HPLC-ELSD 測定黃芪阿膠口服液中黃芪甲苷的含量

鄭 燕，湯麗昌，程妮婭

（北海市食品藥品檢驗所，廣西北海 536000）

黃芪阿膠口服液是以黃芪、阿膠、熟地黃、當歸、黨參和葡萄糖酸亞鐵為主要成分加工成的口服液，它具有改善營養性貧血的功效。黃芪阿膠口服液中黃芪為改善營養性貧血的主要功效來源，黃芪中主要成分是黃芪甲苷，黃芪甲苷的含量對于臨床用藥的安全性及其活性有較大的指導意義[1-2]。黃芪中黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為質量控制成分，其中黃芪甲苷含量指標低限是毛蕊異黃酮葡萄糖苷的4 倍[3]。因此，采用高效液相色譜法對黃芪阿膠口服液中含量較高的黃芪甲苷進行含量測定研究，可為黃芪阿膠口服液質量標準的完善及其相關產品的質量標準建立提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

3 批黃芪阿膠口服液，均為市售品（批號分別為20220602、20220102、20211102）。

1.2 試劑與儀器

黃芪甲苷對照品（批號：110781-201515，供實驗室檢驗用），中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；正丁醇為色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；氨水為分析純，西隴科學股份有限公司；水為超純水，密理博純水儀制備；0.45 μm 針筒式微孔濾膜過濾器，天津市科藝隆實驗設備有限公司。

1260II 高效液相色譜儀（配蒸發光檢測器），安捷倫科技有限公司；HH-6 恒溫數顯水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；XS205DU 萬分之一電子天平，梅特勒有限公司；CPX5800H-C 超聲波清洗儀，上海科導儀器有限公司；Simplicity 純水儀，美國密理博。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液制備

精密稱取黃芪甲苷對照品50.15 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 含有黃芪甲苷1.003 mg 的標準溶液，該溶液作為對照品儲備溶液，備用。

1.3.2 供試品溶液制備

取批號為20220602 的黃芪阿膠口服液10 支，取其內容物混合，精密量取20 mL 置于分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取4 次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2 次，每次30 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm 有機濾膜過濾，備用。

1.3.3 樣品含量測定

分別取對照品溶液逐級稀釋成系列濃度的溶液及3 批供試品溶液，采用高效液相色譜儀進行峰面積數據采集，以標準曲線對數方程計算含量。

1.3.4 色譜條件

Waters XBridge-C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（35 ∶65，V/V），等比例洗脫，流速為1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

1.3.5 檢測器條件

蒸發光散射檢測器；蒸發溫度：90 ℃；漂移管溫度：75 ℃；氣體流速：1.6 L·min-1。

1.3.6 方法學考察驗證

（1）線性關系考察試驗。吸取對照品溶液逐級稀釋成系列濃度的溶液，精密吸取對照品儲備溶液（黃芪甲苷質量濃度為1.015 mg·mL-1） 5 mL、2 mL，置100 mL 棕色容量瓶中，然后加甲醇并稀釋至刻度，精密吸取對照品溶液（黃芪甲苷質量濃度為1.015 mg·mL-1）5 mL、2 mL、1 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中，然后加甲醇并稀釋至刻度，制得0.020 06 mg·mL-1、0.050 15 mg·mL-1、0.100 30 mg·mL-1、0.200 60 mg·mL-1和0.501 50 mg·mL-1系列濃度標準待測液。按“1.3.4、1.3.5”優化得到的儀器條件，分別注入20 μL 對照品待測液，記錄峰面積。以峰面積（mV）為縱坐標，對照品濃度（mg·mL-1）為橫坐標，建立標準曲線對數方程，計算相關系數。

（2）精密度考察試驗。精密吸取（1）步驟下所得0.100 30 mg·mL-1的對照品溶液，按“1.3.4、1.3.5”項下優化得到的儀器條件，連續進樣6 針，分別測其峰面積，并計算RSD。

（3）穩定性考察試驗。取同一批號（批號：20220602）制備所得供試品溶液，按“1.3.4、1.3.5”項下的儀器條件，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h 和24 h 進樣20 μL，記錄黃芪甲苷峰面積，并計算RSD。

（4）重復性考察試驗。按照“1.3.2”項下，取同一批號（批號：20220602）平行制備供試品溶液6 份，按“1.3.4、1.3.5”項下的儀器條件進樣，記錄黃芪甲苷峰面積，并計算RSD。

（5）加標回收考察試驗。精密量取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL 黃芪甲苷對照品儲備溶液各3 份，氮氣吹干，分別精密加入混合后的樣品溶液（批號：20220602）各20 mL。按“1.3.2”項下的制樣方法制備，按“1.3.4、1.3.5”項下的儀器條件進樣，記錄黃芪甲苷峰面積，計算平均回收率及RSD。

2 結果與分析

2.1 色譜圖分析

取制備好的對照品溶液、樣品溶液分別注入液相色譜儀，在“1.3.4、1.3.5”條件下進樣分析，對照品色譜圖結果見圖1，供試品色譜圖結果見圖2。由供試品色譜圖結果可以看出，黃芪甲苷峰不受其他成分干擾，其分離度良好，分離度＞24，理論塔板數均＞12 000。

圖1 黃芪甲苷對照液色譜圖

圖2 供試品色譜圖

2.2 樣品含量測定

精密量取混合后的3 批樣品各20 mL，按“1.3.2”步驟的制樣方法制備供試品溶液，然后按“1.3.4、1.3.5”條件進行測定，將所測得的黃芪甲苷峰面積代入標準曲線回歸方程中，計算。各樣品黃芪甲苷含量見表1。

表1 黃芪甲苷含量測定結果表

2.3 方法學考察試驗結果

2.3.1 線性關系結果

對黃芪甲苷標準品的線性范圍進行考察，以峰面積Y（mV）的對數值與對照品待測液濃度X（mg·mL-1）的對數值進行線性回歸，得到回歸方程為lgY=4.29+1.77 lgX，相關系數r為0.999 6。結果表明，黃芪甲苷在0.020 06 ～0.501 50 mg·mL-1線性關系良好，標準曲線見圖3。

圖3 黃芪甲苷溶液標準曲線圖

2.3.2 精密度考察結果

精密吸取1.3.6（1）步驟下所得0.100 30 mg·mL-1的對照品溶液，按“1.3.4、1.3.5”項下優化得到的儀器條件，連續進樣針，記錄其峰面積為302.81、299.50、303.48、306.51、313.94 和312.60，計算峰面積RSD 為1.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性考察結果

取同一批號（批號：20220602）按照“1.3.2”制備供試品溶液，按“1.3.4、1.3.5”項下的儀器條件，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h 和24 h 進樣20 μL，含量測定結果為0.013 48 mg·mL-1、0.013 61 mg·mL-1、0.013 34 mg·mL-1、0.013 34 mg·mL-1、0.013 57 mg·mL-1、0.013 47 mg·mL-1和0.013 49 mg·mL-1，計算RSD 為0.8%，結果表明供試品在24 h 內穩定性良好。

2.3.4 重復性考察結果

按照“1.3.2”取同一批號（批號：20220602）平行制備供試品溶液6 份，按“1.3.4、1.3.5”項下的儀器條件進樣，含量測定結果為分別為0.013 52 mg·mL-1、0.013 60 mg·mL-1、0.013 71 mg·mL-1、0.013 34 mg·mL-1、0.013 16 mg·mL-1和0.013 76 mg·mL-1，計算RSD 為1.7%，結果表明此分析方法重復性良好。

2.3.5 加標回收考察結果

精密量取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL 黃芪甲苷對照品儲備溶液（1.015 mg·mL-1）各3 份，氮氣吹干，分別精密加入混合后的樣品溶液（批號：20220602）各20 mL。按“1.3.2”項下的制樣方法制備，按“1.3.4、1.3.5”項下的儀器條件進樣，每個樣品進兩針，記錄黃芪甲苷峰面積，計算平均回收率及RSD，結果見表2。結果表明，測定方法可靠、符合分析測試要求。

表2 黃芪阿膠口服液加標回收率測定結果

3 結論與討論

采用2020 版《中華人民共和國藥典》[3]方法測定黃芪阿膠口服液中黃芪甲苷發現，由于該產品是糖漿劑，含有大量蔗糖，受其影響即便優化色譜柱、流動相及流動相比例也無法實現目標成分與其他成分的有效分離。因此，采取正丁醇液萃取除去糖分及部分極性較強的其他成分[4-5]，優選合適的色譜柱、流動相及其比例，再次測定所得色譜峰型較好，且能和其他成分實現完全分離，所得色譜峰理論塔板數高。對蒸發光散射檢測器參數進行優化，結果顯示蒸發溫度為90 ℃、漂移管溫度為75 ℃時響應值最高。

本研究所采用的方法所用儀器較為常見，可普遍適用于各生產企業質控、產品檢驗等環節。本法分析時間較短，線性、精密度、重現性、穩定性均良好，回收率符合檢測要求，可為含黃芪甲苷保健食品的質量控制提供理論參考。