MicroRNA調控抗病毒免疫和病毒復制

王 嵐，何明宇，張 敏，丁軍濤*

(1.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046；2.新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

miRNA是一類由19～25個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA序列，1993年由Lee等[1]首次在秀麗隱線蟲體內發現一種名為lin-4的基因，其編碼22 nt的短RNA片段，可以靶向lin-14和lin-28基因3′UTR，負調控其表達。隨后，在動植物的細胞、組織、血清、血漿、外泌體中均分離到成千上萬種miRNAs，調節超過60%的蛋白質編碼基因并參與許多生命活動，如免疫反應、胚胎發生、器官發育、代謝、細胞凋亡等[2-4]。

自miRNA被發現以來，大量研究證實其在病毒感染過程中起重要的調控作用。病毒感染細胞后會通過相關的分子機制誘導宿主免疫相關的miRNA表達譜發生變化，這些miRNAs參與調控眾多免疫分子的表達，對于宿主抗病毒免疫信號通路至關重要，能夠增強宿主抗病毒能力[5-6]。另一方面，某些病毒也會編碼相應的病毒miRNAs(viral miRNAs，v-miRNAs)[7]。對于大部分高等動物病毒編碼的v-miRNAs，其介導的RNA干擾(RNAi)除了廣泛參與調節與病毒蛋白表達、基因組復制、顆粒組裝等過程密切相關的自身基因表達，還能直接靶向調控眾多宿主基因的表達，以利于自身的潛伏生存和逃避機體免疫系統對其的清除[8]。

本文主要從miRNA生物發生及其在免疫反應、病毒復制中的調控機制進行概述，為認識病毒的感染復制機理和開發新的抗病毒防控方案提供參考。

1 miRNA的生物發生及分子作用機制

1.1 miRNA的類型與生成

動物miRNA是一類在進化上非常保守的基因。絕大多數miRNAs的轉錄是由RNA polymerase II(pol II)介導，少數由RNA polymerase III(pol III)轉錄生成[9]，如腺病毒miRNA是由pol III轉錄的VA1非編碼RNA的一部分[10]，小鼠皰疹病毒68(MHV68)編碼的9個miRNAs也都由pol III轉錄[11]。RNA聚合酶最先合成的是miRNA的初始轉錄本(primary miRNA，pri-miRNA)。從pri-miRNA到成熟miRNA是一個經歷了細胞核到細胞質空間轉變、多種酶和輔助蛋白協調完成的受到多層次調節的多步驟精密反應，主要分為核內、核外兩個階段。第一階段是在pri-miRNA發卡結構的莖環上進行識別與切割，去掉兩個側翼單鏈序列，釋放一個長約70 nt，3′末端為一個羥基基團并含有2 nt黏性突出的前體miRNA(pre-cursor mRNA, pre-miRNA)的小發卡結構[12]。此過程發生在細胞核中，由RNase III型蛋白Drosha和輔因子DGCR8組成的異源二聚體或微加工器復合物(microprocessor complex)來執行[13]。miRNA成熟的第二階段是pre-miRNA出核并在細胞質中繼續切割，形成具有效應機制的成熟miRNA。pre-miRNA出核需要外輸蛋白5(Exportin-5)及其輔助因子Ran-GTP這兩種異質二聚體共同識別并結合pre-miRNA特有的2 nt 3′黏性末端和相鄰的莖[14]。到達細胞質后，GTP水解釋放pre-miRNA，游離的pre-miRNA與細胞RNase III酶Dicer(雙鏈RNA專一性RNA內切酶)結合并與輔助因子轉錄激活區結合蛋白(TRBP)和干擾素誘導的雙鏈RNA依賴性蛋白激酶激活子(PACT)一起作用[13-14]。Dicer酶結合pre-miRNA發夾基部的3′ 2 nt外延部分，移除末端環，留下第二個2 nt 3′延伸末端，最終生成雙鏈成熟miRNA[12]。

圖1 miRNA生物發生及作用機制

病毒在其生命周期的不同階段除了誘發宿主生成相應的miRNAs，自身也能編碼多種v-miRNAs以促進病毒在宿主細胞中增殖和逃避宿主的免疫防御機制。v-miRNA主要源自雙鏈DNA病毒，如BK多瘤病(BKPyV)[15]、巨細胞病毒(CMV)[16]、皰疹病毒(HSV)[17]、猴空泡病毒40(SV40)[18]。大多數v-miRNAs成簇地從病毒基因組的非編碼序列產生，但也有個別v-miRNAs來自病毒的編碼基因序列[19]。

1.2 miRNA的作用機制

miRNA與siRNA作用機制相似，是RNAi過程中基因沉默的重要效應分子。RNAi是由雙鏈RNA(dsRNA)觸發的轉錄后過程中以序列特異性的方式導致基因沉默，而miRNA通過堿基配對靶向特定的mRNA，導致其降解或翻譯抑制。其基本機制是成熟miRNA解開雙鏈，其引導鏈(guide strand)與Argonaute家族蛋白以及其他至少9種相關的輔助蛋白一起結合到miRISC復合物(miRNA引發的基因沉默復合物)上[20]。在miRNA引導鏈的作用下，miRISC效應復合物與靶mRNA結合，發揮其沉默效應，雙鏈miRNA中的伴隨鏈(passenger strand)則在胞漿中被快速降解。成熟miRNA的種子區5′端通常是由6～8個核苷酸組成的序列，與靶mRNA的3′非翻譯區(UTR)部分或全部互補。miRNA與靶序列mRNA完全的堿基對互補可以引起靶序列切割，而不完全匹配則導致蛋白質翻譯受阻，后者是miRNA最常見的作用方式[21-22]。病毒v-miRNA的作用特點與宿主miRNA相似，通常也是v-miRNA 5′區作用于靶mRNA的3′UTR來調節基因表達。另有研究證實，內源性miRNA的靶點還可以在ORFs和靶基因5′UTR中，但其效果都低于miRNA靶向目標mRNA的3′UTR[23]。Kloosterman等[24]在let-7 miRNA調控斑馬魚胚胎發育的研究中發現，miRNA的結合位點不局限于靶mRNA的3′UTR，在靶基因的編碼序列和5′UTR中也存在let-7 miRNA的靶點，且都可以誘導特異性沉默反應，表明miRNA引發的轉錄后基因抑制可能不具備位置依賴性。

miRNA通過這種短的堿基互補配對作用機制，在生物體的形態發生、組織發育、細胞凋亡、抗病毒感染和信號轉導等各種生命過程中發揮關鍵作用。1個miRNA可以潛在地調節數百種不同且獨立的特異性編碼基因的表達，而具有共同種子區的miRNAs調節相同的靶基因。迄今為止，已經發現了數千個miRNAs，并且超過60%的人類蛋白編碼基因中至少包含一個保守的miRNA結合位點[2]。

2 miRNA調控機體抗病毒免疫應答

病毒感染機體后，宿主會通過各種機制激活免疫系統以抵抗病原體入侵，發揮保護機體的作用。在病毒感染的過程中，會引發一系列細胞miRNAs表達譜變化，而這些差異表達的miRNAs在病毒侵染以及宿主免疫防御機制中起重要調節作用。一方面，大量miRNAs有助于宿主發揮免疫殺傷作用，清除被感染細胞或病毒；另一方面，一些異常表達的miRNAs也可協助病毒侵染宿主細胞、逃避宿主免疫機制或形成慢性感染。

2.1 miRNA調控機體的天然免疫應答

有效識別病毒感染并觸發抗病毒先天免疫反應對于宿主防御病毒感染至關重要。天然免疫反應是機體在長期的進化過程中形成的一種免疫防御功能，是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防線，其過程受到多種調控因子的嚴格調節，包括miRNA。研究表明，在病毒感染過程中，細胞miRNA表達譜快速發生變化，直接參與調控天然免疫反應中的多種信號通路以及相關免疫細胞因子的表達，從而促進或抑制宿主發揮抗病毒免疫機制。某些miRNAs在病毒感染機體后呈差異表達并直接調控TLRs、RLRs等細胞受體的轉錄水平，從而在起始階段控制整個免疫應答的范圍和強度[25-26]。miRNA參與調控機體抗病毒天然免疫反應主要是通過3個方面，一是靶向調控細胞受體；二是調控白細胞介素介導的信號通路；三是靶向調控干擾素信號通路。

2.1.1 miRNA靶向調控病毒感染細胞受體 病毒感染宿主的第一步是通過其表面的配體識別并結合相應的細胞受體，從而侵染細胞。miRNAs廣泛參與調控機體細胞受體的表達，直接阻止病毒的侵入。Lodge等[27]研究發現，miR-221、miR-222靶向結合CD4病毒受體的3′UTR，并抑制其表達，從而干擾人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)進入巨噬細胞。另有研究發現，miR-221、miR-222可以直接靶向病毒基因組并通過抑制抗凋亡蛋白HMBOX1的表達誘導細胞凋亡進而抑制豬肺泡巨噬細胞中禽流感病毒(AIV)的感染和復制[28]，表明同種miRNA在多種病毒感染引起的機體生物反應過程中都起到重要調節作用。Lu等[29]研究發現miR-200家族成員，尤其miR-200c-3p是SARS-CoV-2宿主細胞受體ACE2調控的潛在miRNA靶點，其對于宿主抗SARS-CoV-2病毒具有積極調控作用。Kang等[30]研究發現，宿主miR-181通過靶向結合CD163基因的3′UTR下調血液單核細胞和豬肺泡巨噬細胞(PAMs)中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)受體CD163，CD163的下調導致PRRSV進入PAMs受阻，從而協助宿主抗PRRSV感染。這些研究均表明在病毒感染過程中，宿主miRNA差異表達可靶向抑制相應的細胞受體來抵御病毒感染，發揮天然抗病毒免疫作用。

2.1.2 miRNA調控白細胞介素介導的信號通路 白細胞介素信號通路在病毒感染機體后介導炎癥反應和激活宿主早期先天免疫應答，在此過程中miRNA起著重要調節作用。Epstein-Barr virus (EBV)在感染過程中差異表達44種miRNAs，這些miRNAs參與細胞增殖、凋亡、免疫反應等生物學過程。Skinner等[31]研究發現， EBV感染過程中，其編碼的miRBHRF1-2-5p靶向白介素-1受體1(IL-1 receptor 1)的3′UTR并抑制其表達，從而阻斷白介素-1介導的信號轉導，為EBV逃避宿主免疫抑制提供有利條件。Sarma等[32]通過試驗證實，同正常肝組織相比，在丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者中，miRNA-107和miRNA-449a特異性下調且均超過2倍，而趨化因子CCL2則顯著上調至10倍。上調內源性miRNA-449a或miRNA-107表達可導致IL-6R(55%)和JAK1(67%)RNA和蛋白質水平下調至2倍以上，表明HCV感染機體后下調細胞miRNA-107和miRNA-449a水平，從而調控兩種miRNAs的靶基因IL-6R表達并進一步激活IL-6介導的信號級聯反應來促進CCL2的表達，這可能會導致丙型肝炎病毒介導的炎癥反應和誘導纖維化。

2.1.3 miRNA靶向調控干擾素介導的信號通路 目前，研究普遍認為所有有核細胞的急性抗病毒功能都依賴于I型干擾素(IFN-I)途徑。IFN-I途徑包括對入侵病毒的感知、誘導IFN-I基因轉錄的特異性轉錄因子的激活、不同IFN-I的分泌及其被異二聚體IFN-α/β受體識別、JAK/STAT信號通路的激活，以及IFN刺激基因(ISGs)的轉錄[33]。病毒感染機體后，宿主細胞內病毒傳感器和下游信號被激活，產生促炎細胞因子和I/III型干擾素，這些細胞因子是在病毒感染和鄰近的細胞中形成天然抗病毒免疫體系的重要部分。

在病毒感染過程中，一些miRNAs通過靶向調控干擾素信號通路中的相關蛋白或直接抑制干擾素的產生，從而增強或減弱干擾素介導的抗病毒作用。在miRNA調控宿主抗病毒機制的研究中，報道較多的是miRNA通過調節宿主先天免疫應答水平，如調控JAK/STAT、NF-κB等信號通路，影響干擾素(IFN)和炎性細胞因子的產生，從而干擾病毒的復制[34-35]。仙臺病毒(SeV)、水泡性口炎病毒(VSV)感染的巨噬細胞與樹突狀細胞中，miR-466l的表達水平明顯上調，并且miR-466l直接靶向IFN-α1、-α2、-α4、-α8、-α10、-α13、-α16、-α17和-α21等多個IFN-α亞型3′UTRs中的ARE序列，從而顯著抑制IFN-α的產生，增強病毒復制[36]。III型干擾素包括IFN-λ1/2/3，在免疫系統中通過一種獨特的受體復合物來介導類似于IFN-I的抗病毒反應。miRNA-548家族成員包括miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-548i、miR-548j和miR-548n，均被證實可以直接靶向IFN-λ1的3′UTR，從而干擾IFN-λ1的產生，如腸病毒-71(EV71)和VSV感染期間，細胞miR-548水平顯著下調，而過表達或抑制內源性miR-548水平，則分別增強或減弱了這兩種病毒的復制，且抑制內源性miR-548顯著增加了IFN-λ1的水平[37]。

miRNA除了直接靶向調控干擾素的產生參與細胞抗病毒活性，還可通過靶向干擾素信號通路中的相關蛋白而間接調控干擾素介導的抗病毒免疫機制。Yan等[38]發現，miR-221直接靶向細胞因子信號轉導抑制因子1(SOCS1)的3′UTR，并在mRNA和蛋白質水平上抑制SOCS1的表達從而促進IFN-I和干擾素刺激基因(ISG)的產生來抑制人巨細胞病毒(HCMV)復制。Li等[39]發現，柯薩奇病毒B3(CVB3)感染小鼠原代心肌細胞后，miR-30a明顯上調且直接靶向細胞中的三基序蛋白25(TRIM25)，抑制TRIM25表達和TRIM25介導的維甲酸誘導基因(RIG)-I泛素化過程，從而干擾IFN-β的激活和釋放，導致CVB3復制增強。HCV感染后上調宿主miR-125a，miR-125a能夠靶向抑制線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)和腫瘤壞死因子受體相關蛋白6 (TRAF6)的表達，從而負調控I型干擾素抗病毒信號通路，實現免疫逃避[40]。

病毒在感染過程中，不但誘導宿主細胞生成相應的miRNAs，其自身也能編碼一些特殊的v-miRNAs參與調控干擾素信號通路。EBV感染機體后，可編碼超過40個成熟的v-miRNAs，雖然其中大部分v-miRNAs的功能目前還不清楚，但已有研究表明，多種v-miRNAs在EBV感染的早期階段調節干擾素的釋放及其信號傳導[41]。Hooykaas等[42]鑒定出EBV編碼的miR-BART16是一種新的病毒免疫逃避因子，其直接靶向IFN信號傳導中的關鍵轉錄輔助激活因子CREB結合蛋白，從而在EBV轉化的B細胞和胃癌細胞中誘導CREB結合蛋白下調，抑制IFN-α刺激基因的產生，并阻礙IFN-α對潛在受感染細胞的抗增殖作用。

2.2 miRNA調控機體抗病毒適應性免疫應答

2.2.1 miRNA調控T淋巴細胞 病毒感染機體后會引發宿主免疫細胞中一些miRNAs表達譜發生改變，這些miRNAs通過靶向抑制信號通路的不同蛋白質或分子在多種T淋巴細胞亞型的發育和分化中發揮重要調節作用[43-44]。研究發現，miR-146a參與調控T細胞活化[45]、調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)活性抑制[46]以及樹突狀細胞功能與穩態等免疫反應[47-48]。Lu等[49]證實，miR-146a可對Treg的免疫調節功能產生影響，在miR-146a缺失的情況下，其靶基因STAT1過度活化，破壞Treg介導的免疫耐受，使多器官受到炎癥損害，高表達的STAT1通過干擾細胞因子信號傳送阻抑物(suppressor of cytokine signaling，SOCS1)增強Th1細胞的作用。這證明miR-146a對STAT1的抑制作用可有效阻斷干擾素介導的Th1細胞殺傷效應。CD8+T細胞的分化和應答對宿主防御HIV-1至關重要。Jin等[50]發現，HIV-1感染患者CD8+T細胞中miR-155水平上調，且miR-155的表達水平與效應細胞和記憶CD8+T細胞的百分比呈正相關，表明miR-155與CD8+T細胞分化有關。

2.2.2 miRNA調控B淋巴細胞 除了調控T淋巴細胞之外，病毒感染過程中miRNA也參與調節B細胞的分化與成熟過程，并在B細胞功能調控中具有重要作用。Kluiver和Chen[51]研究證明，在B細胞受體(B-cell receptor，BCR)刺激下，細胞中miR-150、miR-181a1b1和miR-17～92表達水平升高，致使細胞對抗IgM刺激誘導的生長抑制敏感，表明miRNA參與BCR信號傳導，并在調節B細胞介導的耐受性和免疫過程中可能起到重要調節作用。B淋巴細胞誘導的成熟蛋白-1(BLIMP-1)和IFN調節蛋白-4(IRF-4)轉錄因子是漿細胞分化所必需的，研究表明miR-125b能夠直接靶向這兩種蛋白因子的3′UTR，抑制其表達，從而在B細胞的發育與功能中起重要負調控作用[52]。Chen等[53]通過生物信息學分析和報告基因驗證確定了GRB2、SOS1、MALT1、RAC1和INPP5D等多個參與BCR信號轉導的EBV-miRNA靶標分子，且研究表明，EBV-miR-BHRF1-2、BART9、BART17、BART2、BART18等多個EBV-miRNA可以在功能上明顯減弱通過BCR參與啟動的信號事件，如NF-κB反應以及抑制AP1(激活蛋白1)活性。此外，EBV-miRNA還通過調控BCR信號參與激活JNK(c-Jun N-terminal kinases)和p38，觸發絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號，并調節激活蛋白1(AP1)家族轉錄因子JUN和ATF2的活性[52-54]。另有研究發現，EBV-miR-BART18-5p靶向MAP3K2 3′UTR，表明經ATF2和c-Jun介導的下游轉錄可能受到抑制[55]。

圖2 miRNA調控病毒感染的相關通路

3 miRNA調控病毒復制

大量研究證明，miRNA在病毒感染過程中以直接或間接的方式參與調控病毒的復制。病毒感染后誘導宿主細胞中miRNAs表達譜顯著變化，這些差異表達的miRNAs在多個方面參與調控病毒復制，一方面通過調控免疫系統參與病毒復制，另一方面通過靶向特異性的細胞蛋白因子以及調控細胞凋亡等各信號通路，從而影響病毒復制。日本腦炎病毒(JEV)感染后顯著下調人小神經膠質細胞(CHME3)中miR-432的表達[56]，HBV感染的肝癌細胞中，miR-802表達則顯著上調[57]。Xu等[58]發現，豬瘟病毒(CSFV)感染的豬臍靜脈內皮細胞中，miR-140水平被顯著抑制，miR-140靶基因Rab25水平升高，而在細胞中過表達miR-140則明顯降低Rab25蛋白表達且抑制CSFV復制。Sheng等[59]發現，HBV可以通過抑制其啟動子活性來降低miR-101-3p水平，而下調的miR-101-3p通過靶向Rab5a宿主來促進HBV復制以及肝癌細胞的增殖與遷移。豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV) 可以利用內質網 (ER) 完成其RNA基因組復制、組裝和成熟。研究表明，PRRSV感染宿主后誘導miR-142-5p顯著上調并抑制其靶基因ER吞噬受體FAM134B表達，從而避免內質網被大量吞噬，促進PRRSV在細胞中增殖[60]。

除了調控宿主細胞因子，miRNA通過靶向病毒基因組影響病毒在宿主細胞中增殖已在多項研究中被證實。宿主衍生的miRNA可以與HIV RNA結合，直接調控發病機制。Ahluwalia等[61]發現，miR-29a和miR-29b可能靶向抑制HIV早期表達的一種蛋白Nef (negative factor)，導致隨后的病毒載量下降。另有研究表明，miR-29對病毒增殖的抑制率高達60%，miR-133b、miR-138、miR-326、miR-149、miR-92a達到約40%。這些miRNAs可能靶向HIV編碼的5′LTR(miR-326)、env(miR-133b、miR-138)、gag(miR-149)和pol(miR-92a)，從而抑制病毒復制[62]。此外，Chen等[63]發現了miRNA對HIV的另一種調節形式，即miR-146a通過與病毒蛋白gag相互作用，從而阻斷病毒RNA介導的gag組裝，干擾病毒復制和傳染性。病毒編碼的v-miRNA在病毒復制中也具有重要作用。牛泡沫病毒(BFV)可以表達3種v-miRNAs(miR-BF1-3p、miR-BF1-5p、miR-BF2-3p)。BFV U3區miRNA盒的缺失減弱病毒復制，這表明BFV編碼的miRNA在病毒復制中發揮了重要作用[64]。ERK信號通路涉及逆轉錄病毒、冠狀病毒、痘病毒等多種病毒的生命周期，DUSP6是MAPK/ERK信號通路的負調節因子，也是ALV-miRNA-p19-01的靶標基因。研究表明，禽白血病病毒(ALV-J)感染過程中，ALV-miRNA-p19-01通過直接靶向 DUSP6/ERK2信號途徑促進細胞中ALV-J 復制[65]。

miRNAs靶蛋白通常是參與細胞生命活動、腫瘤發育以及病毒增殖的關鍵因子。無論是宿主miRNA還是v-miRNA都是作用于相應的靶蛋白在病毒生命周期中發揮作用，促進病毒在細胞中增殖或抑制病毒復制與感染。1種miRNA可能靶向多種蛋白，調控不同的病毒，同種蛋白也可能對應多種靶miRNAs?？傊?，有意義的miRNAs及靶基因在不斷被發掘，其在病毒復制中的調控機制也在逐漸被破譯，這為研究病毒致病機理以及開發抗病毒治療提供了更多的潛在策略。

4 展望

miRNA作為RNA干擾的一種重要機制，通過靶向干擾素信號通路、白介素信號通路、BCR/TCR信號通路等免疫的信號分子或其他具有生理意義的細胞因子，從而參與宿主抗病毒作用和調控病毒復制。對miRNA在病毒感染宿主后的調控機制研究不僅能夠揭示miRNA在免疫應答、病毒復制過程中的相關作用，也為研究病毒致病機理、制定新型基因治療方案和制備抗病毒疫苗提供理論依據。

到目前為止，關于miRNA與病毒感染之間的調控機制研究大部分集中在miRNA、靶基因以及病毒復制三者之間的互作關系。近年來，miRNAs在許多疾病的診斷或預后的新工具中占有重要地位，如有研究建議使用bkv-miR-B1-5p作為生物標記物來監測病毒感染并預測腎移植患者的并發癥，bkv-miR-B1-5p水平可成為腎移植后BKPyV活躍復制的潛在特異性生物標記物[66]。miRNA作為工具來修飾基因表達治療人類疾病以及制備新型疫苗已逐漸實現。在抗病毒治療中，miRNA顯示出低免疫原性，可在動物建模體內差異表達特定的miRNA進行臨床試驗驗證其功能[67]。在miRNA抗病毒的相關治療研究雖也取得了一定進展[68-69]，但關于miRNA靶基因與病毒毒性或活力之間的具體影響機制還研究甚少，多種miRNAs與靶基因在同種病毒感染期間的調控作用是否相互關聯，在研究1個miRNA或者靶蛋白的功能時，得出的結果中是否包含其他未知靶蛋白或靶miRNAs帶來的影響，這些也都還缺乏一定數據。在今后的研究中有必要考慮到這一點。隨著miRNA調控機制研究的不斷深入，多方位理解病毒的感染復制機制和機體的防御機制，使基于miRNA防治病毒感染成為可能。