破骨細胞分化信號傳導及相關天然化合物的研究進展

屈澤超 王棟馮銘哲 高翔成 張波弓伊寧 孔令擘 閆亮

1.延安大學醫學院，陜西 延安 716099 2.西安交通大學附屬紅會醫院脊柱外科，陜西 西安 710054

骨穩態是通過破骨細胞(osteoclasts，OCs)介導的骨吸收與成骨細胞(osteoblasts，OBs)介導的骨形成來動態調節的，促使骨的各項指標及功能在生理范圍內保持平衡[1]。骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是最常見的骨骼疾病，是一種以骨密度降低，骨組織微結構破壞，導致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身代謝性骨病[2]。OP發病原因主要包括內分泌因素、遺傳及免疫因素、營養因素、性別及年齡因素、疾病及藥物因素、失用及環境因素等[3-4]，其中OCs分化異常是引起OP的關鍵病理基礎[5-6]。OCs是起源于造血干細胞的單核/巨噬細胞系，受多種激素和局部細胞因子調節分化，其中核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)與巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)是OCs分化的主要關鍵分子[7]。M-CSF在早期OCs前體細胞的存活和增殖中起著關鍵作用[8]。核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)屬于腫瘤壞死因子受體家族蛋白，表達于OCs前體、成熟OCs以及樹突狀細胞等表面[9]，其分化的關鍵步驟是OBs產生的RANKL與OCs前體細胞上受體RANK結合啟動下游級聯傳導信號，RANK的胞漿區募集并活化銜接蛋白腫瘤壞死因子受體相關蛋白6(tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF6)，激活的TRAF6觸發下游NF-κB、MAPKs、PI3K/AKT、鈣信號和活性氧等通路的活化[7,10-11]。這些信號通路最終導致OCs分化的主要轉錄因子NFATc1和c-Fos的表達并引起OCs分化相關基因，例如OCs相關受體(osteoclast-associated receptor，OSCAR)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrated resistant acid phosphatse，TRAP)、基質金屬肽酶-9(matrix metallopeptidase-9，MMP-9)、OCs刺激跨膜蛋白(osteoclast stimulatory transmembrane protein，OC-STAMP)、整合素β3(integrin β3)和組織蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)等的表達[12]。綜上所述，RANKL是誘導OCs分化的重要調控因子，其相關下游信號通路已成為調控OCs分化形成的潛在靶點，RANKL-RANK信號通路在OCs的形成和功能中起著關鍵作用。詳見圖1。

圖1 RANKL誘導破骨細胞的分化Fig.1 RANKL induced osteoclastogenesis

在過去20年中，用于治療OP的藥物主要有雙膦酸鹽(bisphosphonates，BPs)、雌激素補充療法(estrogen therapy，ET)、甲狀旁腺素類似物(parathyroid hormone analogue，PTHa)和狄諾塞麥等[13]。然而，近年來文獻報道長期使用這些藥物會引起一些不良反應，可能不適合作為口服藥物。BPs是目前臨床上治療OP的一線藥物，雖然總體評價較高，但長期使用后會出現急性期反應、胃腸道不適和眼部不適等，并在2003年首次提出使用BPs會引起頜骨壞死，同時會增加食管癌的患病率[14-15]。ET已成為治療OP的二線方案，總體上應用較安全，但長期使用也會出現雌激素依賴性腫瘤、血栓性疾病和致死性腦卒中等[16]。PTHa是治療絕經后骨質疏松癥的一種新方法，其不良反應主要為嗜睡和腰背四肢痛等，嚴重會引起骨腫瘤的產生[17]。狄諾塞麥是唯一獲批靶向作用于RANKL的拮抗藥，能抑制RANKL與其受體RANK的結合，減少OCs形成與活化，降低骨吸收，然而文獻報道長期使用會引起高鈣血癥，增加原發性惡性腫瘤風險，同時會出現下頜骨壞死或非典型性股骨骨折[18]。因此，尋找高效低毒的抗骨質疏松藥物具有重要的臨床意義和醫學價值。近年來，對于天然化合物的研究日益增加，天然化合物主要作用于RANKL誘導OCs分化下游相關通路，對于OCs的抑制作用還可能在于它們的抗炎和抗氧化特性能夠優化骨骼健康。本文旨在總結RANKL及其下游信號通路在OCs分化中的最新研究進展，為以RANKL為藥物靶點治療OP提供進一步的認識。此外，筆者將簡要介紹幾種天然化合物通過調節RANKL相關信號通路而抑制OCs分化及其對骨質疏松的預防作用。

1 RANKL介導的相關經典信號通路

1.1 RANKL/NF-κB信號通路

在RANKL激活下游信號通路的早期階段，NF-κB對OCs的分化起重要調控作用。Jimi等[19]研究表明NF-κB基因敲除的小鼠模型由于OCs形成受限而表現出嚴重的骨硬化病，證明NF-κB的活化是OCs形成所必需的細胞因子。NF-κB是一個二聚體轉錄因子家族，在靜息狀態下，NF-κB在細胞質中以p50/p65兩個亞單位的異源二聚體形式存在，并與抑制劑IκB結合形成復合物。IκB的磷酸化是NF-κB級聯激活的先決條件，它受IκB激酶(IKKs)復合物調控，IKKs復合物磷酸化IκB，使IκB蛋白酶體降解，從IκB中釋放出的活性NF-κB二聚體易位到細胞核內，并引起OCs分化特異性基因的轉錄與表達[20]。

1.2 RANKL/MAPK信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路也參與了多種細胞活性，如基因表達、有絲分裂、分化、增殖和轉化等。主要由3個激酶組成：細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)、氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)和p38-MAPK，均可被RANKL刺激活化。RANKL與OCs前體上受體RANK結合，激活MAPKs相關信號分子，進一步誘導轉錄因子NFATc1和AP-1等的表達，促進OCs分化[21]。p38-MAPK信號通路在OCs分化的早期階段尤為重要，它促進小眼球相關轉錄因子(micropthalmia-associated transcription factor，MITF)和TRAP的表達，驅動下游因子的激活[22-23]。

1.3 c-Src/PI3K/Akt信號通路

RANK-TRAF6復合物可以招募Src激酶家族進而誘導PI3K/Akt信號級聯的激活。c-Src激酶作為Src家族的一個成員，對OCs的分化形成和成熟OCs的骨吸收功能至關重要。c-Src刺激磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)，活化的PI3K I型可磷酸化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP3)。PIP3是許多細胞表面受體用來控制細胞有絲分裂、生長、存活和分化的“第二信使”，進一步招募絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，Akt)表達到質膜上。PI3K/Akt信號可靶向使Smad1/5和CBP(CREB結合蛋白)關聯，調節OBs中M-CSF的表達，刺激OCs分化[24-26]。Moon等[27]發現過表達Akt可以促進GSK3β的非活性形式形成和NFATc1的核定位，Akt可以通過激活 GSK3β/NFATc1信號軸誘導OCs的生成。Kawamura等[28]研究表明Akt1是OBs和OCs的關鍵調控因子，通過促進OBs和OCs的分化和存活來維持骨量和骨轉化。

1.4 Ca2+信號通路

Ca2+信號在OCs生成中對細胞增殖、分化、基因轉錄和骨吸收等多種功能具有重要意義[29]。RANKL誘導的鈣振蕩與OCs分化、骨基質吸收和凋亡等密切相關。在OCs形成的早期階段，RANKL會刺激磷脂酶Cγ(phospholipase Cγ，PLCγ)，活化的PLCγ在細胞質中產生1，4，5-三磷酸肌醇(1，4，5-triphosphate，IP3)。IP3通過誘導內質網存儲鈣的釋放，直接增加細胞內Ca2+水平，Ca2+通過store-operated Ca2+entry(SOCE)和瞬時受體電位通道流入，持續的鈣信號進而誘導NFATc1轉位到細胞核中，進一步上調靶基因和蛋白表達，促進OCs分化形成[30-31]。

1.5 ROS效應

正常機體代謝可以產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，是由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)內源性產生，或由線粒體電子傳遞鏈的副產物所產生[32]。ROS包含超氧陰離子自由基(O2·-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(-OH)和一氧化氮(NO)[33]。生理狀況下，ROS能調控細胞內環境穩態、信號轉導、促進免疫、細胞增殖等生理活動，與抗氧化劑處于動態平衡狀態。然而，過量的ROS通過降低抗氧化酶水平，阻止OBs分化和OCs形成而破壞骨。在OCs分化過程中，NADPH氧化酶1將電子從NADPH轉移到分子氧中而形成ROS[34]。ROS還可通過間接激活MAPK、PI3K和NF-κB的活化，驅動CTSK、MMP9、c-Fos和NFATc1等基因表達促進OCs的分化成熟。此外，Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1/核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應元件信號通路與氧化應激密切相關，是細胞內抗氧化應激機制之一，可通過增加抗氧化酶血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)和谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl cysteine synthetase catalytic subunit，GCLC)的表達，增加細胞內ROS的清除，抑制OCs的分化與吸收[35]。大量研究表明抗氧化治療可以有效挽救氧化應激誘導的骨丟失。

2 天然化合物

OP是一種系統性骨病，已成為我國面臨的重要公共衛生問題。雖然目前已有很多藥理產品用于治療骨質疏松癥，然而近年來發現很多藥物長期使用伴隨著不良反應。促使研究人員致力于對天然化合物的研究，以尋找有效抑制OCs的藥物。如表1所示，天然化合物通過調節RANKL介導的相關通路來抑制OCs分化抗骨質疏松的作用。

表1 12種天然化合物調節破骨細胞分化的分子結構、劑量、體外研究細胞系及其作用機制Table 1 The molecular structure, dose, cell lines and mechanism of 12 natural compounds on modulating osteoclast differentiation

2.1 天然化合物對NF-κB或MAPKs通路的調節作用

高良姜黃素(Galangin)是一種從傳統中藥中提取的生物黃酮，具有抗炎和抗氧化等生物活性。Li等[36]研究表明，在骨髓巨噬細胞(bone marrow macrophages，BMMs)向OCs分化過程中，高良姜黃素能抑制p38、ERK的磷酸化，降低NFATc1、c-Jun和c-Fos等下游因子的表達。鷹嘴豆芽素A(Biochanin A，BCA)是一種具有酚類結構的黃酮類化合物。Liao等[21]研究證明BCA通過抑制MAPK和NF-κB通路而下調NFATc1和c-Fos的表達，抑制OCs的分化及骨吸收功能。長春西汀(Vinpocetine，Vinp)是生物堿長春胺的衍生物，Vinp抑制RANKL誘導的OCs分化和F-actin的形成。此外，Vinp抑制OCs形成過程中NF-κB、MAPK和AKT信號通路的激活，降低下游特異性基因的表達。體內實驗表明，Vinp顯著降低OCs數量，減輕去卵巢誘導的骨丟失。Vinp可能成為一種潛在的預防和治療骨質疏松癥的藥物[37]。

2.2 天然化合物對Akt信號通路的調節作用

辛可寧(Cinchonine，CN)作為一種生物堿具有抗瘧疾、抗血小板和抗肥胖的作用。Jo等[38]研究表明CN抑制RANKL誘導的OCs分化和骨吸收，機制上CN抑制TRAF6介導的TAK1和AKT活性表達，引起NFATc1的下調。此外，CN能夠減輕LPS和卵巢切除誘導的小鼠骨溶解模型。這表明CN對于炎性骨丟失和絕經后骨質疏松癥具有治療潛力。蛇床內酯(Cnidium lactone)是一種有效的中草藥，能夠預防去卵巢誘導的大鼠骨丟失模型[46]。Liang等[39]在RANKL誘導RAW264.7細胞分化中發現，蛇床內酯能夠抑制TRAP陽性多核OCs的分化和骨吸收功能。機制上，蛇床內酯可降低p38和PI3K-Akt信號通路，進一步抑制c-Fos和NFATc1的表達。茴香腦(Anethole)作為20多種植物的主要活性成分，具有抗氧化、抗癌和麻醉等活性。Qu等[40]研究發現茴香腦通過阻斷ERK和AKT信號通路抑制OCs的分化和骨吸收作用。在骨溶解動物模型中，茴香腦可以防止雌激素缺乏引起的骨量損失具有骨保護作用。

2.3 天然化合物對Ca2+信號通路的調節作用

青蒿琥酯是青蒿素的一種半合成衍生物，廣泛用于瘧疾的臨床治療。在RAW264.7細胞培養分化中，Zeng等[41]發現青蒿琥酯呈劑量依賴性抑制LPS誘導的OCs形成，同時抑制OCs分化關鍵基因的表達。此外，青蒿琥酯顯著降低了LPS誘導的OCs分化過程中上游TLR4/TRAF6和下游PLCγ1-Ca2+-NFATc1信號通路的表達，對骨侵蝕具有潛在的作用。齊墩果酸乙酯(oleanolic acid acetate，OAA)作為一種從豇豆中分離出的三萜化合物，Kim等[42]研究發現OAA抑制LPS誘導的骨丟失。機制上OAA顯著降低RANKL刺激的BMMs中PLCγ2磷酸化、Ca2+振蕩和NFATc1的表達。結果表明OAA可通過PLCγ2-Ca2+-NFATc1信號通路抑制OCs生成，并在體內抑制炎癥性骨丟失。奇任醇(Kirenol，Kir)是一種抗風濕中草藥的二萜類化合物，Zou等[43]研究發現Kir通過抑制NFATc1的表達和核易位，降低了Ca2+振蕩和小窩蛋白-1而抑制OCs的生成和骨吸收。同時，在體內實驗中Kir通過減少OCs數量，降低Cav-1和NFATc1的表達，進一步減弱去卵巢誘導的骨質疏松癥。

2.4 天然化合物對ROS介導效應的調節作用

龍血素B(Loureirin B，LrB)是從血竭中分離出來的活性成分，廣泛用于治療氧化應激和免疫紊亂等疾病，是一種包含12種以上活性化合物的中國傳統草藥。Liu等[44]研究表明LrB可通過影響NFATc1易位、ROS活性和鈣振蕩，降低OCs特異性基因的表達，抑制OCs的分化和骨吸收功能。體內研究中LrB可減輕去卵巢誘導的骨質疏松。五味子甲素(Schisandrin A，Sch)是一種從中藥五味子中提取的聯苯環辛烯型木脂素，Ni等[34]研究表明，Sch可通過下調TRAF6/Nox1信號通路，增強Nrf2的表達，減少ROS的產生，抑制OCs分化及骨吸收功能。體內實驗表明，Sch通過作用于Nrf2抑制ROS的產生而減輕骨丟失，Nrf2信號通路可作為治療OCs相關疾病的一種新研究靶點。千層紙素A(Oroxylin A，OA)是一種從黃芩根中提取的黃酮類化合物，Xian等[45]體外研究表明OA可通過上調轉錄因子Nrf2介導的CAT、HO-1、GCLC等多種抗氧化酶，降低ROS產生，抑制OCs的分化減弱對羥基磷灰石的骨吸收作用。體內實驗結果顯示，OA對LPS介導的骨溶解模型具有保護作用。OA可能具有抗骨質疏松和骨溶解的潛在作用。

3 總結

破骨細胞分化異常是引起骨質疏松癥的主要病理原因，RANKL誘導的下游多個信號傳導通路是OCs分化的關鍵步驟，這些下游信號分子的功能異常將導致OCs分化異常及功能障礙。本文綜述了RANKL誘導OCs分化相關信號通路的最新研究進展，但目前對于破骨細胞分化的具體通路及分子機制還知之甚少，需要進一步研究。雖然目前臨床上已有很多抗骨質疏松的藥物，但長期使用會伴隨一些不良反應。因此，探索抗骨質疏松的天然化合物仍是目前研究的重點。如圖2示，天然化合物對OCs分化生物活性的影響及對于下游信號傳導的作用機制。天然化合物是探索新的候選藥物的良好來源，對于靶向破骨細胞分化的研究具有重要意義。然而，目前的研究主要依賴于體外與體內動物實驗研究，尚未發現有效的人體內試驗驗證，還需要進一步探索，期望在未來能夠有助于預防或治療骨溶解相關疾病。

圖2 天然化合物對于RANKL誘導破骨細胞分化信號通路的影響Fig.2 Effect of natural compounds on RANKL-mediated osteoclast differentiation signaling pathways