變，無堿基顛換，群體間的堿基差異較小。MEGA 5.0軟件分析顯示，所有樣本序列的A、T、C和G堿基含量的平均值分別為26.3%、28.1%、26.1%和19.6%，A+T的含量為54.4%，高于G+C的含量45.7%。3個羅氏沼蝦群體中共有4種單倍型，SC群體、ZJ群體和TL群體的基因型種類分別為1、2和3種。

2.2 羅氏沼蝦遺傳多樣性

對3個羅氏沼蝦群體的遺傳多樣性進行分析(表1)，結果顯示群體SC、ZJ和TL的單倍型多樣性指數(Hd)依次為0、0.356和0.733；核苷酸多樣性指數最高的是ZJ群體(π=0.005)，其次是TL群體(π=0.002)，SC群體最低(π=0)。對3個群體的遺傳多樣性進行Tajima′s D中性檢驗，結果范圍為0～1.337，3個群體Tajima′s D 的P值均大于0.05，差異不顯著，說明COⅠ基因序列核苷酸的變化符合中性突變假說。

2.3 羅氏沼蝦群體遺傳分化與遺傳距離

用Arlequin 3.1軟件進行AMOVA分析，3個羅氏沼蝦群體的遺傳變異結構和變異來源見表2。AMOVA的分析結果表明，在羅氏沼蝦3個群體的遺傳結構差異中，有74.5%遺傳差異來源于群體間，25.5%遺傳差異來源于群體內。群體間的遺傳變異明顯高于群體內的遺傳變異。

表2 3個羅氏沼蝦群體間和群體內的分子方差分析(AMOVA)

3個群體間的遺傳分化指數(Fst)和遺傳距離結果如表3所示，SC群體與TL群體遺傳分化指數最高(Fst=0.925)，其次是ZJ群體與TL群體(Fst=0.687)，SC群體與ZJ群體的遺傳分化指數最低(Fst=0.111)；SC群體與ZJ群體的遺傳距離較近，約為0.003，而與TL群體的遺傳距離較遠，約為0.013。

表3 3個羅氏沼蝦群體間遺傳分化指數和群體遺傳距離

2.4 基于COⅠ基因序列的羅氏沼蝦分子系統樹

根據COⅠ基因序列，從GenBank中下載與羅氏沼蝦同屬不同種的日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense，Mn)(登錄號：FM958077)作為外群，采用NJ法和UPMGA法構建系統進化樹。由圖1可知，2種方法構建的系統進化樹趨于一致，沼蝦屬的2個種聚為兩大支：日本沼蝦的遺傳距離與羅氏沼蝦3個群體均明顯偏遠，單獨聚為一支；SC群體與ZJ群體遺傳距離最近，首先聚在一起成為一小支，然后再與TL群體聚為另一支。

注：SC、ZJ、TL分別是來自上海、浙江、泰國的羅氏沼蝦；Mn為日本沼蝦。

3 討論

3.1 羅氏沼蝦線粒體COⅠ序列變異分析

線粒體DNA作為核外遺傳物質，普遍存在于真核細胞中，由于具有結構簡單、進化速度快、母系遺傳、變異性大、核苷酸替代率高等優點[8,10]，其已經成為物種鑒定、系統發育以及種群遺傳等研究中一種有效的分子標記[11]。mtDNA序列分析是DNA多態性分析技術中重要的方法之一，不論是群體還是個體，任何的遺傳變異或者多態都是DNA序列的差異，mtDNA序列分析可以檢測到堿基的插入、缺少和替換等變異信息，從而在分子水平上檢測個體、群體及種間的多態及遺傳差異[12]。COⅠ基因作為mtDNA的主要分子標記之一，適用于種、亞種及地理種群間的系統關系研究[13]。COⅠ序列在蝦類的分子系統學中被廣泛應用，如Carini G等[14]和 Vassilios K等[15]分別研究了澳洲沼蝦(M.australien)的遺傳結構和不同地理種群的歐洲龍蝦(Homarusgammarus)的系統進化關系。

本研究初步分析了3個羅氏沼蝦群體線粒體COⅠ序列的差異，共檢測出8個變異位點、4個單倍型。變異位點和單倍型數量少可能是由于各群體樣品檢測數量偏低或COⅠ基因序列無法將其很好地區分開。但是TL群體的單倍型數量(3個)分別高于SC群體(1個)和ZJ群體(2個)的單倍型數量，這至少可以說明浙江養殖群體和上海選育群體因長期的人工養殖和選育，導致其遺傳多樣性較野生群體有所降低。堿基組成分析表明，A+T的平均含量(54.4%)高于G+C的平均含量(45.7%)，這與許多研究者在其他蝦蟹類線粒體基因中檢測到的結果類似，如姜虎成等[16]研究發現，淮河水系日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)A+T的含量(59.0%)高于G+C含量(41.0%)；葛家春等[17]研究發現中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)G+C含量(37.6%)低于A+T的含量(62.4%)。

3.2 羅氏沼蝦的遺傳變異分析

當采用線粒體DNA研究群體遺傳多樣性時，核苷酸多樣性指數(π)和單倍型多樣性指數(Hd)均是衡量群體遺傳多樣性的2個重要指標[18]。有些群體通過變異積累了單倍型的多態性，而并不能積累核苷酸序列的多樣化[19]。本研究結果表明，TL群體的單倍型多樣性指數較高(Hd=0.733)，但其核苷酸多樣性指數(π=0.002)明顯偏低，說明TL群體可能是由少量個體擴增形成的一個小種群。SC群體和ZJ群體的Hd值和π值均較低，造成這一現象的主要原因可能是這兩個群體在長期人工養殖和選育過程中發生了遺傳漂變(Genetic drift)、近交(Inbreeding)或奠基者效應(Founder effect)[20-21]。

群體間遺傳分化系數(Fst)經常用于衡量群體間基因分化的程度[22]，Fst值的大小與群體遺傳分化水平符合正相關關系。在0～1的范圍內，Fst值為0～0.05屬于遺傳分化微弱；Fst值在0.05～0.15之間屬于中度遺傳分化；Fst值為0.15～0.25屬于高度遺傳分化；Fst值在0.25以上屬于極高度遺傳分化[23]。本研究中，SC群體與ZJ群體(Fst=0.111)屬于中度遺傳分化；SC群體與TL群體(Fst=0.925)、ZJ群體與TL群體(Fst=0.687)都屬于極高度遺傳分化，由此證明長期閉鎖選育和人工養殖對羅氏沼蝦的遺傳結構都產生了影響。

3.3 羅氏沼蝦群體間遺傳距離和系統發育分析

Hebert P D N等[24]曾經對動物界的11門13 320個物種的線粒體COⅠ基因進行序列比較分析，得出物種內的遺傳距離大部分小于0.010，很少有大于0.020的結論；本研究中，根據羅氏沼蝦3個不同群體的遺傳距離和系統進化樹可以看出，基于線粒體COⅠ基因序列的3個羅氏沼蝦群體間的種內遺傳距離為0.003～0.013，與其研究結果一致。SC群體與ZJ群體遺傳距離最小,為0.003，親緣關系較近。SC群體和ZJ群體與TL群體的遺傳距離分別為0.013和0.011，遺傳距離相對較大，親緣關系也較遠。基于遺傳距離構建的NJ和UPMGA系統進化樹趨于一致，SC群體首先與ZJ群體聚在一起成為一小支，然后再與TL群體聚為另一支，結果表明3個群體的遺傳距離進化關系與聚類關系類似。產生這樣結果的原因可能是SC群體和ZJ群體的遺傳背景相似，而與TL群體遺傳背景差異較大，亦或是SC群體、ZJ群體與TL群體存在養殖地理環境的差異。

鑒于本研究是從一個線粒體基因對羅氏沼蝦3個不同群體的遺傳多樣性進行評估，且樣本量有限，因此上述結果只可作初步參考，而后期有必要增加檢測樣本數量，同時將從其他多個線粒體基因并配合核DNA遺傳分析，以期得到更全面和客觀的結果。