CircRNA_0001795及CircRNA_0048211在老年骨質疏松癥中的表達

張恒林 吳克弟 王聲威 劉景新

海南西部中心醫院骨科，海南 儋州 571799

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種老年人常見的全身代謝性骨病，以骨量減少、骨微結構損壞、骨脆性增加和極易發生骨折為主要特征，已成為全球重大的公共健康問題[1]。探索一種早期診斷和篩查OP的可靠生物標志物對該病的防治具有重大意義。近年來研究[2-3]發現，環狀RNA(circular RNA, CircRNA)作為重要的分子調節因子，參與調控成骨細胞、破骨細胞和間充質干細胞的功能和分化，其突變、過表達或缺失與骨代謝疾病密切相關，有望成為OP的潛在標志物及治療靶點。有研究[4-5]指出，CircRNA_0001795及CircRNA_0048211在OP中存在異常表達，其通過調控基因表達和蛋白相互作用參與OP的發生和進展，可能為預測OP的發生及治療提供重要的信息。然而，關于CircRNA_0001795及CircRNA_0048211對老年OP診斷及其與骨密度(bone mineral density，BMD)的關系尚未明確。因此，本研究通過檢測老年OP患者血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211的表達情況，探討其對老年OP的診斷價值及其與BMD的關系，以期為老年OP患者的診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年12月在海南西部中心醫院進行體檢的老年人350名，男性152名，女性198名，年齡65～87(74.58±9.63)歲。納入標準：(1)年齡≥65歲，臨床資料完整；(2)生活能自理，全程配合本次研究。排除標準：(1)存在內分泌系統疾病、風濕免疫疾病、感染性疾病、血液病、惡性腫瘤以及嚴重心肺、肝腎、腦血管疾病者；(2)3個月內服用影響骨代謝藥物者；(3)妊娠期、哺乳期女性及精神障礙者。收集所有研究對象體檢時的年齡、體質量指數、白細胞計數(WBC)、血鈣 (Ca)、鎂(Mg)、磷(P)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、堿性磷酸酶(ALP)、空腹血糖(FBG)及甲狀旁腺素(PTH)水平等資料。本研究對象自愿參與并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1OP診斷標準：參考《原發性骨質疏松癥診療指南(2017)版》[6]，用T值來判定骨質疏松和骨量情況，T值=(骨密度測定值-同種族、同性別健康成人的骨峰值)/健康成人骨峰值的標準差。T值≤- 2.5為OP，- 2.5

1.2.2BMD測定：所有研究對象均在體檢時采用美國GE公司的雙能X線骨密度儀測定腰椎(L1～4)、股骨頸及全髖骨密度，單位為g/cm2，CV 值為1.0 %。

1.2.3CircRNA_0001795及CircRNA_0048211檢測：采集研究對象體檢時血標本3 mL，離心分離血清置于- 70 ℃冰箱保存待測。使用ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，PCR試劑相關試劑盒均購自上海吉凱基因化學技術有限公司，試劑批號:20170625。應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real time PCR, RT-PCR)技術檢測CircRNA_0001795(上游：5′-AGCTGTGCAATATGACTCG AGTA-3′，下游：5′-TACAGCTGACGAGTACAGTAG-3′)及CircRNA_0048211(上游：5′-AGTCTAGCCA TCTGATGAAGATA-3′，下游：5′-TACGGCATACAGC TGATCCTG-3′)水平，反應條件為：95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，共40個循環。以甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPADH)為內參基因，采用2-△△Ct法計算CircRNA_0001795及CircRNA_0048211水平。

1.2.4質量控制方法：BMD測定由同一組影像科醫師嚴格按照技術規范進行測量，實驗室指標檢測嚴格按照儀器操作規程和試劑盒說明書進行。資料收集過程進行審核和校對，最終由雙人雙錄入系統保存。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 研究對象基本情況

350名體檢者中骨量正常者占14.0%(49人)，骨量減少者占44.6%(156人)，OP者占41.4%(145人)。>80歲年齡段發生OP的人數較多，占62.1%(90/145)。見表1。

表1 研究對象基本情況 (n)Table 1 Basic information of the research objects (n)

2.2 各組臨床資料及指標比較

OP組年齡和PTH水平明顯高于骨量減少組和正常組，OP組BMD明顯低于骨量減少組和正常組，OP組和骨量減少組體質量指數明顯低于正常組，OP組和骨量減少組TC水平明顯高于正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)。各組間其他指標比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組臨床資料及指標比較Table 2 Comparison of clinical data and indicators in each

2.3 各組血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達水平比較

OP組血清CircRNA_0001795表達水平為0.31±0.08，明顯低于正常組2.28±0.96(t=16.814，P<0.001)和骨量減少組1.24±0.51(t=11.983，P<0.001)，而且骨量減少組明顯低于正常組(t=12.275，P<0.001)，差異均有統計學意義(F=20.613，P<0.001)；OP組血清CircRNA_0048211表達水平為0.26±0.05，明顯低于正常組1.63±0.58(t=13.907，P<0.001)和骨量減少組0.91±0.40(t=9.728，P<0.001)，而且骨量減少組明顯低于正常組(t=10.116，P<0.001)，差異均有統計學意義(F=17.950，P<0.001)。見圖1。

圖1 各組血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達水平比較Fig.1 Comparison of serum CircRNA_0001795 and CircRNA_0048211 expression levels in each group

2.4 多因素Logistic回歸分析老年OP發生的影響因素

以是否發生OP為因變量，將有統計學意義的因素為自變量，進行多因素Logistic回歸分析顯示，年齡(OR=1.684，95%CI：1.163～2.995)、PTH(OR=2.416，95%CI：1.702～5.883)、CircRNA_0001795(OR=3.108，95%CI：2.493～9.428)及CircRNA_0048211(OR=1.942，95%CI：1.335～4.117)是老年OP發生的影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析老年OP發生的影響因素Table 3 Multivariate logistic regression analysis of influence factor of OP in the Elderly

2.5 CircRNA_0001795及CircRNA_0048211對老年OP的診斷價值

以正常組作為對照組，CircRNA_0001795為0.85及CircRNA_0048211為0.68時，其診斷OP的曲線下面積(AUC)均大于0.800，二者聯合診斷老年OP的AUC最大(0.918，95%CI：0.857～0.977)，其準確性為91.2%。見表4。

表4 CircRNA_0001795及CircRNA_0048211對老年OP的診斷價值Table 4 Diagnostic value of CircRNA_0001795 and CircRNA_0048211 for elderly OP

2.6 老年OP患者血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達水平與BMD的相關性分析

Pearson相關分析顯示，老年OP患者血清CircRNA_0001795表達水平與BMD呈正相關(r= 0.804，P<0.001)，CircRNA_0048211表達水平與BMD呈正相關(r= 0.775，P<0.001)。見圖2。

圖2 血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達水平與BMD的相關性Fig.2 Correlation between serum CircRNA_0001795, CircRNA_0048211 expression levels and BMD

3 討論

OP是一種全身性骨代謝異常的疾病，主要引起疼痛、骨折和脊柱變形等并發癥，嚴重威脅老年人的健康狀況和生活質量。OP早期的骨密度變化不大，其早期診斷存在困難。因此，迫切需要尋找新的生物標志物來早期發現OP。CircRNA是一類具有閉環結構的非編碼RNA成員，參與骨代謝的基因調控，并通過上調或下調相關基因表達，對破骨細胞、成骨細胞和骨髓間充質干細胞的分化、增生、遷移和凋亡產生影響，在OP調控中發揮重要作用[7-8]。越來越多的證據[9-10]證明，CircRNA不僅可調節成骨細胞的代謝，而且對破骨細胞的增殖、分化及凋亡等方面均起重要的調控作用，有望成為OP診斷及治療的潛在分子標志物。Liu等[11]研究發現，OP患者存在CircRNA的差異表達，其通過調控成骨細胞的相關基因和蛋白的表達，促進了骨髓間充質干細胞成骨分化，進而參與OP的發病機制。Chen等[12]研究表明，CircRNA_0048211可通過調控相關成骨分化基因的表達來參與骨代謝的過程，對骨的形成或吸收產生影響，是OP發生的潛在積極調節因子。

本研究的350名體檢者中發生OP者占41.4%，其中>80歲年齡段發生OP的人數較多，與付夢菲等[13]研究結果一致。高齡是發生OP的影響因素，可能是隨著年齡增長，骨重建功能減退，性激素缺乏導致骨吸收加速，骨量減少，進而更易發生OP。本研究OP組血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達水平均明顯低于骨量減少組和正常組，而且骨量減少組明顯低于正常組。說明CircRNA_0001795及CircRNA_0048211在老年OP患者中呈低表達，隨著BMD減少，CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達水平明顯下降，其可能通過促進骨量減少參與老年OP的發病過程。相關分析也顯示，CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達水平與BMD均呈正相關，進一步說明CircRNA_0001795及CircRNA_0048211能反映骨量變化狀況，其與老年OP的BMD減少密切相關，可能參與老年OP的發生發展。Zhi等[14]研究發現，CircRNA作為細胞信號和相關基因表達的重要調節因子，參與調控成骨細胞的代謝和破骨細胞的分化，在OP的發生和進展起著重要作用。Li等[15]研究表明，CircRNA通過調節成骨細胞、破骨細胞和骨髓基質細胞的生理和發育過程，參與了骨代謝及維持骨內穩態，對骨微環境的細胞分化、增殖、凋亡和自噬產生影響，從而調控OP的發生。

PTH是調節人體內鈣磷代謝的主要激素，通過影響其骨密度與骨質的微結構，提高對骨的分解及吸收作用，降低骨量，是老年OP發生的影響因素。李霞等[16]研究證實，高水平PTH可使破骨細胞的數目和活力增加從而使骨吸收強于骨形成，導致骨溶解，促進了OP的發生與進展，是導致OP發生的主要因素。本研究CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表達水平異常均對老年OP發生產生極大影響，其可能通過調節破骨細胞、成骨細胞和間充質干細胞影響骨代謝有關[17]。本研究中CircRNA_0001795及CircRNA_0048211對老年OP診斷均具有一定的價值，二者聯合診斷老年OP的AUC最大，其準確性最高。說明CircRNA_0001795及CircRNA_0048211聯合檢測對老年OP的診斷效能較高，可作為診斷老年OP的分子標志物。Xiang等[18]研究也表明，CircRNA在OP患者中呈低表達，對OP的診斷具有很大的價值，是一種有前途的無創性分子標志物。

綜上所述，血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211在老年OP患者中呈低表達，其與BMD密切相關，二者聯合檢測對老年OP診斷具有很好的價值，可作為診斷老年OP的分子標志物。但本研究為單中心的臨床研究，無法全面評估CircRNA在老年OP中的長期變化，未來仍需進一步的深入證實。