蒙古馬全身主要骨骼肌表型譜的構建及比較研究

賈紫潔，圖格琴，丁文淇，任秀娟，劉慧瑩，李欣澤，翠 芳，芒 來*，白東義*

(1.內蒙古農業大學動物科學學院 內蒙古自治區馬遺傳育種與繁殖重點實驗室 農業農村部馬屬動物種業創新部省共建重點實驗室 農業農村部馬屬動物遺傳育種繁殖科學觀測實驗站 內蒙古農業大學馬屬動物研究中心，呼和浩特 010018；2.內蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗動物疫病預防控制中心，赤峰 025550)

目前關于馬運動性能的研究以純血馬和阿拉伯馬為主，且只有少數機體組織被評估[1]。純血馬是典型的速度型賽馬，以短距離競賽中速度快而聞名于世[2]。阿拉伯馬是耐力賽事的首選馬種，其比賽以30～40 km為一賽段[3]。蒙古馬在那達慕比賽中單賽段最長達100 km[4]。馬肉消費目前處于冷門狀態，一些國家發現其有較高的營養價值[5]。馬肉含有豐富的蛋白質、氨基酸及不飽和脂肪酸，脂肪含量低于其他家畜，符合人們對健康生活的需要[6]。

根據“十四五規劃”加強種質資源的保護與利用[7]，對蒙古馬肌纖維測定尤為重要。只有深入了解我國地方馬種的優良特性，結合現代生物學技術優化種群，才能摸索出符合我國國情的現代馬業發展之路，并達到保護地方良種馬的目的[8-9]。蒙古馬作為我國著名的地方品種，具有歷史悠久、人工選育度低、抗嚴寒、耐粗飼、抗病力強、耐力強等特性[10]。

馬骨骼肌是研究哺乳動物運動性能的合適模型，骨骼肌是機體占比很高的器官，是運動和力量產生的關鍵[11]。骨骼肌的多樣性是由于單肌絲纖維成分復雜且不同類型的肌纖維之間鑲嵌分布[12]。肌球蛋白重鏈(MYHC)影響肌纖維分型，根據肌纖維形態結構、生理功能不同，將肌纖維分為Ⅰ型(慢收縮氧化型)、Ⅱa型(快收縮氧化型)、Ⅱb型(快收縮酵解型)和Ⅱx型(中間型)[13]。不同品種、同一品種不同組織、同一組織不同位置的快慢肌纖維比例均存在差異，并且受年齡、性別等要素的影響。慢肌纖維中神經元較小，神經傳導的速度慢，肌肉收縮的速度慢、力量小，但抗疲勞，耐力強；有氧代謝酶的含量高，能量的產生以有氧代謝為主，其擁有豐富的線粒體、肌紅蛋白、毛細血管，使肌纖維呈現紅色；直徑較小；一般用于保持姿勢和持續的重復運動。快肌纖維特性反之，因此快肌纖維在短時間內產生大量的能量，在運動中提供爆發力[14]。

動力學和運動學分析表明，頭頸部主要作用是保持身體平衡，前肢主要是提供支撐力[15]。肩部懸掛前肢，產生反重力;國外有研究表明，軀干肌肉的主要作用是控制背部的平直，而不是誘發運動[16]。腹壁側肌肉根據肌肉收縮影響呼吸，參與代謝，影響運動水平[17]。后肢主要產生推進力[18]。

蒙古馬肉是內蒙古特色食物，馬肉品質指馬肉所具有的外觀、風味、營養等與加工和食用有關的性狀。衡量馬肉品質的指標包括色澤、pH、嫩度、失水率等食用指標；水分、灰分、蛋白質、脂肪等化學指標；氨基酸、脂肪酸、礦物質等營養指標[19]。曾有研究表明，頸部pH最高，顯著高于胸部、腰部、里脊，里脊pH最低；剪切力較高的是肩部、后肢、前肢和臀部，頸部居中，胸部、腰部、里脊較低[20]。

作為基礎知識，建立蒙古馬全身主要的骨骼肌表型譜十分重要。本研究采集了蒙古馬全身主要骨骼肌進行快慢肌纖維占比的測定，并選取典型的速度型賽馬-純血馬與蒙古馬進行對比分析，得到快慢肌纖維組成之間的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗動物樣品采集

本研究選取2匹年齡為5歲的雄性蒙古馬，身體健康、未調教訓練，且體型基本一致。試驗動物均來自內蒙古同一馬場，生活環境與飼養條件相同。將馬匹分為5個部分進行采樣，如圖1所示。將樣品放入固定液中固定，乙醇梯度脫水， 4 ℃保存。

圖1 馬全身主要骨骼肌位置圖

1.2 石蠟切片

通過石蠟切片得到骨骼肌橫截面。將無水乙醇中骨骼肌修切成0.5 cm3的組織塊，二甲苯透明，浸蠟后包埋，利用切片機(LeicaRM2245)制成組織完整、無損傷、厚度為6 μm的組織切片，70 ℃烘片30 min，晾干備用。

1.3 免疫組化

免疫組化運用抗原與抗體特異性結合原理使標記抗體的顯色劑顯色，確定抗原，對組織中快慢肌纖維進行定性、定位及相對定量研究。

將組織切片放入二甲苯脫蠟，梯度酒精回水，抗原修復，PBS沖洗，試驗流程依據UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒說明書制定，加入試劑A(過氧化物酶阻斷液)室溫孵育10 min；PBS沖洗加入試劑B(正常非動物免疫血清)室溫孵育10 min；去掉試劑B，滴加第一抗體: 1)抗快速肌球蛋白骨骼重鏈抗體(兔,稀釋濃度1∶200, Bioss,中國北京)，該抗體與MHC-II特異性反應；2)抗肌球蛋白-7抗體(兔,稀釋濃度1∶200, Bioss,中國北京)，該抗體與MHC-I特異性反應。4 ℃孵育過夜；PBS沖洗加入試劑C(第二抗體)室溫孵育10 min；PBS沖洗加入試劑D(鏈霉菌抗生物素過氧化物酶)室溫孵育10 min；PBS沖洗加入DAB，水中終止染色；蘇木素復染，自來水沖洗返藍；無水乙醇洗去雜質；中性樹膠封片固定，晾干后避光保存。

1.4 HE染色

HE染色是石蠟切片技術中常用的染色法，蘇木精使細胞核內的染色質與胞質內的核酸著藍紫色；伊紅使細胞質和細胞外基質中的成分呈紅色。

將組織切片放入二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；蘇木素染細胞核，自來水沖洗返藍；伊紅染細胞質；95%酒精脫伊紅；無水乙醇洗去雜質；中性樹膠封片固定，晾干后避光保存。

1.5 切片數據統計

將染色后的組織切片置于顯微成像系統，可由圖像分析軟件選取AOI，再由Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件得到肌纖維的總面積、快慢肌纖維所占面積、視野內肌纖維個數，計算得到快慢肌纖維在所處視野的比例及肌纖維橫截面積用于后續分析。

1.6 數據統計分析

將蒙古馬26個部位骨骼肌快慢肌纖維比例及肌纖維橫截面積按部位分為5組進行統計，并進行相關性分析。將蒙古馬26個部位骨骼肌表型數據中24個(除頸鋸肌、股四頭肌)與已發表文章中純血馬(MINAKO KAWAI，2009)所對應的骨骼肌進行差值分析，并按組進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 蒙古馬頭頸部骨骼肌肌纖維類型及肌纖維橫截面積分析

根據免疫組化染色結果，將肌纖維分為快肌纖維和慢肌纖維，如圖2所示；根據HE染色結果計算得到肌纖維橫截面積，如圖3所示。

A.蒙古馬夾肌快肌纖維;B.蒙古馬夾肌慢肌纖維。a.快肌纖維;b.慢肌纖維

A.比目魚肌HE染色;B.腓腸肌HE染色

本研究在頭頸部采集了2匹蒙古馬的夾肌、胸頭肌、頸鋸肌共6個肌肉樣本(2匹×3個骨骼肌部位)。由表1可知，頭頸部骨骼肌的平均快肌纖維占比為42.37%，平均慢肌纖維占比為57.63%；除頸鋸肌外其他骨骼肌均為慢肌纖維占更大，肌纖維橫截面積均值為505.58 μm2。其中夾肌慢肌纖維占比最大(67.83%)，頸鋸肌慢肌纖維占比最小(47.60%)。

表1 蒙古馬頭頸部骨骼肌肌纖維類型占比及肌纖維橫截面積

2.2 蒙古馬前肢骨骼肌肌纖維類型及肌纖維橫截面積分析

本研究在前肢采集了2匹蒙古馬的腕橈側伸肌、臂三頭肌、三角肌、岡下肌、岡上肌、臂二頭肌、腕橈側屈肌共14個肌肉樣本(2匹×7個肌肉部位)。由表2可知，蒙古馬前肢骨骼肌的平均快肌纖維占比為43.98%，平均慢肌纖維占比為56.02%；其中腕橈側伸肌、臂三頭肌、三角肌、岡下肌為慢肌纖維占比較大，岡上肌、臂二頭肌、腕橈側屈肌為快肌纖維占比較大，前肢骨骼肌的肌纖維橫截面積的均值為550.31 μm2。其中腕橈側伸肌慢肌纖維占比最大(74.63%)，腕橈側屈肌慢肌纖維占比最小(42.18%)；肌纖維橫截面積最小的是慢肌纖維占比較大的臂三頭肌，肌纖維橫截面積最大的為快肌纖維占比最大的腕橈側屈肌。

表2 蒙古馬前肢骨骼肌肌纖維類型占比及肌纖維橫截面積

2.3 蒙古馬軀干部骨骼肌肌纖維類型及肌纖維橫截面積分析

本研究在軀干部采集了2匹蒙古馬的背最長肌、背闊肌、斜方肌、胸肌、菱形肌共10個肌肉樣本(2匹×5個肌肉部位)。由表3可知，蒙古馬軀干部骨骼肌的平均快肌纖維占比為37.48%，慢肌纖維占比為62.52%；除菱形肌外其他骨骼肌中慢肌纖維占比更高，骨骼肌肌纖維橫截面積的均值為517.66 μm2。其中背最長肌慢肌纖維比例最高(73.75%)；菱形肌慢肌纖維所占比例最小(40.11%)；肌纖維橫截面積最大的是快肌纖維占比最大的菱形肌，慢肌纖維占比最大的背最長肌的肌纖維橫截面積較小。

表3 蒙古馬軀干部骨骼肌肌纖維類型占比及肌纖維橫截面積

2.4 蒙古馬腹壁側骨骼肌肌纖維類型及肌纖維橫截面積分析

本研究在腹壁側采集了2匹蒙古馬的腹外斜肌、腹內斜肌、胸腹側鋸肌共6個肌肉樣本(2匹×3個肌肉部位)。由表4可知，蒙古馬腹壁側骨骼肌的平均快肌纖維占比為43.32%，慢肌纖維占比為56.68%；除胸腹側鋸肌外其他肌肉組織中慢肌纖維占比較高，骨骼肌肌纖維橫截面積的均值為580.86 μm2。其中腹外斜肌慢肌纖維比例最高(62.19%)，胸腹側鋸肌的慢肌纖維比例最低(46.54%)；腹外斜肌、腹內斜肌、胸腹側鋸肌其慢肌纖維比例依次遞減，但其肌纖維橫截面積依次遞增。

表4 蒙古馬腹壁側骨骼肌肌纖維類型占比及肌纖維橫截面積

2.5 蒙古馬后肢骨骼肌肌纖維類型及肌纖維橫截面積分析

本研究在后肢采集了2匹蒙古馬的比目魚肌、臀中肌、半膜肌、股二頭肌、股闊筋膜張肌、趾長伸肌、股四頭肌、腓腸肌共16個肌肉樣本(2匹×8個肌肉部位)。由表5可知，蒙古馬后肢骨骼肌的平均快肌纖維占比為36.91%，平均慢肌纖維占比為63.09%；除腓腸肌外其他骨骼肌均為慢肌纖維占比較大，骨骼肌肌纖維橫截面積的均值為539.94 μm2。其中比目魚肌慢肌纖維所占比例最大(100.00%)，腓腸肌慢肌纖維所占比例最小(19.08%)；肌纖維橫截面積最小的是慢肌纖維占比最大的比目魚肌，快肌纖維占比最大的腓腸肌的肌纖維橫截面積較大。

表5 蒙古馬后肢骨骼肌肌纖維類型占比及肌纖維單位橫截面積

2.6 蒙古馬肌纖維中快慢肌纖維占比與肌纖維橫截面積分析

根據免疫組化與HE染色分別得到骨骼肌快慢肌纖維占比、肌纖維橫截面積，選取骨骼肌的慢肌纖維占比與肌纖維橫截面積，計算其線性相關，從圖4中可以看做出：隨著骨骼肌中慢肌纖維占比的增加，肌纖維橫截面積會減小。這與慢肌纖維較快肌纖維更細這一肌纖維形態結構特點相一致。

圖4 蒙古馬不同部位骨骼肌慢肌纖維占比與肌纖維橫截面積線性相關圖

2.7 蒙古馬與純血馬肌纖維類型差異顯著性分析

根據免疫組化結果，將肌纖維分為快肌纖維和慢肌纖維，如圖2所示。對蒙古馬與純血馬(MINAKO KAWAI，2009)對應的24塊各部位骨骼肌快慢肌纖維占比分為5組進行單因素方差分析，如圖5所示。在前肢中蒙古馬的慢肌纖維占比與純血馬慢肌纖維占比差異極顯著(P<0.001)，在后肢中蒙古馬的慢肌纖維占比顯著高于純血馬(P<0.05)，軀干部蒙古馬的慢肌纖維占比與純血馬慢肌纖維占比差異極顯著(P<0.01)，頭頸部蒙古馬的慢肌纖維占比與純血馬快慢肌纖維占比無顯著差異，腹壁側蒙古馬的慢肌纖維占比顯著高于純血馬(P<0.05)。蒙古馬與純血馬慢肌纖維占比差值如圖6所示，蒙古馬的慢肌纖維占比基本大于純血馬，除菱形肌外，且菱形肌的快慢肌纖維占比在蒙古馬與純血馬上基本一致；其中蒙古馬與純血馬在臂三頭肌、臀中肌、半膜肌和背最長肌慢肌纖維的差值大于50%。

MH-F.蒙古馬前肢；TH-F*.純血馬前肢*； MH-H.蒙古馬后肢； TH-H*.純血馬后肢*；MH-T.蒙古馬軀干部；TH-T*.純血馬軀干部*；MH-HN.蒙古馬頭頸部；TH-HN*.純血馬頭頸部*；MH-A.蒙古馬腹壁側；TH-A*.純血馬腹壁側*

圖6 蒙古馬與純血馬不同部位骨骼肌慢肌纖維差值

3 討 論

本試驗研究了蒙古馬全身主要骨骼肌表型，不同部位骨骼肌肌纖維占比不同，可能是不同部位骨骼肌在運動中的作用不同。由統計可知，慢肌纖維占比為后肢、軀干部、頭頸部、腹壁側、前肢依次遞減。

頭頸部肌肉主要作用是支撐頭部重量，在運動時保持身體平衡。夾肌主要使頭部后仰和偏頭頸，胸頭肌是頭頸的屈肌[21]。頸部肌肉對馬整體運動的速度和耐力影響有限，因此頭頸部肌肉組織在不同運動性能馬品種之間沒有顯著差異。

前肢是身體的一部分，指靠近頭部或軀干前部的肢體。前肢與后肢相比，前肢的長度較短，身體自然向前傾斜，承受的重量更多，為動物提供了更多的平衡和穩定性，使馬在奔跑時更加協調快速，在奔跑時馬的一側前肢在瞬間承載馬全部重量，因此前肢主要起到支撐作用[22]。臂三頭肌主要作用是伸直肘關節，內收肩關節，用于蹬地和擺動前肢[23]；其慢肌纖維占比更大，運動神經元欠發達，骨骼肌收縮和舒張速度較慢，抗疲勞性強；線粒體數量多，代謝方式以有氧代謝為主，充分消耗糖分且持續提供能量，使臂三頭肌擁有更強的耐力。

軀干部肌肉是核心力量的基礎，使得前、后肢在運動時更加協調，有效的銜接身體各部位的力量，減少運動帶來的損傷[24]。背最長肌是脊柱最長最大的肌肉，主要作用是伸腰背和頸，連接前、后肢，將后肢產生的力量通過背最長肌傳導到前肢，推動身體向前運動[25]。背最長肌慢肌纖維占比越高，后肢向前肢傳導力量的持續性越好。菱形肌的快慢肌纖維在蒙古馬和純血馬中的占比基本一致，猜測菱形肌的快慢肌纖維比例與品種無關。

腹壁側肌肉與呼吸相關，此部位肌肉收縮影響馬的呼吸，從而影響能量代謝和力量的產生,并有助于保持肢體的協調穩定[26-27]。腹外斜肌是吸氣肌，腹內斜肌是呼氣肌，胸腹側鋸肌拉動肋骨向后協助呼氣[28]。當慢肌纖維占比更大時，肌肉的收縮速度減慢，抗疲勞能力更強，使呼吸更深更長，提供更多的氧氣，進行有氧代謝，蒙古馬較純血馬慢肌纖維占比增大，有氧氧化代謝能力更高，所需氧氣更多，符合蒙古馬耐力強的特點。

對于馬來說，前、后肢所承受的負荷相近，但后肢仍比前肢強壯，馬在運動時朝向頭的一側奔跑，后肢承擔啟動發力的作用，在奔跑和跳躍中尤為重要[29]。后肢的臀中肌是衡量馬運動性能的關鍵肌肉，對抬腿、跳躍、踢腿有很大的作用[30]。由表5可知，蒙古馬的臀中肌慢肌纖維占比為71.31%，然而純血馬臀中肌的慢肌纖維只占有13.90%(MINAKO KAWAI，2009)，阿拉伯馬慢肌纖維占比為69.60%(Lopez-RiveroJL，1991)[31]。蒙古馬臀中肌慢肌纖維占比更加接近于典型的耐力型馬種-阿拉伯馬。由此推測，蒙古馬的耐力性能更好。比目魚肌是典型的維持姿勢的肌肉，比目魚肌需要好的抗疲勞能力來使得姿勢維持的時間更長[32]，需要慢肌纖維占比更高，與本試驗結果中的比目魚肌慢肌纖維占比高相一致。比目魚肌相對于馬后肢肌肉來說是極小的一塊肌肉組織，猜測其在運動過程中的作用較小。有研究認為，比目魚肌可能在本體感受功能方面發揮重要作用[33]。在后肢中，蒙古馬的腓腸肌相較于其他肌肉快肌纖維占比更高，運動神經元更大，神經傳導速度更快，導致肌肉收縮速度、收縮力量增大；無氧代謝酶的含量更高，無氧代謝能力提高，在短時間內產生更大的能量。腓腸肌起于股骨后端，止于跟骨頂端，主要的作用是彎曲膝關節，伸展踝關節，在蹬地時起到重要作用，使馬匹向前推進,在運動中主要提供爆發力，這與腓腸肌快肌纖維占比高相一致[34]。(股)闊筋膜張肌、半膜肌、股二頭肌、股四頭肌協同完成后肢的運動，在蒙古馬身上均為慢肌纖維占比較高，通過影響線粒體含量、酶活性、神經元及骨骼肌收縮使得骨骼肌的耐力更強，后肢作為發力的部位，其骨骼肌慢肌纖維占比大會提高整匹馬在運動中的耐力性能。

馬匹的運動由骨骼與骨骼肌共同完成。肌纖維可塑性很強[35]。快慢肌纖維在生理功能上有著很大的差異,所以26個部位的骨骼肌快慢肌纖維比例不盡相同。骨骼肌快慢肌纖維占比不是一成不變的，肌纖維類型是逐漸過渡轉化的，年齡、飼養、訓練調教等因素會使肌纖維類型發生轉化[36]。本試驗中，蒙古馬前肢的岡上肌、臂二頭肌、腕橈側屈肌，后肢的腓腸肌，軀干部的菱形肌、腹壁側的胸腹側鋸肌的慢肌纖維占比較低。通過外界因素的影響使得肌纖維類型由快肌纖維向慢肌纖維轉化的可能性也就越大，當骨骼肌慢肌纖維增多時，骨骼肌中線粒體數量增多，ATP酶的活性提高，有氧氧化能力提高，這使得肌肉在運動中消耗更多的氧氣且產生更多的能量，使得運動持續的時間更長，抗疲勞性增強，該骨骼肌在提高耐力方面有更大的潛力。大膽的猜測，對岡上肌、臂二頭肌、腕橈側屈肌、腓腸肌、菱形肌、胸腹側鋸肌進行針對性耐力訓練，可以更好的提高蒙古馬的耐力。

比較分析了蒙古馬與純血馬不同部位肌纖維組成之間的差異，因選取的馬匹均為成年健康，未經訓練，純血馬所在文章中也已交代，所以這種差異可能與馬品種有關，蒙古馬人工選育程度低，耐力好[37]。純血馬經過高度人工選育，作為速度型賽馬，速度一直作為其選育的最重要目標[38]。因選擇條件不同，導致品種之間在基因上存在差異，使得快慢肌纖維占比存在差異。通過免疫組化結果分析，發現蒙古馬慢肌纖維占比基本高于純血馬。因此，蒙古馬骨骼肌中線粒體的數量更多，線粒體酶活性更強，毛細血管數更多，有氧氧化能力更強，會消耗更多的氧氣去產生能量，抗疲勞能力強；蒙古馬骨骼肌的運動神經元較小，神經傳導速度減慢，骨骼肌收縮速度、力量減小，爆發力較弱，因此蒙古馬的耐力更好。蒙古馬與純血馬在臂三頭肌、臀中肌、半膜肌和背最長肌的慢肌纖維差值較大，造成這一差異的最大因素可能是馬品種不同，猜測臂三頭肌、臀中肌、半膜肌和背最長肌是影響馬匹運動性能的關鍵肌肉。

馬肉品質也與快慢肌纖維的占比有關，在蒙古馬全身主要骨骼肌中腕橈側伸肌、臂三頭肌、背最長肌、臀中肌、比目魚肌的慢肌纖維占比較大(>70%)。肉色是肉品質的關鍵指標，是消費者對肉的第一印象，雖對肉的食用品質沒有直接影響，但是消費者在購買時多會選擇顏色鮮紅的肌肉[39]。這些骨骼肌以有氧代謝為主，并需要更多的氧氣來維持代謝，因此骨骼肌會含有大量的肌紅蛋白和毛細血管，使得骨骼肌顏色更加鮮紅；骨骼肌的pH直接影響肉品質，屠宰后骨骼肌仍進行代謝活動，骨骼肌以有氧代謝為主，因此通過糖酵解產生的乳酸較少，pH下降的更慢，肉品質會更好[40]。剪切力是衡量肌肉嫩度的重要標準，慢肌纖維占比較大的骨骼肌，其肌纖維的平均直徑更細，剪切力更高，骨骼肌的嫩度會更好[41]。比目魚肌雖然慢肌纖維占比極大，但其體積過小，食用價值低。因此，蒙古馬的腕橈側伸肌、臂三頭肌、背最長肌、臀中肌肉質更好。

4 結 論

本研究構建了蒙古馬全身主要骨骼肌快慢肌纖維表型譜，其中頸鋸肌、岡上肌、臂二頭肌、腕橈側屈肌、腓腸肌、菱形肌、胸腹側鋸肌的慢肌纖維占比較低，具有很高的耐力訓練潛力。腕橈側伸肌、臂三頭肌、背最長肌、臀中肌慢肌纖維占比達到70%以上，符合高品質肉的要求，可作為蒙古馬肉開發的重點部位。分析蒙古馬與純血馬不同部位骨骼肌肌纖維類型占比情況，發現蒙古馬慢肌纖維占比基本高于純血馬，前肢、軀干部差異極顯著(P<0.01)，后肢、腹壁側差異顯著(P<0.05)，符合耐力型馬種特點。臂三頭肌、臀中肌、半膜肌和背最長肌在兩個馬品種中慢肌纖維差值大，猜測其為影響馬匹運動性能的關鍵肌肉，可作為馬匹運動性能檢測的目標肌肉。