單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)及其在動物繁殖中的應(yīng)用進(jìn)展

劉源壹，李昕俞，巴音那木拉，翠 芳，芒 來，杜 明*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動物遺傳育種與繁殖學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗動物疫病預(yù)防控制中心，赤峰 025550)

繁殖是所有生命都具備的生理現(xiàn)象[1-3]，指動物通過生殖活動產(chǎn)生后代[4]。動物繁殖能力是衡量動物生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)之一，在動物生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益中起主導(dǎo)地位[5]。在動物繁殖過程中，生殖細(xì)胞的動態(tài)變化和相關(guān)基因的表達(dá)對其起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)是指由細(xì)胞在某一特定的階段轉(zhuǎn)錄出來的全部產(chǎn)物，包括編碼RNA和非編碼RNA[6-8]。當(dāng)同一細(xì)胞位于不同的生命進(jìn)程及生長環(huán)境時(shí)，其基因的表達(dá)狀態(tài)也有所不同。這就導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄組研究的特殊之處，即存在時(shí)間和空間上的多維度差異，進(jìn)而促使基因間構(gòu)成龐大且復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)錄組信息的深入發(fā)掘?qū)蛘{(diào)控網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系的解讀至關(guān)重要。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(single cell RNA sequencing，scRNA-seq)是指在單個(gè)細(xì)胞水平對mRNA進(jìn)行高通量測序，其基于單細(xì)胞、高通量的特點(diǎn)，解決了對于細(xì)胞分子機(jī)制研究中常見的細(xì)胞異質(zhì)性、細(xì)胞量少而無法進(jìn)行常規(guī)高通量測序等問題[9-11]。隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究者開始將這一技術(shù)引入到動物繁殖的研究中，使得對生殖細(xì)胞的研究也逐漸深入。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以對不同生殖細(xì)胞進(jìn)行類型鑒定、群體分類以及各種關(guān)鍵基因及通路的篩選等，上述方法對深入研究動物繁殖機(jī)制，提高動物繁殖能力，增加動物生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益起到了重要作用。

1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展

1.1 發(fā)展歷史

在單細(xì)胞中對mRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行基于高通量測序且完全無偏倚的研究方法于2009年被Tang等[12]首次發(fā)表，這也是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的關(guān)鍵性開端。然而該技術(shù)存在只能對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組描繪的不足。為了進(jìn)一步提高測序方法的應(yīng)用范圍，Islam等[13]于2011年研發(fā)了單細(xì)胞標(biāo)記的反轉(zhuǎn)錄測序技術(shù)STRT-seq (single-cell tagged reverse transcription sequencing)。這是一種通量更高的方法，先將細(xì)胞分離到96孔板中，再利用鏈轉(zhuǎn)化原理給每個(gè)細(xì)胞加入具有特異性的條形碼，從而能夠大規(guī)模檢測各種混合細(xì)胞樣本。

2012年出現(xiàn)了一項(xiàng)具有里程碑意義的技術(shù)，由美國和瑞典的科學(xué)家共同開發(fā)的能夠從單細(xì)胞生成全長cDNA的測序方法Smart-seq(switching mechanism at 5′end of the RNA transcript)[14]，進(jìn)一步增加了轉(zhuǎn)錄本序列的覆蓋度。但這種方法的缺點(diǎn)是不能高效轉(zhuǎn)錄超過4 kb的序列，且具有轉(zhuǎn)錄本長度偏向性[15-16]。同一年，Hashimshony等[17]開發(fā)出了一種采用體外轉(zhuǎn)錄代替 PCR 達(dá)到擴(kuò)增目的的測序方法，即CEL-seq (cell expression by linear amplification and sequencing)。該方法采用線性擴(kuò)增構(gòu)建cDNA文庫雖然具有擴(kuò)增偏好的缺點(diǎn)，但是其測序結(jié)果更加準(zhǔn)確[18]。為了達(dá)到對許多不同單細(xì)胞進(jìn)行研究和多重分析的目的，此方法也添加了相應(yīng)的特異性標(biāo)簽。2013年，Picelli等[19]對Smart-seq技術(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步的改進(jìn)，開發(fā)出Smart-seq2并逐漸成為研究者們常用的測序方法之一。正是有了上述幾種標(biāo)志性測序方法的出現(xiàn)，又隨著無數(shù)研究者對方法進(jìn)行不斷的完善、發(fā)展和改進(jìn)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序逐漸實(shí)現(xiàn)了更高的通量，更廣泛的應(yīng)用，更自動化的操作以及更高的效率，逐漸成為當(dāng)下解決諸多生物學(xué)問題的有效方法之一。

1.2 發(fā)展趨勢

隨著第二代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)和第三代測序技術(shù)(third generation sequencing，TGS)的飛速發(fā)展，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究中不可或缺的有力工具[20-23]。測序數(shù)據(jù)能夠揭露出細(xì)胞群體的內(nèi)在異質(zhì)性，并隨著其在分離、標(biāo)記、通量和深度等方法上的進(jìn)步，以及人們對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的研究越來越系統(tǒng)，生物制藥和生物技術(shù)公司開發(fā)市場產(chǎn)品的規(guī)模將會持續(xù)增長。根據(jù)中研普華產(chǎn)業(yè)研究院的《2021—2026年全球及中國單細(xì)胞測序行業(yè)發(fā)展調(diào)研及投資前景分析報(bào)告》統(tǒng)計(jì)分析顯示(圖1)，全球市場應(yīng)用單細(xì)胞測序規(guī)模自2015年起呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，預(yù)計(jì)在2026年可以達(dá)到77.62億美元的應(yīng)用規(guī)模。

圖1 2015—2026年全球市場不同應(yīng)用單細(xì)胞測序規(guī)模對比

近年來，單細(xì)胞測序相關(guān)研究的文獻(xiàn)數(shù)量也呈指數(shù)式增長的趨勢，截止到2022年4月，在Pubmed中以“scRNA-seq”為檢索詞進(jìn)行文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)已發(fā)表超過2 500篇以上與單細(xì)胞測序相關(guān)的文獻(xiàn)(圖2)。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于如免疫系統(tǒng)，大腦、神經(jīng)系統(tǒng)，上皮組織，生殖發(fā)育，癌癥等相關(guān)的科研工作當(dāng)中。

圖2 2016—2022年單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表情況

2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序相關(guān)技術(shù)的比較

2.1 單細(xì)胞分離方法的比較

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序過程中首要的步驟即單細(xì)胞分離(表1)，其質(zhì)量的高低無疑關(guān)乎到后續(xù)的測序是否成功。常用方法包括：1)口吸管技術(shù)[24]：通過人工方法利用安裝有顯微針的口吸管對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離。2)激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection，LCM)[25]：利用計(jì)算機(jī)輔助的激光系統(tǒng)將單個(gè)細(xì)胞從固體組織中分離出來。3)流式細(xì)胞儀技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)[26]：通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和熒光染色技術(shù)達(dá)到對細(xì)胞進(jìn)行分選的目的。4)微滴(microdroplets)[27]：用含有特定條碼(barcode)的微升級別的液滴將單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行包裹。5)微流控(microfluidics)[28]：是一種使用微通道處理或操控微小流體的技術(shù)。以上幾種方法各有利弊，在實(shí)際應(yīng)用的選擇當(dāng)中，研究人員應(yīng)當(dāng)基于樣品的差別對不同的單細(xì)胞分離方法進(jìn)行相適應(yīng)的合理選擇，這樣才能更好的完成更進(jìn)一步的測序工作。

表1 不同單細(xì)胞分離方法的比較(修改來自文獻(xiàn)[29])

2.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法的比較

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)展至今雖然有著諸多不同的方法，但其測序流程都基本相似(圖3)。不同的測序方法存在的差異性往往可以從以下幾方面來分析(表2)：單細(xì)胞的分離方法，反轉(zhuǎn)錄后的擴(kuò)增方法，轉(zhuǎn)錄組覆蓋度，鏈?zhǔn)欠窬哂刑禺愋裕欠癖华?dú)特的分子標(biāo)識符(UMI)識別等。Ziegenhain等[30]通過從583只小鼠胚胎干細(xì)胞中提取的數(shù)據(jù)，詳細(xì)比較了CEL-seq2、Drop-seq、MARS-seq、SCRB-seq、Smart-seq和Smart-seq2這6種scRNA-seq經(jīng)典方法的優(yōu)、缺點(diǎn)，結(jié)果表明雖然Smart-seq2檢測到每個(gè)細(xì)胞和跨細(xì)胞的基因最多，但CEL-seq2、Drop-seq、MARS-seq和SCRB-seq由于使用獨(dú)特的分子標(biāo)識符UMI而量化了mRNA水平，擴(kuò)增噪聲較小。不同測序深度的功率模擬試驗(yàn)表明，Drop-seq在分析大量細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組時(shí)更有效，而MARS-seq、SCRB-seq 和Smart-seq2在分析較少的細(xì)胞時(shí)更有效。研究為不同方法之間的選擇提供了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步改進(jìn)不同方案提供了一個(gè)基準(zhǔn)框架。西班牙國家基因組分析中心對13種單細(xì)胞RNA測序方法開展了性能評估[31]。該研究團(tuán)隊(duì)采用了人外周血、小鼠結(jié)腸和少量其他細(xì)胞系的細(xì)胞混合物，在世界上不同的實(shí)驗(yàn)室對13種技術(shù)開展了基因檢測靈敏度、分群、比對率等各方面的比較。最終結(jié)果表明，低通量技術(shù)中Quartz-seq2、Smart-seq2和CEL-seq2表現(xiàn)出色，而高通量技術(shù)中10× Chromium的表現(xiàn)最好。Chen等[32]詳細(xì)介紹了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的一些經(jīng)典方案以及scRNA-seq單細(xì)胞分離技術(shù)，并討論不同單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方案的數(shù)據(jù)分析，包括質(zhì)量控制、基因表達(dá)量化、批次效應(yīng)校正、規(guī)范化、降維、特征選擇、細(xì)胞聚類、軌跡推理基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)等。Townes等[33]將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)與一般的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(bulkRNA-seq)進(jìn)行了比較，明確了兩者的差異即分析的數(shù)據(jù)精度不同，前者在單個(gè)細(xì)胞水平上構(gòu)建每個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜，而后者獲得的是一個(gè)大的細(xì)胞群體中單個(gè)基因的平均表達(dá)水平。這對相應(yīng)方案的選擇起到了指導(dǎo)性的作用。

圖3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序基本流程[34-36]

表2 不同單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)方法的差異[37-40]

對于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序研究中需要選擇的不同方法，應(yīng)該主要考慮的是實(shí)際研究的具體情況，包括選擇全長還是基于UMI的方法；細(xì)胞數(shù)量；測序的讀取片段(reads)等[41-45]。目前，細(xì)胞圖譜類的研究由于要測大量的細(xì)胞(>10 000)，因此常采用UMI方法，測序深度約為100萬的reads。該類研究主要是細(xì)胞分類和標(biāo)記基因的鑒定，因此UMI信息是足夠的[46]。而對于其他的研究，如果想獲得更多的信息，則采用Smart-seq2全長模式比較合適，可以加深測序深度以便得到如非編碼RNA和可變剪接(alternative Splice，AS)等更多的生物信息。

2.3 Smart-seq2與10×Genomics的比較

在眾多方法中10×Genomics推出的ChromiumTM—Single Cell 3’ Solution和Smart-seq2這兩種方法常常較多應(yīng)用于實(shí)際研究中。Smart-seq2是經(jīng)Smart-seq改良的一種測序方案，與Smart-seq相比使用了鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)、更高濃度的MgCl2以及甜菜堿[47-48]。而10×Genomics商業(yè)測序平臺的測序流程主要基于微流控液滴技術(shù)(microfluidic droplet)[49-52]，與Smart-seq有相似的分子生物學(xué)原理，運(yùn)用了模板轉(zhuǎn)換技術(shù)，但與Smart-seq的細(xì)胞捕獲和通量不同。對于這兩種方法的差異，Wang等[53]對兩者的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)的比較，他認(rèn)為Smart-seq2由于成本更低，可以檢測的樣本范圍更廣，所以更適合于分析大量細(xì)胞；同時(shí)，由于其原理的組分更為公開，可以讓研究人員對其進(jìn)一步進(jìn)行改良；且由于單細(xì)胞檢測到的轉(zhuǎn)錄本更多，能挖掘出轉(zhuǎn)錄本更深的信息。但其不能分析非poly(A)的RNA且測序reads不帶有mRNA鏈特異性。10×Genomics則具有操作簡單便捷、細(xì)胞通量高、建庫周期短、捕獲效率高等優(yōu)點(diǎn)，但是該技術(shù)只能獲得3′端轉(zhuǎn)錄本信息且對樣本要求高[54-58]。Kashima等[59]的研究也做出了詳細(xì)比較(表3)。這些研究成果為今后研究者進(jìn)行合適方法的選擇提供了明確且詳細(xì)的參考依據(jù)。

表3 Smart-seq2與10×Genomics的差異比較(修改來自文獻(xiàn)[59])

3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在動物繁殖中的應(yīng)用

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)如今廣泛應(yīng)用于動物繁殖領(lǐng)域的相關(guān)研究中。該技術(shù)以不同種類的單個(gè)細(xì)胞為單位，達(dá)到了高分辨率的生物分子觀測水平，直觀反映出所要解答的相關(guān)科學(xué)問題，例如：通過主成分分析和細(xì)胞聚類技術(shù)對不同器官的單細(xì)胞圖譜進(jìn)行繪制，進(jìn)而達(dá)到對不同細(xì)胞類型的鑒定以及未知細(xì)胞發(fā)掘的目的；通過單細(xì)胞與多組學(xué)的聯(lián)合使用以期達(dá)到對某些關(guān)鍵基因篩選、差異基因比較的目的。最后通過驗(yàn)證技術(shù)(bulkRNA-seq、qPCR、FISH、免疫熒光等)的結(jié)合驗(yàn)證，解析不同動物繁殖的相關(guān)科學(xué)問題(表4)。

表4 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在不同動物的應(yīng)用

3.1 非模式動物細(xì)胞類型的鑒定

3.1.1 細(xì)胞類型的鑒定方法 通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對非模式動物在不同繁殖階段的生殖細(xì)胞進(jìn)行鑒定是動物繁殖領(lǐng)域中最常見且重要的一種應(yīng)用。一種鑒定方法是基于標(biāo)記基因的比對，即通過觀察某個(gè)細(xì)胞類群的差異基因與數(shù)據(jù)庫(CellMarker、Mouse Cell Atlas、PanglaoDB等)[60]中哪種細(xì)胞類型的差異基因相一致程度更高，結(jié)合其定量表達(dá)以完成對細(xì)胞類型的鑒別判定。另外一種鑒定方法是基于表達(dá)譜的比對，即比較未知類型細(xì)胞與已知類型細(xì)胞的表達(dá)譜相關(guān)性，通過比較相關(guān)性程度來達(dá)到鑒定的目的[61]。與之前僅僅通過細(xì)胞形態(tài)、位置及有特定蛋白的基因表達(dá)模式進(jìn)行鑒定的方法相比，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的方法具有更為系統(tǒng)且準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)指標(biāo)，可以更為全面、精確的區(qū)分不同種類的細(xì)胞[62]。同時(shí)也進(jìn)一步提高了鑒定的靈敏度，這使得一些相似的細(xì)胞類型也可以通過有效的方法進(jìn)行區(qū)分和鑒定。

3.1.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在精子和卵子發(fā)生中的應(yīng)用 雄性動物的精子發(fā)生是動物繁殖的關(guān)鍵過程之一，包括曲精細(xì)管上皮的精原細(xì)胞經(jīng)過精母細(xì)胞到精子細(xì)胞的增殖發(fā)育過程和精子形成過程[63]。這一過程基于生殖細(xì)胞和體細(xì)胞之間復(fù)雜的互作效應(yīng)，因此往往會同時(shí)出現(xiàn)多種生殖細(xì)胞和體細(xì)胞類型，即出現(xiàn)較為復(fù)雜的細(xì)胞異質(zhì)性。這種異質(zhì)性使得在不同發(fā)育階段很難精準(zhǔn)剖析辨別不同類型細(xì)胞,而通過單細(xì)胞測序技術(shù)卻可以清晰、準(zhǔn)確的鑒定出睪丸中不同細(xì)胞的不同類型，同時(shí)也可以根據(jù)具體的研究目的，更進(jìn)一步對不同細(xì)胞類型進(jìn)行更詳細(xì)的聚類分析。Green等[64]從成年小鼠睪丸中收集了3.5萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定了所有已知的生殖細(xì)胞和體細(xì)胞以及兩個(gè)未確定過的體細(xì)胞類型。重點(diǎn)分析劃定了精原細(xì)胞的4個(gè)類群和支持細(xì)胞的9個(gè)類群，后者與組織學(xué)上確定的生精上皮周期的發(fā)育階段有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為研究生殖細(xì)胞發(fā)育和體內(nèi)配子發(fā)生提供了全面的知識基礎(chǔ)。高源[65]通過采集性成熟前后兩個(gè)階段安格斯公牛睪丸的細(xì)胞，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序鑒定了12 個(gè)細(xì)胞類群(9種體細(xì)胞和3種生殖細(xì)胞)。又通過聚類分析重點(diǎn)將睪丸生殖細(xì)胞劃定為13個(gè)類群，與后續(xù)特異基因的表達(dá)研究相結(jié)合，詳細(xì)解析了牛睪丸發(fā)育、精子生成等進(jìn)程的相關(guān)機(jī)制。雷佩佩[66]通過采集杜洛克公豬睪丸中的細(xì)胞，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序鑒定了 20 個(gè)細(xì)胞類群，并通過特定基因?qū)⑵浞譃?6 個(gè)大的細(xì)胞類群和一個(gè)未確定過的細(xì)胞類群，這一發(fā)現(xiàn)詳細(xì)剖析了細(xì)胞類型與豬睪丸發(fā)育間的相關(guān)性。

卵細(xì)胞的形成也是動物繁殖的關(guān)鍵過程之一。對于雌性動物而言，卵細(xì)胞的生成依賴于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的相關(guān)過程。He等[67]對小鼠新生卵巢單個(gè)生殖細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，對3種細(xì)胞狀態(tài)(生殖細(xì)胞囊腫、囊腫破裂、卵泡)的3個(gè)細(xì)胞類群進(jìn)行了分類，為后續(xù)鑒定一系列卵泡形成和發(fā)育相關(guān)基因和分子通路起到了關(guān)鍵作用。綜上所述，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以對精子發(fā)生和卵細(xì)胞形成等過程中各類細(xì)胞的異質(zhì)性進(jìn)行更為靈敏的捕獲，進(jìn)而精準(zhǔn)鑒定出細(xì)胞類型，從而使得研究者可以更為精確的解讀動物不同生殖階段與各類細(xì)胞間的關(guān)系。另外，從細(xì)胞角度入手，可以對動物繁殖機(jī)制進(jìn)行更多元化的研究。

3.2 關(guān)鍵基因的研究

在動物繁殖動態(tài)進(jìn)程中，不同類型細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)發(fā)育與分化。當(dāng)其從當(dāng)前狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N狀態(tài)時(shí)，相應(yīng)基因的表達(dá)也隨之改變，轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行重組進(jìn)而出現(xiàn)基因激活或沉默。通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的擬時(shí)序分析(pseudotime)，可以對單細(xì)胞進(jìn)行排序，利用可視化程序和注釋工具構(gòu)建細(xì)胞軌跡，進(jìn)而將細(xì)胞的動態(tài)變化過程進(jìn)行清晰的展現(xiàn)。在這樣的結(jié)果中一般出現(xiàn)數(shù)個(gè)分支點(diǎn)，這些分支節(jié)點(diǎn)的發(fā)生代表著細(xì)胞產(chǎn)生了程序性變化，如細(xì)胞命運(yùn)分化。因此，可以對分支事件進(jìn)行分析，對關(guān)鍵基因?qū)崿F(xiàn)篩選的目的。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序也提供了不同細(xì)胞類型之間基因的差異表達(dá)數(shù)據(jù)[68]。因此，針對不同細(xì)胞類型的差異基因進(jìn)行富集分析(GO、KEGG、Reactome、GSEA、GSVA等[69-74])，可以更好的了解每種細(xì)胞類型參與的生物學(xué)功能，比較不同細(xì)胞類型的信號通路差異，揭示生物學(xué)過程中的關(guān)鍵分子機(jī)制。

對于雄性動物睪丸中的細(xì)胞而言，通過對其特異性基因進(jìn)行篩選，可以更加準(zhǔn)確的對細(xì)胞參與的相關(guān)進(jìn)程機(jī)制進(jìn)行解讀，同時(shí)也可以更好的把握細(xì)胞發(fā)育的階段和其動態(tài)性變化。Yang等[75]分析鑒定了綿羊生殖細(xì)胞的幾個(gè)階段特異性標(biāo)記基因，如EZH2、SOX18、SCP2、PCNA和PRKCD等。這一發(fā)現(xiàn)對綿羊精子發(fā)生和生精細(xì)胞發(fā)育提供了新的見解。Sun等[76]篩選出胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)、性腺原始生殖細(xì)胞(gonad primordial germ cells，gPGCs)和精原干細(xì)胞可變剪切中的階段特異性基因NANOG、POU5F3、LIN28B、BMP4、STRA8和LHX9等，這一發(fā)現(xiàn)全面深入的解讀了雞生殖細(xì)胞可變剪切事件的機(jī)制。Yu等[77]的研究篩選出精原細(xì)胞在精子發(fā)生過程中的特異性候選標(biāo)記基因?yàn)門KTL1和AES。同樣Zhang等[78]的研究也在4個(gè)不同的精原細(xì)胞亞群中鑒定了CD99和PODXL2分別作為未分化和分化精原細(xì)胞新的細(xì)胞表面標(biāo)記物。這一發(fā)現(xiàn)為豬的精子發(fā)生提供了有價(jià)值的信息，同時(shí)也為鑒定參與雄性生殖細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。

對于雌性動物的卵母細(xì)胞而言，處于不同發(fā)育階段或不同環(huán)境條件下，其相關(guān)基因會出現(xiàn)差異性表達(dá)，對此進(jìn)行分析可以從根本上探究卵母細(xì)胞出現(xiàn)變化的相關(guān)機(jī)制和具體原因。Li等[79]的研究中對驢卵母細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定了24 164個(gè)卵母細(xì)胞基因，其中9 073個(gè)在GV期和MII期卵母細(xì)胞中顯著差異表達(dá)；進(jìn)一步的GO 和 KEGG富集分析表明，這些基因與減數(shù)分裂細(xì)胞周期、線粒體活性和N-聚糖生物合成相關(guān)，可能是影響驢卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵基因和調(diào)控機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)解釋了驢GV期和 MII期卵母細(xì)胞的基因表達(dá)模式以及影響驢卵母細(xì)胞成熟的調(diào)節(jié)機(jī)制。Ruihuan等[80]通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠卵母細(xì)胞經(jīng)過玻璃化冷凍、解凍后，經(jīng)過體外受精形成的MII期胚胎中有1 575個(gè)基因發(fā)生了顯著的變化。最顯著改變的生物學(xué)途徑是氧化還原這一過程，這種轉(zhuǎn)錄組學(xué)的改變與MII期卵母細(xì)胞特異性組蛋白H1FOO基因的水平下降有關(guān)，該研究從分子水平對卵母細(xì)胞玻璃化冷凍如何影響后續(xù)小鼠植入前胚胎發(fā)育進(jìn)行了探究。

當(dāng)卵母細(xì)胞、精原細(xì)胞通過減數(shù)分裂、有絲分裂等過程發(fā)育成卵細(xì)胞和精子并結(jié)合為受精卵后，對受精卵發(fā)育至胚胎過程中相關(guān)基因表達(dá)差異性的研究也能讓研究者更為深入的探究和解讀動物繁殖進(jìn)程的機(jī)制。李田田等[81]的研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對處于早期(16～22 h)和晚期(26～32 h)的豬卵裂胚胎進(jìn)行測序，富集分析篩選出了有關(guān)胚胎發(fā)育能力的相關(guān)基因，這一發(fā)現(xiàn)深入挖掘了卵裂時(shí)期與胚胎發(fā)育的關(guān)聯(lián)性關(guān)鍵信息。

4 總結(jié)和展望

動物繁殖過程包括多種錯(cuò)綜復(fù)雜且動態(tài)變化的機(jī)制，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)僅僅從基因和表型層面對其進(jìn)行分析，不能進(jìn)行動態(tài)分析。但是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以聚焦于單個(gè)細(xì)胞，更加直觀的將細(xì)胞與相關(guān)基因進(jìn)行聯(lián)系，捕獲之前研究缺失的細(xì)胞時(shí)序性動態(tài)變化過程以及細(xì)胞間的互作效應(yīng)[82-83]。研究人員將這一技術(shù)應(yīng)用到動物繁殖過程的研究中，可以從轉(zhuǎn)錄組角度直接對生殖細(xì)胞進(jìn)行聚類，并且對相同作用的細(xì)胞進(jìn)行分群得到不同的細(xì)胞簇。同時(shí)也可以獲取在繁殖機(jī)制中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因以及相關(guān)通路。但是目前，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)也面臨著一些挑戰(zhàn)，如測序費(fèi)用昂貴，擴(kuò)增的過程存在偏好，容易出現(xiàn)假陽性等問題[84-85]。在后續(xù)的發(fā)展中研究人員可以針對相關(guān)問題進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)一步提高測序效率，增加測序準(zhǔn)確性，降低測序費(fèi)用。可以預(yù)見的是，隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展和完善，其對于理解動物繁殖機(jī)制，提高動物繁殖力將會提供更大的幫助，發(fā)揮更重要的實(shí)質(zhì)性作用。同樣，在今后的研究中也可以將動物的繁殖過程作為相關(guān)模型，為人類生殖相關(guān)疾病的治療提供參考[86-87]。也可以將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)與其他組學(xué)分析相結(jié)合以便更全面的對生命機(jī)制進(jìn)行分析解讀[88-89]。