DNA甲基化在哺乳動物卵母細胞和早期胚胎發育中的研究進展

楊小耿，張慧珠，李 鍵1,2,，向 華，何翃閎1,2,*

(1.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，成都 610041；3.西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041)

同一生物體內的所有細胞都具有相同的基因組，但其外觀和功能均不相同。在細胞分裂過程中，轉錄程序的選擇性激活和隨后的維持決定了細胞的特性。表觀遺傳修飾主要通過調節染色質功能，在細胞發育和細胞分裂過程的維持中起著至關重要的作用[1]，其主要包括3種調節機制：DNA甲基化、microRNA介導的基因轉錄調控和組蛋白翻譯后修飾[2]。表觀遺傳調控機制控制著配子發生早期的基因組重編程和胚胎的發育，在哺乳動物發育過程中發揮著重要作用。

DNA甲基化是指以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，由DNA甲基轉移酶催化，在CpG二核苷酸胞嘧啶的5’端碳原子上結合一個甲基基團的化學修飾過程[3]。在哺乳動物中，DNA甲基化主要發生在胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸的胞嘧啶上，即CpG位點(CpGs)，且在基因組中呈不均勻分布[4-5]。作為基因表達的中介機制，DNA甲基化被廣泛認為是一種表觀遺傳抑制標志，主要涉及基因組印跡、X染色體失活、轉座元件沉默等多種生理過程[6]。此外，DNA甲基化可以調節轉錄因子與其他染色質互作蛋白的結合并改變染色質結構，從而調控基因表達[7]。

DNA甲基化在哺乳動物卵母細胞和早期胚胎發育過程中具有重要作用。DNA甲基化不僅調控基因的表達，還經歷了廣泛的從頭甲基化和去甲基化的動態變化，這對哺乳動物受精、早期胚胎發育及組織特異性分化至關重要[8-12]。有研究發現，DNA甲基化可抑制哺乳動物細胞中的基因啟動子，介導RSPO2促進哺乳動物的卵泡發育[13-14]。還有研究發現，卵母細胞DNA甲基化對基因組印跡至關重要，而無法建立印跡會導致小鼠和人類發生先天性疾病或致命。卵母細胞甲基化的部分或完全缺失會導致胚胎致死，異常的DNA甲基化會阻礙胚胎發育[15-16]。因此，研究DNA甲基化在哺乳動物卵母細胞和胚胎發育過程中的調控機制對提高卵母細胞成熟率、胚胎發育能力以及哺乳動物繁殖率具有重要意義。本文主要介紹了DNA甲基化的建立與去除機制及其生物學功能，重點闡述了DNA甲基化在哺乳動物卵母細胞和胚胎發育過程中精準生成、維持、讀取和刪除的動態變化過程，為進一步研究哺乳動物表觀遺傳調控提供參考依據。

1 哺乳動物DNA甲基化與去甲基化

1.1 DNA甲基化途徑

DNA甲基化是哺乳動物中一種重要的表觀遺傳修飾，主要由從頭甲基化和維持甲基化組成，并通過特定的DNA甲基轉移酶(DNMTs)介導和維持。目前,在哺乳動物中發現的DNMTs主要有6種，分別是維持型DNMT1，新生型DNMT3A、DNMT3B和DNMT3C，輔助因子DNMT3L以及介導tRNAs甲基化的DNMT2。維持型DNMT1是最早發現的DNA甲基轉移酶，主要存在于哺乳動物的卵母細胞和早期胚胎的細胞質中，負責細胞分裂過程中DNA甲基化的維持，其維持機制主要是通過在復制過程中將舊DNA鏈的DNA甲基化復制到新合成的DNA鏈上從而維持DNA甲基化，且其依賴于UHRF1 將DNMT1招募到半甲基化的CG位點[17-19]。DNMT1的敲除會導致小鼠胚胎死亡以及全基因組的廣泛性去甲基化[20]。DNMT2具有完整的催化結構域且高度保守，能夠使位于天冬氨酸轉運RNA反密碼子環的胞嘧啶38甲基化，但不參與基因組DNA甲基化[21-22]。而DNMT3A和DNMT3B則主要負責生殖細胞、胚胎干細胞及哺乳動物早期胚胎發育過程中的從頭甲基化，但二者又有不同，DNMT3A偏向于未甲基化的DNA，在卵母細胞和附植前胚胎中發揮重要作用；而DNMT3B偏向于半甲基化和未甲基化的DNA，在胚胎發育外胚層轉錄過程中發揮著重要作用[23-25]。DNMT3A和DNMT3B的敲除會導致生殖細胞中印記丟失，造成DNA甲基化異常，進而導致胚胎發育缺陷甚至死亡[26]。在DNMT3L的輔助作用下，DNMT3A和DNMT3B可靶向定位CpG位點，并與DNMT1合作傳播甲基化模式[27]。DNMT3C也是一種從頭甲基轉移酶，主要負責對雄性生殖系統中逆轉錄轉座子的啟動子進行甲基化，且該酶的特殊活性是小鼠生育能力所必需的[28]，這不僅揭示了哺乳動物DNA甲基化系統的可塑性，同時還擴大了逆轉錄轉座子表觀遺傳調控機制的范圍。DNMT3L是一種核蛋白，不含酶的活性位點，但能夠識別攜帶未甲基化組蛋白H3賴氨酸4(H3K4)的核小體，將DNMT3A和DNMT3B招募到特定位點，間接參與從頭甲基化[29-30]。

1.2 DNA去甲基化途徑

DNA去甲基化(DNA demethylation)在原始生殖細胞和胚胎發育過程中發揮重要作用，可分為被動去甲基化和主動去甲基化。被動去甲基化主要發生在母體基因中，是指復制后未使新的DNA鏈甲基化，而保持半甲基化狀態，隨著DNA的復制和細胞分裂，甲基化被不斷稀釋的過程[31]。DNMT1對半甲基化的DNA具有高度親和力且呈周期依賴性，在母體和合子中DNMT1能夠靶向去甲基化。因此，可通過破壞維持DNA甲基化機制，致使CpG在DNA復制過程中被不斷稀釋來完成被動去甲基化過程[32]。主動去甲基化發生在DNA復制之外，由DNA去甲基化酶(ten-eleven-translocation, TET)家族將5-甲基胞嘧啶(5 mC)催化氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5 hmC)，然后復制依賴性稀釋氧化的5 mC或胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)介導的5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine，5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxyl cytosine，5caC)的切除并結合堿基切除修復來完成整個去甲基化過程[33-34]。

TET蛋白酶家族參與DNA去甲基化反應需要α-酮戊二酸、鐵和氧，并由抗壞血酸作為輔助因子促進[35]，在哺乳動物原始生殖細胞及胚胎發育等方面具有重要作用[36]，其表達水平與DNA甲基化密切相關。高表達的TETs可顯著降低基因組的DNA甲基化水平，而缺少TETs則會誘導基因組DNA高甲基化。TET家族由TET1、TET2和TET3三個成員組成，均具有羥基化酶活性，且在小鼠不同組織中呈差異性表達。有研究表明，TET3在卵母細胞和受精卵中高度表達，雌性小鼠敲除TET3可導致生育能力下降甚至致死[37]。隨著早期胚胎的發育，TET3在2細胞期迅速減少，直到囊胚期開始出現反轉，而TET1和TET2的表達量增加，由此表明TET3主要在哺乳動物卵母細胞和受精卵發育中發揮了主動去甲基化功能，而TET1和TET2則在原始生殖細胞中發揮去甲基化作用[38]。

2 DNA甲基化在哺乳動物卵母細胞和胚胎發育中的動態變化

盡管DNA甲基化模式具有可遺傳性，但在哺乳動物卵母細胞和胚胎發育過程中，DNA甲基化呈現動態變化[39]。哺乳動物發育過程中主要發生兩種表觀遺傳的重編程過程，一種發生在原始生殖細胞形成階段，另一種發生在附植前胚胎發育階段[40]。在這兩個階段中，基因組首先進行全局去甲基化，然后發生從頭甲基化，從而建立新的甲基化模式[41]，這在哺乳動物生殖細胞遺傳記憶的重新建立及發育潛能的開發方面具有重要作用[42-43]。

2.1 卵母細胞DNA甲基化的動態變化

原始生殖細胞(PGC)是精子和卵子的前體，哺乳動物生殖細胞來源于附植后早期胚胎的體細胞。原始生殖細胞形成后，基因組發生去甲基化，這標志著第二次重編程的開始。在配子發生期間，不同性別的基因組在不同時間和程度上被重新甲基化[44]，有研究發現，小鼠早期原始生殖細胞攜帶著與體細胞類似的DNA甲基化模式，當遷移至生殖嵴時(E7.5-E13.5)被全部消除；雄性小鼠出生后不久即可重新建立配子特異性表觀基因組，而雌性小鼠卵母細胞會一直保持低甲基化狀態，直到原始卵泡被激活進入生長狀態，卵母細胞才會在發育過程中經歷性別特異性的從頭甲基化并重新建立遺傳印跡[45-48]。

卵母細胞是一種終末分化細胞，具有不同于體細胞的獨特DNA甲基化模式。在卵母細胞生長發育過程中，DNA甲基化的獲得呈漸進性。原始生殖細胞進入并在第一次減數分裂前期停止，在減數分裂前期到排卵期間卵母細胞幾乎不存在甲基化[49-50]，在卵泡發育后期，隨著卵母細胞的增大而重新獲得甲基化[15]，并于青春期到達MⅡ卵母細胞的峰值[51]。此外，卵母細胞甲基化主要局限于活躍轉錄區，使得卵母細胞基因組呈現出一種由低水平甲基化的基因間區或轉錄不活躍區域將高度甲基化的基因體分隔開的雙峰模式[52-54]。多項研究表明，取消單個基因的轉錄會導致該位點無法建立甲基化[54-55]。印跡是親本等位基因特異性DNA甲基化導致后代組織中印跡基因表達的過程[52, 56]。在人類和小鼠中，卵母細胞具有多數印跡基因控制區(ICRs)，其作為卵母細胞的CpG島在卵母細胞發育過程中建立甲基化[54]。然而，卵母細胞甲基化動態變化也與其他細胞生理活動一樣，會因外界條件的影響而產生差異，在牛卵母細胞從生發泡(GV)期到中期Ⅱ(MⅡ)階段的整個體外成熟過程中，全基因組DNA甲基化顯示出穩定的信號，并且在大小不同卵泡產生的卵母細胞間并未觀察到顯著差異[57]。此外，小鼠MⅡ期卵母細胞玻璃化可降低全組甲基化水平[58]。

2.2 早期胚胎DNA甲基化的動態變化

哺乳動物胚胎發育從受精卵開始，其胚胎發育早期是最動態的生物學過程之一，有大量的DNA甲基化重編程在此過程中發生[59]。胚胎附植前的第一次DNA甲基化重編程擦除了配子發生過程中積累的相關遺傳信息，并恢復了胚胎細胞的全能性[60]。受精后，父系和母系DNA甲基化發生第一次重編程，父系DNA主要通過TET3與TDG介導的主動去甲基化，在第一個細胞周期中快速去甲基化，同時在卵裂過程繼續去甲基化[61-62]，而母系DNA由于DNMT1被排除在細胞核之外而缺乏維持性能[56]，因而在細胞分裂過程中發生被動去甲基化，使胚胎的DNA甲基化水平呈下降趨勢，囊胚期達到最低[11, 41]。此時，整個基因組DNA甲基化幾乎被完全擦除，僅保留了小部分特異性甲基化區域，此后，隨著胚胎植入子宮，從頭甲基化轉移酶DNMT3A和DNMT3B迅速恢復基因組甲基化[15]。然而，有研究表明，在小鼠、豬、牛和人類早期胚胎發育過程中，DNA甲基化的建立與去除時間因物種而異，小鼠和人類DNA甲基化的建立主要發生在囊胚期，而豬主要發生在8～16細胞期，牛則主要發生在16細胞期；此外，小鼠DNA去甲基化發生在E7.5～E13.5期間，而豬、牛和人類則均從受精后開始分別至囊胚期、16細胞期及桑葚胚期完成DNA去甲基化(表1)。

表1 不同哺乳動物早期胚胎DNA甲基化與去甲基化的時期

3 DNA甲基化的影響因子

哺乳動物DNA甲基化水平主要受DNMTs和TETs的調控， DNMTs家族主要介導DNA甲基化的建立與維持，而TET家族則主要介導DNA去甲基化。然而，酶的作用又受多種因素的影響，例如，參與TET介導去甲基化作用的氧氣、鐵和α-酮戊二酸以及抗壞血酸等[35]。此外，還有能夠靶向定位DNA甲基化位點的UHRF1以及能夠通過與UHRF1結合來抑制DNA甲基化的Stella等影響因子。

缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factors，HIF)是一種由氧穩定型β亞基和不穩定型α亞基(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)組成的氧依賴的轉錄激活因子。研究表明，HIF可在缺氧條件下調節多種細胞氧穩態的基因轉錄，在哺乳動物胚胎發育中起關鍵作用[69]。HIF-1α和HIF-2α是缺氧反應的關鍵，能夠結合并轉錄激活多種基因。在缺氧條件下，HIF-2α可促進紅細胞生成素編碼基因的轉錄[70]，而HIF-1α則直接誘導TET3表達促進DNA去甲基化[35]。HIF-1α和HIF-2α的靶向失活將導致小鼠胚胎發育缺陷，同時低氧也可降低體外成熟產生的牛受精卵中母體基因的整體甲基化水平[71]。

泛素樣蛋白1(the ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains protein 1, UHRF1)能夠識別DNA甲基化和組蛋白修飾，對維持DNA甲基化在胚胎附植前發育的第一次重編程中起著至關重要的作用，其最基本的機制是：輔助因子UHRF1在DNA復制后識別半甲基化的CpG位點，并招募DNMT1來甲基化新的DNA子鏈。研究表明，在卵母細胞和著床前胚胎的整體表觀遺傳重編程過程中，UHRF1可通過調控DNA甲基化及H3K9甲基化抑制逆轉錄轉座子的轉錄，敲除雄性小鼠生殖細胞UHRF1基因可導致減數分裂停滯，雄性小鼠不育；母體UHRF1基因可通過調控DNA甲基化和組蛋白修飾來參與卵母細胞及早期胚胎的發育，缺失會嚴重降低小鼠卵母細胞的質量并導致早期胚胎發育停滯和雌性小鼠不育；敲除母體UHRF1基因可導致胚胎致死表型且伴隨全基因組低甲基化[19, 72]。

Stella(也稱PGC7或Dppa3)是一種在原始生殖細胞中高度表達的蛋白，可保護母體基因組和印跡基因免受主動去甲基化的影響。研究表明，在小鼠和牛胚胎中，Stella可保護母體基因組免受TET3介導的5 mC向5 hmC的氧化轉化，敲除Stella基因可導致雌性生育能力強烈下降以及早期胚胎無法主動進入囊胚期，證明Stella是正確表觀遺傳重編程和胚胎發育的重要因素[73-74]。此外，Stella也可防止卵母細胞在發育過程中DNA過度甲基化并通過與UHRF1結合來抑制DNA甲基轉移酶DNMT1的招募作用[75]。

4 展 望

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的重要調控機制之一，在哺乳動物卵母細胞和胚胎發育過程中發揮著重要作用。研究表明，卵母細胞DNA甲基化異常會阻礙早期胚胎發育，部分或完全缺失則可導致早期胚胎致死和先天性疾病。因此，深入探究DNA甲基化在哺乳動物卵母細胞和胚胎發育過程中的動態變化模式，為研究哺乳動物表觀遺傳調控等提供參考依據，為進一步探討哺乳動物卵母細胞體外成熟環境及建立體外胚胎生產系統提供理論依據。此外，DNA甲基化水平也受到各類因素的影響，關于HIF、UHRF1及Dppa3等影響因子對DNA甲基化的建立與維持以及相關機制的調控尚不清楚，仍需進一步深入研究。在未來，深入研究DNA甲基化的調控機制對于提高哺乳動物繁殖率以及加強動物疾病防控仍具有重大應用價值。