飼糧中添加蘆丁對肉雞回腸形態(tài)、免疫、抗氧化及屏障功能的影響

劉慧娟，王 超，周斌斌，張佳琦，王 恬，莊 蘇

(南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，南京 210095)

腸道既是動物機體消化、吸收營養(yǎng)物質的主要場所，也是機體主要的分泌器官和免疫器官[1]。腸道作為免疫的第一道防線，在維持機體腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的同時可有效抵抗病原微生物及抗原物質進入腸細胞，保護腸道功能[2-3]。應激狀態(tài)下，腸道功能受損，部分細菌和毒素可穿過胃腸道進入宿主體內(nèi)，降低腸黏膜上皮細胞的抵抗力，繼而破壞機體免疫，影響動物健康與生長。在動物生產(chǎn)過程中，氧化應激引起動物腸道組織形態(tài)改變，破壞腸內(nèi)微生態(tài)平衡，導致腸道功能障礙，同時也可導致腸屏障功能損傷，造成腸道組織繼發(fā)性感染，影響腸道健康[4]。多項研究表明，黃酮類物質作為一種高效抗氧化劑，能夠有效緩解由氧化應激引起的腸道損傷，保護腸道完整性，提高其抗氧化能力[5-6]。蘆丁(rutin)又稱蕓香甙，主要來源于蕓香葉的一種黃酮類化合物，廣泛存在于多種藥用植物和食物中，為淡黃色或淡綠色針狀結晶或結晶性粉末[7]。它具有抗氧化、抗炎、增強免疫和清除自由基等多種生物學功能[8-9]。研究表明，蘆丁因其本身具備獨特的黃酮多酚結構，主要在小腸被吸收或與小腸內(nèi)源性蛋白質結合，進而在腸道組織或通過入血轉運至機體其他組織中發(fā)揮作用[10]。Itagaki等[11]報道，蘆丁能夠清除大鼠腸道組織多余的活性氧進而保護腸道健康。Hassan等[12]研究證明，飼糧中添加蘆丁能促進肉雞生長，提高肉雞抗氧化功能。目前關于蘆丁的功能研究多集中在體外細胞或小鼠上，而對肉雞腸道功能的研究較為缺乏，因此，本試驗擬通過在肉雞飼糧中添加不同水平的蘆丁，從回腸組織形態(tài)、抗氧化、免疫和腸屏障功能方面系統(tǒng)評估蘆丁的作用效果，以期為蘆丁在動物生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及設計

1.1.1 試驗設計 動物飼養(yǎng)及屠宰測定均經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學動物保護和使用委員會批準。試驗擇取1日齡AA肉雞256只，隨機分為4組，每組8個重復，每個重復8只，分別飼喂基礎飼糧中添加0、250、500和1 000 mg·kg-1的蘆丁。整個試驗期為42 d，分為飼養(yǎng)前期(1～21 d)和飼養(yǎng)后期(22～42 d)。基礎日糧(粉料)參照美國國家研究委員會NRC(2012)推薦營養(yǎng)水平配制，其組成及營養(yǎng)成分見表1。試驗所用蘆丁(純度95%)購自上海阿拉丁生物科技股份有限公司；試驗肉雞購自當?shù)厣唐贩趸瘓?南京，江蘇)。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平

1.1.2 飼養(yǎng)管理 試驗期內(nèi)，將所有肉仔雞飼養(yǎng)在1個溫度可控的房間內(nèi)，每個重復(8只)飼養(yǎng)于1欄內(nèi)，前4 d房間溫度保持在33～34 ℃，之后逐漸降低為22 ℃直到試驗結束。試驗過程中，肉仔雞自由采食和飲水。期間按雞場飼養(yǎng)管理要求進行環(huán)境清理和常規(guī)免疫，保持舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生并觀察和記錄肉雞的精神狀態(tài)和健康狀況。

1.2 樣品采集

在21日齡和42日齡時，試驗雞禁食12 h后，從各組每重復中隨機選取1只雞進行解剖，分離出肉雞的回腸組織并取約2.0 cm的腸段組織于4%多聚甲醛溶液中固定，以備后續(xù)制備腸道切片。另取部分回腸樣本，沿腸道縱軸用剪刀剪開腸腔，用載玻片刮取腸道黏膜于凍存管中，置于液氮冷凍后存于-80 ℃低溫冰柜儲存待測。

1.3 指標測定與方法

1.3.1 腸道組織形態(tài)觀察 將回腸組織于4%多聚甲醛中固定48 h后，通過酒精、二甲苯處理，石蠟包埋、切片，并用伊紅和蘇木精染色后置于顯微鏡(ECLIPSE 80i型，尼康日本)下觀察組織形態(tài)，用Image-Pro Plus軟件測量絨毛高度(VH)，絨毛寬度(VW)和隱窩深度(CD)，并計算絨毛高度/隱窩深度比值(V/C)。

1.3.2 腸道黏膜免疫球蛋白測定 取21日齡和42日齡肉雞腸道黏膜樣品與0.9%的氯化鈉溶液按質量/體積比(1∶9)勻漿后離心(4 ℃，3 000 r·min-1，15 min)，收集上清液按照ELISA法測定回腸黏膜中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量，試劑盒購自南京奧青生物有限公司。采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定總蛋白(TP)含量計算回腸黏膜中每毫克蛋白含有的sIgA含量，測定步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 腸道抗氧化指標測定 取“1.3.2”中上清液測定丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)以及總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)的活性，所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所，測定步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 目的基因mRNA相對表達量測定 取回腸黏膜樣品，使用TRIzol試劑(TaKaRa，大連)提取總RNA，通過qRT-PCR檢測目的基因mRNA表達，以β-actin作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt方法計算各基因mRNA的相對表達量，具體操作根據(jù)先前研究方法進行[13]。引物序列見表2。

(續(xù)表1 Continued)

表2 qRT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019初步整理后，采用SPSS 22.0分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差統(tǒng)計分析，并用Duncan’s法進行多重比較，采用多項式中的線性和二次分析對蘆丁不同梯度的效果進行分析。P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示趨勢性影響。

2 結 果

2.1 不同水平蘆丁對肉雞腸道形態(tài)組織結構的影響

由表3可知，飼糧中添加蘆丁線性增加42 d回腸絨毛高度(PL<0.05；PQ=0.090)，對21 d回腸V/C值有二次升高趨勢(PQ=0.069)。與對照組相比，飼糧中添加250 mg·kg-1提高了21 d回腸V/C值，而添加500 mg·kg-1蘆丁增加了42 d回腸VH(P<0.05)。添加蘆丁對肉雞前、后期VW和CD無顯著影響(P>0.05)。

表3 不同水平蘆丁對肉雞回腸組織形態(tài)的影響

2.2 不同水平蘆丁對肉雞回腸黏膜sIgA含量的影響

如表4所示，飼糧中添加蘆丁線性和二次曲線提高21 d回腸黏膜中sIgA含量(PL<0.05；PQ<0.05)，且蘆丁處理組回腸黏膜中sIgA含量顯著高于對照組(P<0.05)。飼糧中添加蘆丁對42 d回腸黏膜中sIgA含量無顯著影響(P>0.05)。

表4 不同水平蘆丁對肉雞回腸黏膜中sIgA含量的影響

2.3 不同水平蘆丁對肉雞腸道抗氧化指標的影響

如表5和圖1所示，21 d時，飼糧中添加蘆丁線性和二次曲線提高了回腸黏膜中T-AOC(PL<0.05；PQ<0.05)以及HO-1 mRNA的表達量(PL<0.05；PQ<0.05)，提高了GSH-Px活性(PL=0.096；PQ<0.05)，線性增加NQO1 mRNA的表達量(PL<0.05)，并二次曲線降低回腸黏膜中MDA含量(PQ<0.05)，提高Nrf2 mRNA的表達量(PQ<0.05)；與對照組相比，蘆丁處理組顯著提高回腸黏膜中HO-1 mRNA的表達量(P<0.05)，250和500 mg·kg-1蘆丁組顯著降低回腸黏膜中MDA含量(P<0.05)，提高GSH-Px活性(P<0.05)，同時添加250 mg·kg-1蘆丁顯著提高回腸黏膜中Nrf2 mRNA的表達量(P<0.05)，500 mg·kg-1蘆丁組回腸黏膜中T-AOC和NQO1 mRNA的表達量也顯著高于對照組(P<0.05)。42 d時，飼糧中添加蘆丁線性和二次曲線降低回腸黏膜中MDA含量(PL<0.05；PQ<0.05)，Nrf2和HO-1 mRNA的表達量呈二次曲線增加(PQ<0.05)，同時有提高T-SOD(PL=0.058；PQ=0.055)與GSH-Px活性(PQ=0.053)趨勢；與對照組相比，添加500 mg·kg-1蘆丁顯著降低了回腸黏膜中MDA含量(P<0.05)，提高T-SOD活性和Nrf2、HO-1 mRNA的表達量(P<0.05)，250 mg·kg-1蘆丁組回腸黏膜中HO-1 mRNA的表達量也顯著高于對照組(P<0.05)。添加蘆丁對回腸黏膜CAT活性和GSH-Px、SODmRNA的表達量無顯著影響(P>0.05)。

表5 不同水平蘆丁對肉雞回腸黏膜抗氧化指標的影響

圖1 不同水平蘆丁對21 d(A)和42 d(B)肉雞腸道抗氧化相關基因mRNA相對表達量的影響

2.4 不同水平蘆丁對肉雞腸道黏膜增殖與凋亡基因相對表達量的影響

如圖2所示，21 d時，飼糧中添加蘆丁二次曲線提高回腸黏膜中Bcl-2 mRNA表達量(PQ<0.05)，且250 mg·kg-1蘆丁組回腸黏膜中Bcl-2 mRNA表達量顯著高于對照組(P<0.05)。42 d時，飼糧中添加蘆丁線性提高回腸黏膜中Bcl-2 mRNA表達量(PL<0.05)，且與對照組相比，添加500 mg·kg-1蘆丁顯著增加了回腸黏膜Bcl-2和ki67 mRNA表達量(P<0.05)，1 000 mg·kg-1蘆丁組回腸黏膜中Bcl-2 mRNA表達量也顯著高于對照組(P<0.05)。蘆丁對回腸黏膜中Bax和Caspase-3 mRNA的表達量無顯著影響(P>0.05)。

2.5 不同水平蘆丁對肉雞腸道黏膜緊密連接蛋白基因相對表達量的影響

如圖3所示，21 d時，飼糧中添加蘆丁二次曲線提高了回腸黏膜中ZO-1 mRNA表達量(PQ<0.05)，且250和500 mg·kg-1蘆丁組回腸黏膜中ZO-1 mRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.05)。

圖3 不同水平蘆丁對21 d(A)和42 d(B)肉雞回腸黏膜緊密連接蛋白相關基因mRNA相對表達量的影響

42 d 時，飼糧中添加蘆丁線性提高回腸黏膜中ZO-1和Mucin2 mRNA的表達量(PL<0.05)，且與對照組相比，添加500和1 000 mg·kg-1蘆丁可顯著提高回腸黏膜中Mucin2 mRNA表達量(P<0.05)，500 mg·kg-1蘆丁組回腸黏膜中ZO-1 mRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.05)。此外，飼糧中添加蘆丁有增加21 d回腸黏膜中Mucin2 mRNA(PQ=0.077)和42 d黏膜中CLDN2 mRNA(PL=0.058)表達量的趨勢。

2.6 不同水平蘆丁對肉雞回腸黏膜炎癥基因相對表達量的影響

如圖4所示，21 d時，飼糧中添加蘆丁使回腸黏膜中NF-κBmRNA表達量呈二次曲線降低(PQ<0.05)，且250和500 mg·kg-1蘆丁組回腸黏膜中NF-κBmRNA表達量顯著低于對照組(P<0.05)。42 d時，飼糧中添加蘆丁線性和二次曲線降低回腸黏膜中IL-2 mRNA的表達量(PL<0.05；PQ<0.05)，NF-κBmRNA表達量呈二次曲線下降(PQ<0.05)，且與對照組相比，蘆丁處理組可顯著降低回腸黏膜中IL-2 mRNA的表達量(P<0.05)，500 mg·kg-1蘆丁組回腸黏膜中NF-κBmRNA表達量顯著低于對照組(P<0.05)。此外，飼糧中添加蘆丁能夠線性降低42 d回腸黏膜中TNF-αmRNA表達量(PL<0.05)，但對Myd88和IFN-γmRNA的表達量無顯著影響(P>0.05)。

圖4 不同水平蘆丁對21 d(A)和42 d(B)肉雞回腸黏膜炎癥相關基因mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 不同水平蘆丁對肉雞腸道形態(tài)結構和腸屏障功能的影響

腸道是機體養(yǎng)分消化與吸收的主要場所，腸道形態(tài)結構指標，如腸道絨毛高度(VH)、隱窩深度(CD)及絨毛高度與隱窩深度比值(V/C)等，是衡量飼料轉化效率的重要指標[14-15]。在本試驗中，與對照組相比，飼糧中添加250和500 mg·kg-1蘆丁分別提高了21 d回腸V/C值和42 d回腸VH，這與馬紹航[16]發(fā)現(xiàn)的山銀花黃芩提取物(一種黃酮類物質)能夠顯著提高肉雞腸道VH和V/C值，增強肉雞對營養(yǎng)物質消化吸收功能的結果相似。Kamboh和Zhu[17]研究表明，染料木素和橙皮苷可顯著提高肉雞腸道中VH和VW，改善腸道形態(tài)結構。張佳琦等[18]研究也發(fā)現(xiàn)，日糧添加蘆丁能顯著提高仔鼠空腸VH和VW，改善斷奶仔鼠空腸絨毛形態(tài)。蘆丁含有獨特的黃酮多酚結構，它可以在小腸內(nèi)被吸收或與小腸內(nèi)源性蛋白質結合后對腸道組織發(fā)揮有益作用，防止腸道損傷[10, 19]，這可能是蘆丁能夠改善肉雞腸道形態(tài)結構的主要原因之一。Bcl-2和ki67能夠抑制細胞凋亡、參與細胞增殖調(diào)控，在組織器官生長發(fā)育過程中具有重要作用[20]。Bax是Bcl-2的同源基因，當Bax表達過量時自身可結合成同源二聚體，促進細胞凋亡[21]。ki67是細胞增殖的標志物。在本試驗中，與對照組相比，添加250 和1 000 mg·kg-1蘆丁分別提高了21和42 d回腸黏膜中Bcl-2 mRNA表達量，500 mg·kg-1蘆丁組顯著增加回腸黏膜中Bcl-2和ki67 mRNA的表達量，結合蘆丁對肉雞回腸V/C和VH的影響結果，提示飼糧中添加適宜劑量蘆丁對促進肉雞腸道絨毛生長和改善腸道結構具有積極作用。

腸上皮緊密連接結構(TJ)是構成腸道機械屏障結構的主要連接方式[22]，它是由大量功能性和結構性蛋白組成，包括OCLN、CLDN2和ZO-1等[23]。ZO-1是通過與其他蛋白質(CLDN和OCLN)的相互作用來保持腸道緊密連接的關鍵因素之一。OCLN和CLDN表達下降可直接破壞緊密連接結構的完整性，導致腸屏障功能障礙。在本試驗中，添加250和500 mg·kg-1蘆丁顯著提高了21 d回腸黏膜中ZO-1 mRNA的表達量，500 mg·kg-1蘆丁組42 d回腸黏膜中Mucin2和ZO-1 mRNA的表達量也顯著高于對照組，這與Gil-Cardoso等[24]研究相似，其結果發(fā)現(xiàn)，添加榭皮素可促進腸道中ZO-1和OCLNmRNA的表達量，保護腸道屏障結構的完整。Noda等[25]也證明，黃酮類化合物對腸道屏障功能具有促進作用。因此推測，飼糧中添加蘆丁可能通過增強腸道黏膜緊密連接蛋白的表達量來完善肉雞腸道屏障結構，維護腸道功能。

3.2 不同水平蘆丁對肉雞腸道黏膜免疫功能的影響

腸道黏膜免疫是機體抵御病原微生物入侵的第一道防御屏障，sIgA是其主要效應因子[26]。sIgA主要分布于黏液層由腸道漿母細胞分泌，是腸道黏膜免疫的核心，能夠保護腸上皮細胞免受損傷[27]。本試驗結果顯示，與對照組相比，飼糧中添加250、500和1 000 mg·kg-1蘆丁顯著提高21 d回腸黏膜中sIgA含量，而對42 d回腸黏膜中sIgA含量無顯著影響，這可能是由于肉雞前期的免疫系統(tǒng)暫未發(fā)育健全，添加蘆丁后能夠影響和促進肉雞免疫系統(tǒng)的發(fā)育，而隨著生長期的延長，肉雞免疫系統(tǒng)逐步發(fā)育成熟與完善，蘆丁對免疫系統(tǒng)的作用效果也逐漸減弱。

NF-κB介導的信號通路參與體內(nèi)多種反應，它是一種轉錄因子，參與炎癥過程中的調(diào)節(jié)[28-29]，當其過度表達時可誘導相關促炎因子的轉錄和合成[30]。TNF-α和IL-2是促炎性細胞因子，能夠誘導機體的炎癥反應，并受NF-κB轉錄水平的調(diào)控[31]。本試驗結果顯示，蘆丁處理組回腸黏膜中IL-2 mRNA表達量顯著低于對照組，且與對照組相比，飼糧中添加500 mg·kg-1蘆丁顯著降低21和42 d回腸黏膜中NF-κBmRNA表達量，因此推測，肉雞飼糧中添加蘆丁能夠通過抑制NF-κBmRNA的表達量，下調(diào)相關炎癥因子的表達從而對機體發(fā)揮抗炎作用。該結果與Yeh等[32]和Su 等[33]研究結果相似，即蘆丁能夠顯著抑制小鼠肺部或乳腺中NF-κBmRNA的表達，降低IL-1β、TNF-α、IL-6等多種促炎癥因子的水平，具有較強的抗炎作用。

3.3 不同水平蘆丁對肉雞腸道黏膜抗氧化的影響

抗氧化能力能夠反映機體的健康狀況，機體內(nèi)的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)共同參與調(diào)節(jié)自由基的生長與消除，抗氧化酶是一種存在于細胞環(huán)境中的蛋白質，它具有較強清除體內(nèi)自由基的活性作用。T-SOD、CAT和GSH-Px是抗氧化的關鍵酶，也是抗氧化系統(tǒng)中的重要組成部分[34]。T-SOD可維持機體氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡。T-AOC表示機體總抗氧化能力， MDA含量直接決定機體脂質過氧化程度，是機體評價脂質氧化損傷的重要指標，同時也可間接反映腸黏膜細胞的損傷程度[35]。在本試驗中，與對照組相比，添加250和500 mg·kg-1蘆丁顯著降低21 d回腸黏膜中MDA含量，500 mg·kg-1蘆丁組42 d 回腸黏膜中MDA含量顯著低于對照組，提示蘆丁能夠緩解腸道脂質氧化損傷。此外，500 mg·kg-1蘆丁組21 d回腸黏膜中T-AOC和GSH-Px活性及42 d T-SOD活性均顯著低于對照組。本試驗結果與Hassan 等[12]研究結果相似，其發(fā)現(xiàn)飼糧中添加蘆丁能夠顯著提高肉雞血清中SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量。張佳琦等[18]研究也顯示，蘆丁能夠顯著降低小鼠腸道中MDA含量，提高SOD活性。蘆丁因其結構含有豐富的酚羥基，可以通過抽氫反應產(chǎn)生較穩(wěn)定的苯氧自由基進而中止鏈式反應，同時活潑氫與機體內(nèi)自由基結合，及時清除機體內(nèi)過多的ROS，這可能與蘆丁能夠有效抑制肉雞腸道脂質過氧化，并通過增強酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)來提高肉雞的抗氧化能力的關鍵原因之一[11, 36]。

Nrf2在體內(nèi)抗氧化信號通路中可通過調(diào)下游相關抗氧化基因表達如HO-1、NQO1等來提高機體的抗氧化防御系統(tǒng)[37]。HO-1作為一種抗氧化酶在應激狀態(tài)下能夠保持機體細胞穩(wěn)定性，當其表達上調(diào)時有助于增強機體抗氧化功能，緩解組織氧化損傷[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，21 d時，蘆丁處理組顯著提高回腸黏膜中HO-1 mRNA的表達量，添加250 和500 mg·kg-1蘆丁分別提高了回腸黏膜中Nrf2和NQO1 mRNA的表達量；42 d時，500 mg·kg-1蘆丁組回腸黏膜中Nrf2和HO-1 mRNA的表達量顯著高于對照組，故推測飼糧中添加500 mg·kg-1蘆丁可能通過增強Nrf2信號通路來調(diào)節(jié)肉雞腸道的抗氧化功能，這與王斌等[39]研究發(fā)現(xiàn)灌胃蘆丁(100 mg·kg-1)可通過Nrf2/HO-1信號通路緩解小鼠腎氧化應激損傷，提高其抗氧化功能的結果一致。同時，本試驗結果也發(fā)現(xiàn)，與500 mg·kg-1蘆丁組相比，1 000 mg·kg-1蘆丁組42 d肉雞回腸黏膜中Nrf2 mRNA的表達量顯著下降，這與Féres等[40]研究發(fā)現(xiàn)，添加2 000 mg·kg-1蕓香苷(蘆丁含量為(76±3)%)可對機體產(chǎn)生一定副作用的結果相似，但其具體機制尚需要進一步研究。

4 小 結

飼糧中添加蘆丁可改善肉雞回腸形態(tài)結構、提高腸道免疫、屏障功能并通過增強回腸組織中Nrf2信號通路增強其抗氧化能力。在本試驗條件下，綜合蘆丁對肉雞全期的作用效果，推薦蘆丁添加量為500 mg·kg-1。