提高分光光度法測定乳粉亞硝酸鹽回收率的研究

屠生輝，姜顧倩妮，劉 鎮，曾金紅，傅春輝，錢圣楠

（紹興市食品藥品檢驗研究院，浙江紹興 312000）

亞硝酸鹽是一類含氮無機化合物的統稱，一般默認指亞硝酸鈉。亞硝酸鈉是一種顏色為白色或淡黃色，狀態為粉末或顆粒，易溶于水的物質，其外觀及滋味都與食鹽相似，主要在食品工業中作為發色劑和防腐劑使用。近年來，發生過幾起食用乳粉導致的亞硝酸鹽中毒的食品安全事件，成人攝入亞硝酸鹽0.3 ～0.5 g 即可引起中毒，3 g 能導致死亡。6 個月以內的嬰兒對亞硝酸鹽特別敏感，存在患上高鐵血紅蛋白癥的風險[1-2]。因此，乳粉中亞硝酸鹽含量的檢測已成為市場監督管理局每年監督抽檢的固定項目。

國家標準中乳粉亞硝酸鹽的檢測方法主要有離子色譜法和分光光度法，其中離色譜法檢測成本高，而分光光度法作為一種經典的檢測方法具有應用范圍廣的優勢，但是由于乳粉基質復雜，容易導致結果回收率偏低，影響檢測準確性。有研究表明，在乳粉中進行亞硝酸鹽加標實驗時，對回收率結果產生影響的因素主要是維生素C 含量以及乳粉基質本身的顏色干擾，維生素C含量越高，回收率越低；基質顏色越明顯，回收率也越低。因此，在測定過程中，作為本底的乳粉樣品要盡量選擇不含有維生素C，基質顏色干擾也要盡量的小，從而排除影響回收率測定的干擾因素[3]。另外，乳粉中的油脂和蛋白含量也會影響檢測液的澄清透明度，最終影響比色結果[4]。基于此，本文將進一步優化實驗操作過程，確定較優參數以提高分光光度法測定乳粉亞硝酸鹽的回收率。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

7230G 可見分光光度計（上海舜宇恒平）；ME204E/02 電子分析天平（梅特勒）；HH-4 水浴鍋（聚輝）。

1.2 材料與試劑

飽和硼砂溶液、乙酸，分析純；鹽酸，優級純；亞鐵氰化鉀溶液，106 g·L-1；對氨基苯磺酸溶液，4 g·L-1；鹽酸萘乙二胺溶液，2 g·L-1；乙酸鋅溶液，106 g·L-1。

標準品：1 000 μg·mL-1亞硝酸鹽標準溶液（偉業計量技術研究院）。

1.3 實驗方法

1.3.1 測定原理

沉淀蛋白質、除去脂肪后的乳粉試樣液中的亞硝酸鹽在弱酸性環境下，能與對氨基苯磺酸發生重氮化反應，而后與鹽酸萘乙二胺耦合成紫紅色的染料，根據吸光度在分光光度計下用外標法可測定亞硝酸鹽的含量。

1.3.2 測定方法

參照《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中的第二法分光光度法進行測定[5]，通過設置提取階段的變量因素（蛋白沉淀劑添加量、稱樣量），確定提高加標回收率的最優條件。

（1）取樣和稱量。將乳粉反復攪拌至充分混勻后，置于150 mL 具塞錐形瓶，稱取適量試樣，作空白管；稱取同空白管等量的試樣，再加0.4 mL 亞硝酸鹽標準溶液（100 μg·mL-1），作為加標實驗管，每組做平行樣。

（2）提取。先在上述裝有乳粉樣品的具塞錐形瓶中加入12.5 mL 的飽和硼砂溶液作為溶液中亞硝酸鹽的穩定劑，再加入150 mL 熱水（70 ℃左右），混合均勻，在沸水浴中加熱15 min，加熱后取出置于冷水浴中冷卻至室溫，轉移至200 mL 的容量瓶中，加入適量的亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入等量乙酸鋅溶液，搖勻，作為蛋白質沉淀劑組合溶液，加水至刻度線定容，搖勻。

（3）過濾。靜置30 min，用一次性滴管吸出上層脂肪，上清液用濾紙過濾，濾液備用（前30 mL 濾液棄去）。

（4）測定。移取40.00 mL 上述備用濾液于50 mL帶塞比色管中，再分別按0.2 mL 的等差梯度逐步吸取0 ～1.0 mL 的亞硝酸鈉標準使用液（200 μg·mL-1），按0.5 mL 的等差梯度逐步吸取1.0 ～2.5 mL 亞硝酸鈉標準使用液（相當于比色管中的待測液中含有0 μg、1.0 μg、2.0 μg、3.0 μg、4.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0 μg和12.5 μg 的亞硝酸鈉），作為標準管與試樣管。再分別加入2 mL 對氨基苯磺酸溶，混勻，靜置5 min 后，各加入1 mL 鹽酸萘乙二胺溶液，加水至50 mL 刻度線，充分混勻，靜置15 min。取1 cm 比色杯，以零管調節零點，在波長538 nm 下測定吸光度，繪制標準曲線進行比較測算。同時做試劑空白[6]。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白沉淀劑添加量對乳粉中亞硝酸鹽測定的加標回收率的影響

提取過程中分別加入4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL和10 mL的亞鐵氰化鉀溶液，充分搖勻后，再加入對應等量乙酸鋅溶液，以沉淀蛋白質，每組做平行實驗。如圖1 所示，吸光度和亞硝酸鹽含量的線性方程為y=0.022 9x+0.001 5，相關系數R2=0.999 8，線性范圍為0 ～12.5 μg，根據吸光度換算出測定液中亞硝酸鹽的含量。

圖1 蛋白沉淀劑實驗組亞硝酸鹽標準曲線

由表1 可知，在稱樣量量級相同的情況下，添加不同的蛋白沉淀劑量會影響加標回收率的測定結果。當蛋白沉淀劑的添加量小于8 mL 時，加標回收率隨著蛋白沉淀劑添加量的增加而增大；當蛋白沉淀劑的添加量大于8 mL 時，加標回收率隨著蛋白沉淀劑添加量的增加改變不明顯。因此，結合《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中分光光度法的蛋白沉淀劑添加量為5 mL，選擇蛋白沉淀劑最接近原標準的添加量（8 mL）為實驗添加量。

表1 蛋白沉淀劑添加量對檢測結果的影響

2.2 稱樣量對乳粉中亞硝酸鹽測定的加標回收率的影響

考慮到樣品顏色會干擾乳粉中亞硝酸鹽的測定，不同的稱樣量會產生不同濃度的顏色干擾情況，分別稱取3 g、4 g、5 g、6 g、7 g、8 g、9 g 和10 g 試樣作空白管；再分別對應稱取同空白管等量的試樣，再加0.4 mL 亞硝酸鹽標準溶液（100 μg·mL-1）作為加標實驗管，每組做平行樣。按2.1 中得出的每10 g樣品加入8 mL 蛋白沉淀劑溶液的比例，分別加入2.4 mL、3.2 mL、4.0 mL、4.8 mL、5.6 mL、6.4 mL、7.2 mL 和8.0 mL 標準中使用的蛋白沉淀劑溶液組合，搖勻，以沉淀蛋白質。如圖2 所示，吸光度和亞硝酸鹽含量的線性方程為y=0.015 7x+0.001，相關系數R2=0.999 9，線性范圍在0 ～12.5 μg，根據吸光度換算出測定液中亞硝酸鹽的含量。

圖2 稱樣量實驗組亞硝酸鹽標準曲線

由表2 可知，當蛋白沉淀劑添加量為每10 g 樣品加入8 mL 時，不同的乳粉稱樣量會影響加標回收率，乳粉亞硝酸鹽測定的加標回收率隨著稱樣量的增加而減少，當稱樣量為10 g 時，回收率降至61.32%。當稱樣量為5 g 時，加標實驗的回收率已滿足85%～105%的要求，當樣品量為3 g 時，加標實驗的回收率最為理想。

表2 稱樣量對檢測結果的影響

3 結論

根據《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中的第二法 分光光度法檢測乳粉中的亞硝酸鹽時，受乳粉基質中的維生素C、蛋白和油脂以及顏色等干擾，影響比色結果，從而影響實驗加標回收率。本文通過探索實驗稱量過程中的稱樣量和提取環節的蛋白沉淀劑添加量兩種變量因素，研究其對實驗測定結果準確性的影響。結果表明，每10 g 乳粉樣品稱樣量中各添加8 mL 蛋白沉淀劑組合溶液時，提取效率顯著提升，且當稱樣量≥3 g 時，稱樣量的減少可以有效降低乳粉中基質顏色對吸光度測定的影響，從而提高分光光度法測定乳粉中亞硝酸鹽的回收率。因此改變提取環節的蛋白沉淀劑的添加量以及樣品稱樣量可以有效提高乳粉中亞硝酸鹽測定的回收率。