金剛丸抗去卵巢大鼠骨質疏松癥血清代謝組學研究

常裕紳 朱亮亮 匡浩銘 院一蔚 葉子豐 鐘秀遠 陳小明 匡建軍

1. 湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208 2. 湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410006 3. 湖南中醫藥高等專科學校，湖南 株洲 412012

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是絕經后女性好發的一種代謝性骨病。卵巢功能衰退引起體內雌激素分泌減少，對整體代謝系統產生影響，其發病特點是骨吸收大于骨生成、骨微結構破壞、骨量減少、骨脆性增加[1]，使得絕經期女性發生骨折的概率大大增加，對生命健康帶來了嚴重影響。祖國醫學根據“腎主骨”理論辯證骨質疏松癥主要為腎虛精虧，臨床上常以補腎益精為治法?！敖饎偼琛弊钤缬涊d于金·劉完素《素問病機氣宜保命集》，由中藥肉蓯蓉、綿萆薢、菟絲子、杜仲和豬腰子煉制而成，是補腎強筋壯骨的經典名方。動物實驗[2]表明金剛丸通過提高雌激素水平調節骨代謝提高骨密度，降低炎性因子對絲裂原活化蛋白激酶信號通路的影響抑制骨破壞[3]，從而防治骨質疏松癥。然而金剛丸治療PMOP 的具體機制尚未明確，限制了其在臨床的進一步推廣與運用。

代謝組學通過分析微觀代謝物的變化繼而了解復雜疾病過程，廣泛用于評價治療效果和剖析天然產物的潛在機制[4]，因其全面、系統的分析特點與中醫的整體、辨證的觀念相契合，能為從中醫藥層面探索PMOP的防治提供新的思維和實踐。氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)是一種高適用性的代謝組學分析方法，穩定性好及分離率高，在復雜基質的分析方面具有明顯優勢[5]。本研究在前期金剛丸研究基礎上嘗試運用GC-MS技術探討金剛丸治療PMOP的代謝機制，以期將結果應用于后續的臨床研究中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗藥物：金剛丸(陜西天洋制藥有限責任公司生產，國藥準字：Z61020726，規格：6×9 g/袋/盒)；戊酸雌二醇片(法國DELPHARM Lille S.A.S．生產，進口藥品注冊證號H20080108；規格：1 mg×21片/盒)。

1.1.2主要儀器與試劑：顯微鏡(Motic BA210 T)；雙能X線骨密度儀(MEDILINK公司 MEDIX-90)；氣相色譜-質譜聯用分析儀(日本島津 REX2000)、毛細管氣象色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，北京譜合 HP-5 MS)；高速冷凍離心儀(湖南湘儀 H1650R)；生物樣品均質儀(中國杭州奧盛 Bioprep-24)。吡啶、甲氧胺鹽酸鹽(上海至吉生化科技有限公司)；BSTFA+1%TMCS(99∶1)(ThermoFisher公司)；甲醇、乙腈、丙酮、正庚烷(上?？泼鸦瘜W科技有限公司)，蒸餾水。

1.1.3實驗動物：39只成年未經產6月齡SD雌性大鼠，體重(280±30)g [購于湖南省中醫藥研究院實驗動物中心，許可證號：SCXK(湘)2019-0004]。飼養條件：(25±2)℃，相對濕度50 %～60 %，12 h光/12 h暗循環，標準營養顆粒飼料和飲水充足。本實驗得到湖南省中醫藥研究院動物實驗倫理委員會的批準，倫理號：2020-0065。

1.2 方法

1.2.1PMOP模型的建立：采用國內外公認的雌性大鼠 PMOP 模型[5]。將39只大鼠常規飼養一周適應環境，按隨機數字表法隨機分為3組，空白組(Blank，n=9)、假手術組(Sham，n= 9)、造模組(n=21)；除Blank組以外的30只大鼠進行手術處理，Blank組不做處理。術前注射10 %水合氯醛溶液麻醉(0.2 mL/100 g體質量)，無菌操作下摘除大鼠雙側卵巢，Sham 組則只切除卵巢附近等體積的脂肪，術后縫皮封口，連續3 d通過大腿部位肌注青霉素鈉預防傷口感染，每只大鼠5萬U/d。每組處死3只大鼠驗證模型。

1.2.2動物分組及給藥：造模成功后，將造模組剩下的18只大鼠再按隨機數字表法分為模型組(OVX，n=6)、金剛丸組(JGW，n=6)、戊酸雌二醇組(E2，n=6)。造模后1周開始給藥，參照標準的人與實驗大鼠等效劑量換算[6]，金剛丸水溶液含金剛丸生藥3.6 g/kg，濃度為0.36 g/mL，戊酸雌二醇水溶液含戊酸雌二醇生藥9 mg/kg，濃度為0.009 g/mL，灌胃給藥每日1次，其他三組(空白組、假手術組、模型組)則分別根據大鼠體質量灌胃同體積蒸餾水1 mL/100 g，每日1次，每周稱重。

1.2.3樣本的收集與制備：各組實驗大鼠給藥12周后取材，每只大鼠以10 %水合氯醛溶液麻醉后取腹主動脈血5 mL、腰椎椎體及右側股骨備用；代謝物提取[7]：取150 μL血清樣品解凍，加入甲醇、乙腈和丙酮的等比例混合溶液800 μL 渦旋1 min，震蕩混勻5 min，冰浴超聲10 min，離心10 min(10 000 r/min)，移液管吸取800 μL上清液于上樣瓶中，常溫下氮氣蒸發至干燥；樣品衍生化：加入75 μL 甲氧胺吡啶溶液混勻5 min，70 ℃條件下(300 r/min)震蕩 1 h 后，冷卻至室溫，加入BSTFA+1%TMCS溶液75 μL，室溫(300 r/min)震蕩1 h，加入150 μL終止溶劑正庚烷(含0.1 g/L二十二烷)，前處理完成后，取上清液于進樣管，進行GC-MS分析。

1.2.4H&E染色法觀察大鼠股骨組織結構：取大鼠右側股骨中段1 cm，刮出多余肌肉組織，用4 %多聚甲醛固定，10 % EDTA溶液脫鈣，切片置于二甲苯中，梯度乙醇脫水，骨組織塊浸蠟、包埋，冷卻后切片機切片，加熱燙平，60 ℃恒溫機烘干，二甲苯脫蠟，蘇木素伊紅染色10 min，每次蒸餾水沖洗，烘干后中性樹膠封片，顯微鏡觀察骨小梁結構。

1.2.5指標測定：通過雙能X線骨密度儀測定大鼠腰椎椎體BMD值。骨代謝指標ALP、OCN、TRAP 5b均采用ELISE法按照試劑盒說明書測定。血脂指標TC、TG、LDL-C、HDL-C均采用全自動生化分析儀按照試劑盒說明書測定。

1.2.6色譜、質譜條件：色譜條件：毛細管柱HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：270 ℃；升溫程序：初始85 ℃(持續5 min)，以 10 ℃/min 升至 300 ℃(持續 10 min)；進樣量2.0 μL(不分流)；載氣：99.99 %高純氦氣，流速為 1.0 mL/min；溶劑延遲 5 min。質譜條件：接口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度 150 ℃；電離方式：EI；電離能量 70 eV；電子倍增器電壓：1753 V；掃描方式：全掃描60～600 m/z。

1.3 數據處理與統計學分析

2 結果

2.1 H&E染色結果

與Blank組、Sham組相比，去卵巢后大鼠骨小梁出現明顯斷裂、形態模糊，骨髓腔間隙顯著增加，大量部位被脂肪細胞所代替，而金剛丸治療后的大鼠則觀察骨小梁結構明顯改善，且脂肪細胞重新被骨小梁所代替。見圖1。

圖1 各組大鼠骨組織形態結構(10×10)Fig.1 Morphological structure of bone tissue of rats in each group(10×10)

2.2 各組大鼠腰椎BMD、血清ALP、OCN、TRAP5b水平變化

Blank組、Sham組BMD水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與Sham組比較，OVX組BMD明顯降低(P<0.05)；與OVX組比較，JGW組和E2組BMD水平明顯升高(P<0.05)。與Sham組比較，OVX組ALP、OCN、TRAP5b水平升高(P<0.05或P<0.01)；與OVX組比較，JGW組和E2組血清中ALP、OCN、TRAP5b水平均降低(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

圖2 各組大鼠骨密度及骨代謝指標水平比較Fig.2 Comparison of BMD and bone metabolism index levels of rats in each group注: 與Sham組大鼠比較，#P>0. 05；與OVX組大鼠比較，*P<0. 05，**P<0. 01。

2.3 各組大鼠血脂水平變化

與Sham組比較，OVX組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低(P<0. 05)；與OVX組比較，JGW組和E2組血清中TC、TG、LDL-C水平均降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量比較Fig.3 Comparison of TC, TG, LDL-C, HDL-C contents in serum of rats in each group注: 與Sham組大鼠比較，#P>0. 05；與OVX組大鼠比較，*P<0. 05。

2.4 基于GC-MS的大鼠血清代謝組學檢測

通過GC-MS分析后展示各組大鼠血清樣本典型總離子流色譜圖(圖4)，利用NIST標準物質庫，鑒定出的大鼠內源性代謝產物主要分為氨基酸類、糖類、脂類及其他小分子代謝產物。綜合結果來觀察，各組大鼠代謝物輪廓基本類似，但代謝物水平之間差異較大。

圖4 各組大鼠血清總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of rat serum in each group注：A：空白組；B：假手術組；C：模型組；D：金剛丸組；E：戊酸雌二醇組；1：草酸；2：乳酸；3：R-3-羥基丁酸；4：尿素；5：脯氨酸；6：甘露糖；7：葡萄糖；8：半乳糖；9：肌醇；10：油酸；11：十八碳二烯酸；12：花生四烯酸；13：膽固醇。

2.5 主要代謝物分析

PCA是一種采用數據降維算法可在二維或多維空間反應樣本間總體分布。如圖5所示，在PCA分數圖中，基于樣本之間的相似性對樣本進行分組，可直觀的看到各組大鼠的代謝表型均有一定的區分。

圖5 各組大鼠血清PCA得分圖Fig.5 Serum PCA scores plot of rats in each group注：A：空白組；B：假手術組；C：模型組；D：金剛丸組；E：戊酸雌二醇組。

2.6 差異代謝生物標志物篩選及分析

將Sham組與OVX組大鼠的歸一化數據進行組間OPLS-DA，見圖6，可見Sham組與OVX組分離明顯，分別置于得分圖兩側，組間差異遠大于組內差異，說明該模型的區分程度較好，并以R2X=0.86，R2Y=0.999，Q2=0.996參數評判該模型質量較為可靠，見圖7。根據VIP(VIP>1.0)、P(P<0.05)且經t檢驗，最終篩選得到具有統計學意義的13個差異生物標志物。進一步比較，其中OVX組大鼠較Sham組有5個代謝物表達水平明顯上升，8個代謝物顯著下降。對比OVX組與JGW組，經金剛丸治療后的去卵巢大鼠體內5個代謝物表達上升，4個代謝物表達下降，4個變化不明顯，見表1。并通過熱圖比較Sham、OVX、JGW、E2各組差異代謝標志物的表達情況，見圖8。

圖6 Sham組與OVX組大鼠血清OPLS-DA得分圖Fig.6 OPLS-DA score plot of serum in Sham group and OVX group注：B：假手術組；C：模型組。

圖7 OPLS-DA模型的驗證圖Fig.7 OPLS-DA validation plot of model

圖8 各組大鼠的血清代謝物熱圖Fig.8 Heatmap representation of serum metabolites of rats in each group

2.7 代謝通路富集分析

將2.6中金剛丸干預后顯著差異代謝物的HMDB號進行代謝通路分析，發現impact > 0.03的5條代謝通路，見圖9及表2。

圖9 特異性生物標志物的代謝路徑影響值得分圖Fig.9 The metabolic pathway influence value of specific biomarkers

表2 金剛丸干預去卵巢模型大鼠血清代謝通路Table 2 Jingangwan intervenes serum metabolic pathways in ovariectomized rats

3 討論

PMOP是一種高轉換代謝型骨病。在骨重建過程中，骨代謝指標可及時反映骨轉換狀態[8]。ALP、OCN是由成骨細胞合成和分泌，與骨基質礦化密切相關。本研究結果顯示，模型組大鼠 ALP、OCN 較假手術組升高，可能是由于模型組大鼠骨代謝處于高轉換狀態，成骨細胞代謝活躍所致，而金剛丸大鼠血清 ALP 、OCN含量較模型組明顯降低，提示金剛丸有改善骨代謝作用；據有關研究[9]顯示，女性ALP、OCN在絕經期(50～59歲)顯著升高，與BMD呈負相關，這與本研究結果相符。TRACP5b是在破骨細胞中特定表達的酸性磷酸酶同功酶亞型，是一個具有特異性和高敏感度的骨吸收指標，研究結果顯示模型組較假手術組TRACP5b升高，提示骨吸收增強；金剛丸對TRACP5b有下調作用，說明金剛丸可通過影響TRACP5b抑制骨吸收。血清TC、TG、LDL-C、HDL-C均是評價心腦血管疾病的風險因素，同時也反應體內脂質代謝情況。模型組較假手術組TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，這可能由于大鼠去卵巢后雌激素分泌減少導致脂代謝紊亂；經金剛丸治療后，這些指標也得到明顯回調，說明金剛丸可改善骨質疏松大鼠的脂代謝過程，同時也印證了骨-脂代謝異常失衡與絕經后骨質疏松癥的發生關系密切[10]。

本次代謝組學研究發現了13個與PMOP有關的潛在代謝標志物。而在這些代謝物中，金剛丸組與模型組對比發現有9個代謝物發生了回調，可能通過花生四烯酸代謝、肌醇磷酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝和半乳糖代謝發揮作用?；ㄉ南┧?arachidonic acid，AA)在人體內由油酸轉化而來，其參與合成物質具有多重生物活性[11]，游離的AA先后在環加氧酶和前列腺素合成酶的酶促代謝作用下可形成前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，大量的研究[12]表明PGE2對骨組織生長和骨折愈合以及預防骨質疏松有明顯促進作用。但有研究[13]認為PGE2并不能直接促進成骨細胞分化，而是通過激活感覺神經來維持骨代謝平衡狀態。本實驗中模型組較假手術組AA水平下降，而金剛丸組較模型組AA表達水平上升，由此可推測金剛丸可能在通過調節脂代謝(尤其是不飽和脂肪酸代謝)來影響骨代謝方面發揮了重要作用。

肌醇是一種維生素類似物，其作用是與各種細胞內信號轉導途徑調節包括骨細胞、神經細胞代謝在內的生物過程有關。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)信號通路與骨質疏松的發生關系緊密[14]，肌醇被脂質激酶磷酸化后的下游產物磷脂酰肌醇三磷酸是作為第二信使參與調控PI3K/Akt信號通路的。XI等[15]通過模擬骨質疏松癥的體內和體外實驗發現，PI3K/Akt細胞信號通路可以促成骨細胞增殖、分化和誘導骨形成。研究結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠血清中肌醇水平下調，提示大鼠去卵巢后可引起肌醇水平降低，而金剛丸組與模型組相比肌醇水平升高，由此可推測金剛丸防治PMOP，可能與肌醇磷酸代謝和PI3K/Akt信號通路的激活有關。

甘露糖、半乳糖、葡萄糖三種單糖都是機體所需的能量物質。半乳糖(galactose，GA)代謝幾乎發生在肝臟中，被機體吸收的GA經半乳糖激酶誘導后、在半乳糖-l-磷酸尿苷酰轉移酶介導作用下生成二磷酸尿甘半乳糖，再經過半乳糖-4表異構酶的表異構化，最后形成l-磷酸葡萄糖進入葡萄糖代謝[16]。在調節葡萄糖能量代謝的過程中，雌激素可多角度參與相關蛋白的表達，直接或間接影響葡萄糖轉運過程、糖酵解和氧化磷酸化反應[17]。有關研究[18]還發現雌激素對肝臟糖脂代謝具有保護作用。本研究中，當模型組雌激素水平下降時，半乳糖水平顯著升高，葡萄糖水平下降，表明GA轉變成l-磷酸葡萄糖的途徑受阻，導致半乳糖堆積，核因子κB信號通路及核因子κ B受體活化因子配體系統被GA轉換的晚期糖基化終末產物、活性氧和自由基等物質激活，直接導致炎癥反應和破骨細胞的活化[19]。金剛丸干預后可使大鼠體內異常的半乳糖含量回調到正常水平，由此推測這些代謝產物的的改變可能是金剛丸對PMOP的一種積極的保護或治療機制。從熱圖上還可發現模型組的(R)- 3-羥基丁酸和脯氨酸水平較假手術組下降，而金剛丸組較模型組均上升，差異具有統計學意義。氨基酸不僅是細胞信號分子，而且是基因表達和蛋白質磷酸化級聯反應的調節劑。研究表明[20]，在骨代謝方面氨基酸可以作為誘導骨形成和鈣的直接調節劑。

綜上所述，本研究采用GC-MS代謝組學技術進行分析，篩選出的13種代謝差異物可能作為診斷和治療PMOP的潛在生物標志物，并且初步探討了金剛丸改善PMOP可能與調節脂代謝、氨基酸代謝與糖代謝有關，為進一步指導臨床診治提供了一定的科學依據。