“脾腎相關”理論探討脂肪源性外泌體在老年性骨質疏松癥中的研究進展

秦威城 尚奇 張鵬 張學來 張志達 余翔 梁德 任輝 江曉兵* 沈耿楊*

1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫藥大學嶺南醫學研究中心，廣東 廣州 510405 3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院脊柱骨科，廣東 廣州 510405

老年性骨質疏松癥(senile osteoporosis，SOP)及其導致的嚴重并發癥，在全球醫療、公共衛生和經濟等領域產生重大的負面影響，因此如何有效地防治SOP是當今人口老齡化社會迫切需要解決的一個重要臨床科研課題。應用中醫藥治療SOP是一項我國獨具特色的治療方法，且目前基礎研究和臨床應用皆證實其治療SOP具有顯著的治療效果[1-2]。但是中醫藥防治SOP的具體機制不明確，這在一定程度上對于其在臨床上的運用會造成限制。

骨骼和脂肪在功能上相互聯系，這與中醫學“脾腎相關”理論相符[3]。最新研究表明，外泌體作為一種細胞外囊泡可攜帶多種生物活性分子，在“骨-脂肪 Crosstalk”(即骨與脂肪間存在交互作用的關系)中發揮關鍵調控作用。因此，本文基于脾腎相關理論對脂肪源性外泌體在SOP中的作用進行探討，以期為臨床防治SOP提供新思路。

1 中醫對“骨-脂”關系的認識

腎與骨的關系最早出現在《黃帝內經》，其謂：“腎之合，骨也”，這其中是以“肢節內合臟腑”作為理論依據進行闡述。同時，腎作為五臟六腑中的先天之本，具有儲存和封藏精氣的作用，主骨骼的生長和化生骨髓，說明腎與骨之間有著密不可分的關系[4]。機體面對年齡的增長，其生理狀態會呈現出對應的改變，《素問·上古天真論》對此進行明確的表述，實則揭示了人生長發育的自然規律。即骨骼依靠腎精的濡養得以生長發育，腎精的盈缺是骨健壯與否的關鍵。令骨骼獲得腎精的濡養則健壯，反之則髓減骨枯。因此，臨床中因為骨的病理變化導致的多種骨病，如骨痹、骨痿等，應首當責之于腎，辨證論治皆不離于腎。故此骨骼的固護，須依靠腎精的滋養[5]。

中醫學對脂肪相關內容進行記載的古籍可以追溯至《黃帝內經》，其中的津液學說和膏脂學說以“有膏、有脂、有肉”來描述人體的組成[6]。《禮記·內則》中對于膏脂的論述以“凝者為脂，釋者為膏”進行區分；明代張景岳在《類經》里也存在類似的評說，即膏脂二者起源相同，形態不同。清代張志聰對于《內經》的注解中提及，津液經由脾胃的運化，“溢于外則皮肉膏肥，余于內則膏盲豐滿”。結合中醫理論可知，膏脂，乃水谷精微經由脾胃中焦所化生而成，歸屬津精。

腎藏精，為臟腑陰陽之本，先、后天之精皆為腎所儲存及封藏。前者稟受于父母的生殖之精，后者是經由脾胃生化產生的水谷之精氣。即膏脂同樣為“后天之精”所化生，身為后天之精的脂肪對于骨的生長衰退同樣具有固護作用。目前鮮有人視脂肪為后天之精進行深入分析，本文將首次基于中醫角度探討脂肪與骨質疏松癥間的關系，以為將來提供新的研究思路及意義。

2 現代醫學對“骨-脂”關系的認識

在生命過程中，骨骼的形成需要經過建模和重建的過程。骨骼建模是骨骼根據生理狀況或所承受的機械力而改變形狀或大小的過程，與此同時伴行著骨骼重建，以維持骨骼的強度和礦物質的動態平衡[7]。骨穩態是由骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、成骨細胞、破骨細胞和脂肪細胞等細胞以及其所處的微環境構成。微環境中，成骨細胞[8]和破骨細胞[9]相互調控，協同控制骨量，這對于持續性維持骨量的穩定起著關鍵作用。骨形成和吸收的失衡所引起的骨穩態失調，進而會誘發一系列骨代謝相關疾病，如骨質硬化、骨質軟化和骨質疏松癥(osteoporosis，OP)等[10]。同樣來源于BMSCs的骨髓脂肪細胞可能影響骨形成和骨吸收維持的骨穩態平衡。脂肪細胞是人類骨髓中含量最豐富的細胞類型之一(15%～70%)[11]，骨髓脂肪細胞的數量和大小隨著年齡增長和骨丟失疾病的發生(如OP)而發生明顯的變化[12]。因此，越來越多的研究開始重視骨髓脂肪細胞在骨重建生理過程中的關鍵作用以及這些細胞與骨丟失疾病的相關性。

BMSCs作為一種共同的祖細胞，其嚴格控制的增殖分化機制在維持骨穩態中起著尤為關鍵的作用。由于BMSCs可分化為多種細胞類型[13]，所以其成骨和成脂分化失衡與病理性骨重建密切相關[14-16]。相關研究表明，在包括年齡在內的各種病理條件下，大多數骨丟失的過程皆存在骨髓脂肪增加[17-18]。

人體衰老過程中，由于BMSCs的成骨和成脂之間分化的平衡逐漸偏移，導致原本發生的骨丟失和某些病理過程將會伴隨著骨髓脂肪的增加[19]。然而，這種平衡改變的具體機制尚不清楚。基于當前的研究表明，對比年輕BMSCs，衰老型BMSCs的成骨分化程度明顯降低，證明衰老限制BMSCs在骨再生方面的潛力[20]。同時，BMSCs的衰老是一個動態的過程，伴隨著代謝、轉錄組的遺傳和表觀遺傳調控以及多條信號通路的功能變化[21-22]。Hu等[23]通過篩選年輕和衰老的人BMSCs的基因表達譜，發現核小體組裝蛋白1-樣蛋白2(NAP1L2)的表達上調與BMSCs衰老和成骨分化降低同時相關。隨著年齡的增長，活性氧和氧化應激增加將進一步通過Wnt和PPARγ途徑在老年性骨丟失和脂肪成骨分化中發揮重要作用[24-25]。PPARγ作為成脂分化的中心轉錄因子，能夠抑制成骨細胞分化。Suo等[26]證明了通過敲除RNA結合蛋白Musashi2(MSI2)以增加衰老型BMSCs中PPARγ的表達，能夠促進脂肪生成，抑制成骨。越來越多的證據表明，當促進BMSCs向成骨方向分化時，同時存在著BMSCs向成脂分化的減少。諸多因素嚴格調控著BMSCs的增殖分化，因此彼此間構成了一個復雜的網絡，以精確調節BMSCs。臨床和動物研究也同樣支持這一觀點，即骨髓脂肪的含量與骨量呈負相關[17,27-28]。促進脂肪生成的信號(如噻唑烷二酮[29]、地塞米松[30]和成纖維細胞生長因子-21[31])抑制成骨，而抑制脂肪生成的信號(如Wnt10b信號[32-33])促進成骨細胞分化。雖然BMSCs的互相調節可以解釋隨著年齡增加，脂肪的擴張和骨量的減少[17]，但所涉及的特定的作用和信號通路尚未被明確詮釋。

3 脂肪源性外泌體調控骨穩態在SOP中的作用

基于Wnt/β-catenin和PPARγ信號通路，BMSCs在向成脂或成骨分化的過程中二者互相拮抗。雖然骨量減少與骨髓腔內脂肪增多總是相伴出現，但是由于脂肪來源的間充質干細胞(ASCs)易于大量獲取和分離，并且它們具有很高的增殖分化能力，使得脂肪組織成為一種骨組織工程修復材料[34]。而且ASCs通過旁分泌作用釋放生物活性因子，可以促進骨組織血管生成和成骨細胞分化[35-36]。

外泌體作為胞外囊泡的一類，具有傳遞細胞信息、介導機制調控的功能。其中包含著豐富的蛋白質、DNA、RNA等基因遺傳物質，外泌體內含物的種類和數目由遺傳基因和所處的內環境雙方面決定，不同細胞分泌的外泌體之間的功能也隨之不同[37]。外泌體基于Wnt/β-catenin、RANKL等機制調控著骨穩態，對于BMSCs、成骨細胞、破骨細胞的增殖分化起著至關重要的作用。Wei等[38]發現過表達miR-424-5p的外泌體能夠通過WIF1/Wnt/β-catenin通路抑制BMSCs的成骨分化，提示miR-424-5P可能是治療OP的一個生物標志物。目前，運用外泌體治療OP逐漸引起人們的關注，并且已有學者對其進行探討和綜述[39-41]。進一步研究表明，脂肪間充質干細胞來源的外泌體(ASCs-exo)能促進人成骨細胞的增殖和成骨分化[42]。當用TNF-α預處理ASCs時，ASCs-exo中Wnt-3a的含量增加，并且抑制Wnt信號降低了在TNF-α預處理的ASCs條件培養液中成骨基因的表達水平。說明ASCs-exo特別是以TNF-α預處理的ASCs-exo為替代干細胞直接移植進行骨修復和再生提供了一條具有較大前景的途徑。而且ASCs-exo可拮抗缺氧加血清剝奪(H/SD)方法誘導的骨細胞凋亡和破骨細胞生成，提示了ASCs-exo具有治療SOP的潛力[43]。因此，ASCs-exo具有促進增殖和抑制凋亡等多種功能，在無細胞治療方面具有廣闊的應用前景。

ASCs-exo通過上調早期炎癥和增強血管生成，起著促進脂肪生成的作用，并增加膠原合成水平，在組織修復和再生中可能發揮關鍵作用[44]。Lv等[45]利用胞外miRNA轉運顆粒的天然可用性和生物相容性，通過電穿孔將miR-21-5p負載到ASCs-exo中。進而ASCs-exo在體外通過Wnt/β-catenin通路促進角質形成細胞的增殖和遷移，在體內通過促進再上皮化、膠原重塑、血管生成和血管成熟而促進糖尿病創面愈合。這項研究的結果將為應用ASCs-exo傳遞藥物物質和開發用于傷口愈合治療的無細胞療法奠定基礎。另一研究表明，ASCs-exo在轉基因小鼠源性阿爾茨海默病體外模型中具有調節作用，可以作為一種治療方式以防止淀粉樣β蛋白肽誘導的神經元死亡和阿爾茨海默病的進一步惡化[46]。同時，Rosanna等[47]發現ASCs來源的外泌體mRNAs和miRNAs可顯著促進體外培養的神經突起生長，這可能是以后干預神經修復中的一個有用輔助手段。然而脂肪源性外泌體調控骨穩態的具體機制尚未被闡明，值得進一步探討。

4 脂肪源性外泌體調控骨穩態探討脾腎相關的機制

SOP屬中醫學“腰痛、痹病、骨痿”范疇，其病位在骨骼，同時與腎脾相關，病因病機多為腎虛、脾虛、血瘀。腎主骨生髓，為先天之本，脾主肌肉、充四肢，為后天之源，二者相互資生，穩定正常生理功能。隨著年齡的增長，人體五臟六腑功能開始逐漸衰退，外形可見骨枯肉削，其中脾腎虛損為SOP病機所在。在人體自然衰老過程，《素問·上古天真論篇》云：“五七，陽明脈衰……五八，腎氣衰”，可見五臟皆衰的產生首見于脾腎。說明SOP主要病機為脾腎不足，骨削肉減，髓空骨枯，骨肉不親。

脾主運化水谷精微，生化氣血以濡養機體，因此全身臟腑組織的濡養和能量來源，都依賴于脾胃中焦的水谷運化。隨著年齡的增長，人的脾胃功能開始衰退。脾主肌肉，若脾胃虛衰，則肌肉筋骨失去濡養。《脾胃論·脾胃勝衰論》指出：“脾病則下流乘腎……是為骨蝕”，說明脾氣虧虛，亦當損及腎。腎虛精虧，骨髓空虧，進一步加重SOP的發生發展。《醫經精義》中提及骨為腎之合，髓為腎精所生。腎-髓-骨關系密切，腎精充盈則髓充盈，髓充盈則骨強健。腎主骨生髓，為先天之本，與骨的生長發育密切不可分。若骨得髓養，則強健有力；若氣血無源，肌肉失養，亦見骨痿。人體老齡化導致的脾虛腎虧，使得先后天之精不足以濡養固護骨骼。

當前對于SOP脾腎虧虛證患者中外泌體的相關研究鮮有文獻報道。不過在其他疾病中，已有學者將脾腎虧虛證與外泌體間的關系進行探討及研究。比如，伍琴[48]在早發性卵巢功能不全腎虛血瘀證的患者中發現外泌體數量較正常組少，這證實外泌體可能與腎虛血瘀證的卵巢功能損傷相關。同時，在脾虛證的整體內環境下，外泌體中的細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)可通過調節PTEN/CD44信號通路，促進肝癌的增殖、自我更新和轉移[49]。因此，脾腎虧虛所導致的SOP與外泌體，二者同樣可能存在一定的關聯，值得進一步闡述。

骨髓脂肪與骨量的關系和ASCs-exo的促進骨形成作用，這兩個看似矛盾的聯系，恰好符合中醫脾腎相關理論。從骨的角度來看，先后天之精所帶來的功能與分子生物學的BMSCs和ASCs的功能相似。有學者認為，骨髓為中醫所指的先天之精，而脂肪為后天之精，在二者中起關鍵作用的當屬BMSCs和ASCs，且都具備發展成骨細胞的性質。隨著老年的到來，腎中精血漸虧，精虧髓減，先天不足，則后天失養。進一步導致脾虛難以運化，后天之精逐漸匱乏，使得先后天之精不足以濡養固護骨骼。隨之帶來的是ASCs的減少，ASCs-exo對于骨穩態中促進骨形成的成骨作用間接性降低，而機體骨骼內的成脂作用將相對增加。脾腎虧虛導致的一系列變化，會引起SOP的發病率增加。因此，基于ASCs-exo調控骨穩態的機制，將為脾腎相關理論的補腎健脾方防治SOP提供一個新的治療思路以及分子靶點。

綜上所述，面對人口老齡化所帶來的SOP患病率逐年增加的情況[50]，尋找安全、高效的療法值得進一步探索。雖然中醫和現代醫學的“骨-脂”關系存在差異，但卻有一定聯系性，中西醫理論的融合有助于深入了解SOP的發病機制。通過對SOP的發病機制結合中醫脾腎相關理念進行探討，為中醫藥補腎健脾方治療SOP的治療靶點提出新的理論。目前ASCs-exo調控骨穩態的機制還處于研究階段，仍然需要對其具體的機制進行驗證。