表達雞傳染性法氏囊病病毒VP2基因的重組火雞皰疹病毒的構建及生物學特性分析

李曉涵，楊伏春，劉 芮，高 立，崔紅玉，張艷萍，劉長軍，祁小樂，王笑梅，高玉龍，李 凱

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，獸醫生物技術國家重點實驗室 禽免疫抑制病創新團隊，哈爾濱 150069)

雞傳染性法氏囊病(IBD)是由雞傳染性法囊病病毒(IBDV)引起的主要感染雛雞的一種急性、高度接觸性和免疫抑制性傳染病[1-3]。該病于1957年首發于美國甘布羅地區，又被稱為“甘布羅病”。60多年來，該病一直威脅著養禽業的發展，世界動物衛生組織認為IBD已成為影響社會經濟的重要疾病[4-6]。抗原變異、免疫抑制，特別是超強毒株(vvIBDV)的出現，使得該病的防控形勢更加嚴峻[7-9]。IBDV基因組由兩個雙股RNA節段組成，分別為A節段和B節段。A節段編碼的VP2蛋白構成病毒的外衣殼，是IBDV的主要結構蛋白。VP2可以誘導機體產生中和抗體，是IBDV主要的宿主保護性抗原[10]。目前，IBD主要通過傳統活疫苗和滅活疫苗進行防控，但活疫苗免疫效果易于受到母源抗體干擾，中毒力活疫苗會造成接種雞法氏囊損傷，引起免疫抑制；滅活疫苗免疫持續期較短，需多次加強免疫[11]。因此研制安全性好、不受母源抗體干擾、免疫持續期長的新型基因工程疫苗對IBD的防控具有重要意義。

雞馬立克病(MD)是由馬立克病病毒引起的一種雞的傳染性腫瘤病，以淋巴組織增生和腫瘤形成為特征，該病是雞的主要疾病之一，也是國內外20世紀50年代以來最受重視的雞病[12-14]。火雞皰疹病毒(HVT)在國內外被廣泛用于MD的防控。HVT基因組較大，可供外源基因插入的復制非必需區多，是構建重組活載體疫苗的理想載體[15-18]。本研究利用HVT多片段黏粒拯救系統和LR重組技術，將IBDVVP2基因表達框架插入HVT基因組，構建了表達VP2基因的重組病毒rHVT-VP2，并對其體外生物學特性進行了分析，為研制IBD重組HVT活載體疫苗奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株和病毒

pCI載體由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所保存；pENTR入門載體、克隆有Kan/ccdB基因的重組黏粒H3-Kan/ccdB、克隆有HVT-FC126株基因組片段的5個重組黏粒H1、H2、H3、H4、H5由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所構建并保存。大腸桿菌EPI300株購自EPICENTRE公司；IBDV超強毒株HLJ0504株由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所鑒定并保存。

1.2 主要試劑

常規PCR反應酶、限制性內切酶、連接酶購自TaKaRa公司；Gateway?LR ClonaseTMII Enzyme Mix和磷酸鈣轉染試劑盒均購自Invitrogen公司；質粒中提試劑盒購自QIAGEN公司；細胞裂解液，購自碧云天公司；細胞培養基及胎牛血清購自Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)購自BioFroxx公司；鼠抗兔IgG-FITC、IRDye-800標記的羊抗兔IgG，購自Licor公司；VP2單克隆抗體(MAb)由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所制備并保存。

1.3 引物的設計與合成

根據IBDV超強毒HLJ0504株VP2基因序列，利用Oligo 7.0軟件設計擴增VP2基因的引物VP2F：5′- GAA TTC GCC ACC ATG ACA AAC CTG CAA GAT CAA ACC -3′和VP2R：5′- ATC GAT TCA CCT CCT TAA GGC CCG AAT TAT GTC -3′，預期擴增片段長度為1.4 kb。根據HVT FC126株基因組序列設計1條引物H45R：5′- ATA AAT AAA ACA CAG TAA CCG TTA-3′，VP2F和H45R組成1對引物，用于鑒定重組黏粒及重組病毒，預期擴增片段長度為1.6 kb。引物均由吉林省庫美生物公司合成。

1.4 表達VP2基因的重組粘粒的構建及鑒定

以IBDV HLJ0504株基因組為模板，利用引物VP2F、VP2R經RT-PCR擴增獲得VP2基因。將純化后的VP2基因經EcoRⅠ、KpnⅠ酶切后克隆入pCI載體，構建重組質粒pCI-VP2。將該重組質粒經BglⅡ、BamHⅠ酶切后獲得VP2表達框架，將其克隆入pENTR入門載體的BglⅡ、BamH1位點，獲得含有VP2表達框架的重組入門質粒pENTR-VP2。將pENTR1-VP2與重組黏粒H3-Kan/ccdB均稀釋至300 ng·μL-1，各取1與2 μL的Gateway LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix混合，置于室溫作用1 h。將反應產物轉化大腸桿菌EPI300并涂布在氯霉素抗性LB平板上，37 ℃過夜培養。挑取平板上的單個菌落加入氯霉素抗性LB液體培養基中擴大培養，提取黏粒，用引物VP2F、H45R經PCR鑒定重組黏粒是否插入VP2表達框架，并對PCR產物測序鑒定，鑒定正確的重組黏粒命名為H3-VP2。

1.5 表達VP2基因的重組HVT的拯救及鑒定

利用質粒提取試劑盒提取VP2重組黏粒H3-VP2以及其他4個克隆有HVT基因組片段的親本黏粒H1、H2、H4、H5，通過磷酸鈣法將5個經SbfⅠ酶切線性化的黏粒共轉染CEF細胞，4 ～5 d后，觀察轉染的細胞是否出現HVT特異性蝕斑病變。出現蝕斑后收獲病毒，并在CEF細胞中連續傳20代。利用試劑盒提取第5、10、15、20代重組病毒的基因組DNA，同時設親本病毒基因組DNA對照，利用引物VP2F/H45R經PCR鑒定，并測序鑒定，鑒定正確的重組病毒命名為rHVT-VP2。

1.6 重組病毒rHVT-VP2表達VP2蛋白的檢測

將第20代重組病毒rHVT-VP2與親本病毒分別接種CEF，培養3～4 d出現蝕斑病變后，用無水乙醇固定細胞，并以VP2蛋白MAb(1∶400)作為一抗，以FITC標記的羊抗鼠IgG(1∶200)作為二抗，采用間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定VP2蛋白的表達。同時，以VP2蛋白MAb(1∶500)作為一抗，以IRDye-800標記的羊抗鼠IgG(1∶10 000)作為二抗，采用蛋白質印跡試驗(Western blot)鑒定VP2蛋白的表達。以上試驗均以親本病毒接毒的CEF作陰性對照。

1.7 重組病毒rHVT-VP2體外生長曲線的測定

將重組病毒rHVT-VP2和親本病毒HVT-FC126株以100個蝕斑形成單位(PFU)的劑量接種于48孔板中的CEF上，感染后每隔24 h收集含毒細胞，持續至感染后144 h。將各個時間點所收集病毒接種CEF，測定各時間點病毒液的蝕斑數目，繪制生長曲線，分析重組病毒rHVT-VP2和親本病毒在CEF中的體外復制特性。

1.8 重組病毒rHVT-VP2免疫原性檢測

取1日齡SPF雞40只，分成4組，每組10只。組1和組2分別以4 000 PFU·只-1劑量頸部皮下接種重組病毒rHVT-VP2和親本病毒HVT-FC126；組3和組4不接種，作為對照組。免疫后28 d，組1～組3試驗雞分別采血，分離血清，檢測IBDV中和抗體[11]；組1～組3試驗雞經滴鼻、點眼途徑接種IBDV超強毒HLJ0504株(0.1 mL·只-1)，組4不攻毒作為健康對照。攻毒后觀察7 d，統計各組雞存活情況。

2 結 果

2.1 表達VP2基因的重組黏粒的構建及鑒定

將RT-PCR擴增獲得的VP2基因插入到pCI載體，構建獲得重組真核表達質粒pCI-VP2。通過酶切獲得VP2基因表達框架并將其克隆至pENTR入門載體，構建獲得重組入門質粒pENTR-VP2。通過LR重組反應，使VP2表達框架替換H3-Kan/ccdB中的Kan/ccdB篩選基因并克隆至HVT重組黏粒H3中，構建獲得在HVT基因組UL45和UL46基因之間插入VP2基因表達框架的重組黏粒H3-VP2。用VP2F、H45R對重組黏粒進行PCR及測序鑒定，結果顯示，獲得的PCR產物長度為1.6 kb(圖1)，測序結果顯示，PCR產物包含VP2基因和VP2表達盒下游polyA序列。而陰性對照樣品(親本黏粒H3)無VP2基因插入序列，PCR結果為陰性。以上結果表明，重組黏粒H3-VP2構建正確。

M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1.H3-VP2; 2.H3; 3.ddH2O

2.2 重組病毒rHVT-VP2的拯救及PCR鑒定

將重組黏粒H3-VP2與其他4個克隆有HVT基因組片段的重組黏粒H1、H2、H4、H5共轉染CEF，轉染后4 d出現HVT特異性蝕斑病變，拯救獲得重組病毒rHVT-VP2。將重組病毒在CEF上進行連續傳代，每隔5代提取病毒基因組DNA進行PCR鑒定及測序。結果表明，PCR產物長度均為1.6 kb，與預期結果相符(圖2)，測序結果顯示，插入序列與預期一致。親本病毒HVT-FC126株基因組DNA擴增結果為陰性。以上結果表明，VP2基因正確插入HVT基因組中且能夠穩定存在，重組病毒rHVT-VP2構建正確。

M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1.rHVT-VP2_F05; 2.rHVT-VP2_F10; 3.rHVT-VP2_F15; 4.rHVT-VP2_F20; 5.HVT-FC126; 6.ddH2O

2.3 重組病毒rHVT-VP2表達VP2蛋白的鑒定

將第20代重組病毒rHVT-VP2與親本病毒分別接種CEF，培養3～4 d出現蝕斑病變后進行IFA和Western blot，檢測VP2蛋白表達情況。結果顯示，重組病毒rHVT-VP2感染的細胞與VP2單克隆抗體反應，可見綠色熒光信號；HVT親本病毒以及沒有接毒的對照細胞未見熒光(圖3)。Western blot試驗結果顯示，重組病毒rHVT-VP2感染的細胞中可以檢測到VP2蛋白的表達，表達蛋白大小約50 ku，大小與預期相符(圖4)。HVT親本病毒以及沒有接毒的對照細胞未檢測到VP2蛋白表達，對照蛋白β-actin在重組病毒rHVT-VP2、親本病毒以及未接毒對照中均檢測到表達。以上結果表明重組病毒rHVT-VP2可在感染細胞中穩定表達VP2蛋白。

圖3 間接免疫熒光試驗檢測重組病毒(rHVT-VP2)和親本病毒(HVT-FC126)感染CEF中VP2蛋白表達情況

M.蛋白質相對分子質量標準；1.HVT-FC126;2.rHVT-VP2;3.細胞對照

2.4 重組病毒rHVT-VP2體外復制動力學分析

將重組病毒rHVT-VP2和親本病毒HVT-FC126以100 PFU接種CEF，每隔24 h收集細胞，滴定病毒的體外復制動力學曲線。結果顯示，重組病毒rHVT-VP2與親本病毒HVT-FC126均在感染后120 h復制滴度達到最高峰，分別為1.96×106PFU·mL-1和2.10×106PFU·mL-1，感染CEF后各個時間點重組病毒的滴度與親本病毒均無明顯差異(P>0.05)(圖5)。以上結果表明重組病毒rHVT-VP2株在CEF中的復制特性與親本病毒一致。

圖5 重組病毒(rHVT-VP2)和親本病毒(HVT-FC126)在CEF上的復制動力學曲線

2.5 重組病毒rHVT-VP2免疫原性分析

將重組病毒rHVT-VP2以4 000 PFU·只-1劑量接種1日齡SPF雞，免疫后28 d采血，分離血清，檢測IBDV中和抗體。結果如圖6所示，重組病毒rHVT-VP2免疫雞血清中IBDV中和抗體平均滴度可以達到26.4，免疫親本病毒HVT-FC126的雞以及不免疫對照雞IBDV中和抗體為陰性。以上結果表明，重組病毒rHVT-VP2免疫雛雞后誘導產生了良好的免疫反應。免疫后28 d，對免疫組和對照組分別攻毒，結果顯示免疫重組病毒rHVT-VP2的10只雞攻毒IBDV后有9只雞健康存活，親本病毒HVT-FC126免疫組和對照組攻毒IBDV后均表現出明顯臨床癥狀，10只雞死亡8只(圖7)。以上結果表明，重組病毒rHVT-VP2免疫后對IBDV強毒攻擊能夠提供90%的免疫保護。

圖6 重組病毒rHVT-VP2免疫后IBDV中和抗體檢測

圖7 重組病毒rHVT-VP2免疫雞攻毒IBDV強毒的存活率

3 討 論

IBD是一種嚴重危害養禽業的高致死性和免疫抑制性傳染病，自1957年發現以來，已有60多年歷史[1-3]。目前，用于預防IBD的疫苗主要是傳統活疫苗和滅活疫苗，其中弱毒活疫苗免疫效果易于受到母源抗體干擾，中毒力活疫苗副作用大，能夠引起接種雞法氏囊損傷和免疫抑制，影響其他疫苗免疫保護效果[19]。全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗不適于早期免疫且免疫持續期短，需要多次加強免疫，造成養殖環節免疫負擔過重[20]。因此，研制安全性好、適于孵化場出殼免疫且免疫持續期長的新型疫苗對我國IBD的防控意義重大。活載體疫苗誘導機體產生的免疫比較廣泛，可以同時表達多種抗原，制成多價或多聯疫苗，是當今和未來疫苗研發的主要方向之一[16]。HVT作為一種皰疹病毒，具有基因組大、復制非必需區多且能容納較大外源片段的優勢，是研制活載體疫苗的理想載體。然而，目前我國還沒有自主知識產權的IBD重組HVT活載體疫苗。

以往構建重組HVT大多采用同源重組法或細菌人工染色體(BAC)法[21]。同源重組法以及近年來新興的CRISPR/Cas9方法在構建重組病毒過程中均需要引入篩選標記基因，且需要蝕斑純化，難以短時間內獲得純凈的重組病毒，多次細胞傳代純化蝕斑也會影響重組病毒免疫原性。BAC技術雖然能夠在細菌中利用Red/ET重組技術對病毒基因組進行改造，進而拯救重組病毒，但后期需要采取一定的手段去除殘留的BAC序列[13]。本研究在拯救表達VP2基因的重組HVT時采用了新型Fosmid黏粒拯救系統，該系統與BAC相比，具有穩定性好、無偏向性、構建周期短等諸多優點。由于HVT基因組分為不同節段克隆入黏粒中，在構建重組病毒時便于對不同的基因組片段分別進行操作，因此該系統更加適于插入多個外源基因的重組病毒的構建。

本研究將IBDV保護性抗原VP2基因表達框架插入HVT基因組UL45、UL46基因之間，構建獲得重組病毒rHVT-VP2。rHVT-VP2在CEF傳代20代后仍然能夠高效表達VP2蛋白，且插入序列未見突變發生，表明該重組病毒具有良好的遺傳穩定性。體外復制動力學曲線顯示，rHVT-VP2在CEF上具有良好的復制能力，復制特性與親本病毒無顯著差異，表明VP2基因的插入不會對親本病毒的復制造成顯著影響。將重組病毒rHVT-VP2免疫雛雞后可以誘導產生IBDV中和抗體，且能夠對IBDV超強毒株攻毒造成的死亡提供90%免疫保護，表明該重組病毒具有良好的免疫原性。以上研究表明，重組病毒rHVT-VP2有望開發為一種預防IBD的新型疫苗。

4 結 論

本研究應用HVT新型Fosmid黏粒拯救系統，構建獲得表達IBDV保護性抗原VP2的重組病毒rHVT-VP2。rHVT-VP2插入序列正確，能夠穩定表達VP2蛋白，在CEF上具有良好的復制能力，免疫雞后能夠誘導產生IBDV中和抗體，并對IBDV強毒攻擊提供良好免疫保護。重組病毒rHVT-VP2的成功構建為IBD重組HVT活載體疫苗的研制奠定了基礎。