吉林省肉牛冠狀病毒感染狀況調查及分析

孫飛雁，葉京飛，魏 宇，王子賢，張金玉，邴麗媛，孟婷婷，王 帥，趙立峰，孫 亮，郭 利*

(1.吉林農業科技學院，吉林 132101； 2.中國農業科學院特產研究所，長春 130122；3.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118； 4.吉林大學動物科學學院，長春 130012；5.吉林省動物疫病預防控制中心，長春133000)

牛冠狀病毒病是由牛冠狀病毒(bovine coronavirus，BCoV)引起的犢牛腹瀉、呼吸道為主要臨床特征的牛病毒性傳染病[1]。Mebus等[2]最早于1972年在牛腹瀉病例的糞便中分離到BCoV。BCoV屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬單股正鏈RNA病毒，有囊膜，具有多形性，是目前自然界已知的最大RNA病毒[3]，分屬于冠狀病毒屬中的β類。冠狀病毒屬分為α、β、γ、δ類，其中，β類主要感染哺乳動物[4]。BCoV與人冠狀病毒OC43(HCoV-OC43)的基因具有較高相似性，是否存在跨種傳播仍需進一步研究。BCoV編碼5種主要結構蛋白：核衣殼蛋白(N)、嵌膜蛋白(M)、血凝素-酯酶蛋白(HE)、纖突蛋白(S)、次要嵌膜蛋白E。HE蛋白由兩個單體經二硫鍵連接形成，可發揮乙酰酯酶的生物學活性，參與病毒的早期吸附，引起紅細胞的凝集[5]。HE蛋白可以引發阻斷病毒附著的中和抗體，又具有感染性，對免疫及疫苗研究具有重要意義[6]。S蛋白包含S1和S2兩個亞基，S1負責病毒、宿主細胞的識別與結合，而S2與病毒細胞的融合有關[7]。S蛋白能誘導機體產生免疫應答，從而產生中和抗體，因此在病毒的附著及進入宿主細胞內具有重要作用[8]。牛冠狀病毒病可發生于各年齡段牛，春冬季發病率最高，犢牛腹瀉和呼吸道癥狀明顯，呼吸困難，嚴重者出現血便，直至死亡[9]。成年牛呼吸道癥狀更為突出，或呈隱性感染，持續帶毒排毒，在牛群內迅速傳播[10-11]。近兩年發病逐漸增多，表現在3～4月齡犢牛死亡率增加，呼吸道癥狀嚴重，偶有猝死現象，個別牛場全群發病，且與呼吸道及腹瀉等病毒病混合感染，病情更加復雜，給牛場帶來巨大經濟損失。本研究對吉林省東中西地區的牛場進行了BCoV的抗原和抗體的流行病學調查，了解掌握BCoV在調查地區的流行情況，血清抗體陽性率1.08%，抗原陽性率21.10%。并對流行毒株進行了測序分析，調查地區主要流行毒株與中國四川株親緣關系最近，為吉林省牛冠狀病毒病的發病、流行情況及疫病防控提供了科學數據。

1 材料與方法

1.1 樣品

從吉林省德惠市、延吉市、雙遼市、九臺區、柳河縣、伊通縣、東遼縣、農安縣、前郭縣、鎮赍縣、吉林市、雙陽區12個市(縣、區)的規模化牛場、養殖合作社及家庭養殖戶共計462頭牛采集了497份臨床樣品，包括糞便、鼻拭子、咽拭子、血液、乳液及肺等組織樣品。組織樣品主要采自發病牛。

從吉林省東中西部地區的前郭縣、東豐縣、公主嶺市、長嶺市、安定鎮、德惠市、蛟河市、柳河縣、扶余市9個市(縣、區)的規模化牛場、養殖合作社及家庭養殖戶等45個場點于春防與秋防期間采集了1 298頭成年牛和犢牛的牛血清樣本。除組織樣品采集自臨床上表現呼吸急促，咳喘，腹瀉，并伴有血痢疾的病死牛外，其余樣品均為隨機采樣(血清樣本由吉林省動物疫病預防控制中心提供)。

1.2 主要試劑

BCoV標準陽性質粒、BCoV鑒定引物均由中國農業科學院特產研究所分子生物學重點實驗室保存。瓊脂糖購自Promega公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術公司；膠回收試劑盒購自OMEGA公司；BCoV抗體檢測試劑盒(MM-154801)購自青島凱泰克工貿有限公司。

1.3 主要儀器

PCR 擴增儀：美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；酶標儀Synergy H1：美國BioTeke公司。

1.4 樣品處理

將采集的組織樣品進行液氮研磨處理，加入PBS中進行混勻，糞、鼻、咽喉拭子類棉簽浸入含1%雙抗的DMEM拭子液中，所有樣品充分混勻后離心去沉淀留液體備用。

1.5 引物設計與合成

根據NCBI數據庫中獲得的全長序列(GenBank登錄號：KX982264.1)，選擇相對保守區域N基因，利用軟件Primer 5.0設計一對N基因的檢測引物、1對HE全基因擴增引物、6對S全基因擴增引物(表1)。引物由長春庫美生物有限公司合成。

表1 BCoV N、HE和S基因引物信息

1.6 病毒RNA的提取與反轉錄

將462份樣品(每牛1份)分別提取總RNA后進行反轉錄，具體操作見試劑盒說明書，反轉錄后cDNA均保存于-80 ℃冰箱備用。

1.7 納米PCR的檢測

利用本實驗室已建立的對BCV特異，與BRV、BVDV、IBRV、BRSV、BPIV3均無交叉反應的BCoV nano-PCR 新型核酸檢測方法[12]，對臨床樣品進行PCR擴增，反應體系及條件如下，總體系：25 μL，12.5 μL的2×HiFi Taq高保真預混PCR反應體系，409 bp大小的N基因檢測上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，納米粒子1.5 μL，去離子水補至25 μL。反應條件：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s，共35個循環，最后72 ℃總延伸5 min。PCR之后進行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，得到的陽性產物，擴增產物片段大小為409 bp，純化后送庫美生物公司測序分析。

1.8 HE、S全基因的擴增

以上述提取的病毒核酸反轉錄后的cDNA為模板，通過上述表1中S基因、HE基因的全基因擴增引物進行PCR分段擴增，擴增過程中各段引物的退火溫度Tm值，則根據引物不同進行調整，PCR反應體系：總體系為25 μL，12.5 μL的2×HiFi Taq高保真預混PCR反應體系，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，去離子水補至25 μL。PCR反應條件：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,55～58 ℃ 30 s,72 ℃ 50～80 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，并按照瓊脂糖凝膠RNA/DNA回收試劑盒說明書進行純化,純化后送至庫美生物公司測序分析。測序結果使用DNAMAN軟件進行拼接，并使用Megalign軟件進行比對分析建立系統發育樹。

1.9 牛冠狀病毒病的抗體檢測

對2020-2021年春防與秋防期間采集的1 298份牛血清樣本，應用ELISA 抗體試劑盒進行BCoV抗體檢測，檢測前將所有的試劑盒組分從冰箱中取出放置室溫下3～4 h后再使用，具體操作詳見說明書。

2 結 果

2.1 BCoV病原核酸檢測結果

對462份臨床樣品提取核酸后，使用特異性引物進行納米PCR擴增，結果擴增出目的片段為409 bp大小的樣品有97份， 部分BCoV陽性樣品瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。

M.DNA相對分子質量標準；N.陰性對照；1～3.肺組織樣品；4～6.鼻拭子；7、8.糞拭子；9、10.腸組織樣品

對各個地區的462份臨床樣品進行檢測后可知，共有97份陽性樣品，總體陽性率為21.10%，吉林省東、中、西部地區均有BCoV病原的存在，從平均陽性率上來看，東部地區陽性率最高，其次為西部地區，最后為中部地區。東部地區采集的122份臨床樣品主要包括延吉市81份(陽性率11.11%)和柳河縣41份(陽性率68.29%)，該地區平均陽性率為30.33%。西部地區的135份臨床樣品主要來自于雙遼市、伊通縣、前郭縣、鎮赍縣四個地方，其中雙遼市31份樣品中有18份陽性樣品，陽性率最高，達58.06%；伊通縣次之，44份樣品中檢出9份為陽性，陽性率為20.45%；30份前郭縣樣品和30份鎮赍縣樣品均未檢出BCoV；西部地區的平均陽性率為20.00%。最后為中部地區，平均陽性率為16.10%。中部地區的205份臨床樣品包括50份東遼縣樣品，陽性率最高，為30.00%；34份雙陽區樣品陽性率次之，為29.41%；23份九臺區樣品和23份德惠市樣品，陽性率均為17.39%；農安縣的51份樣品和吉林市的24份樣品陽性率均為0%。吉林省各地區牛冠狀病毒病原核酸陽性率結果如表2所示。

表2 吉林省各地區牛冠狀病毒病原核酸檢測結果

2.2 BCoV的HE、S基因序列擴增

對BCoV特異性引物檢測出的陽性樣品進行測序比對發現序列一致。以陽性樣品的cDNA為模板使用普通PCR方法進行HE、S基因的全長擴增，結果所擴增的HE序列比對后均一致，由于S基因因變異性高，僅完整擴增出一條，經瓊脂糖凝膠電泳圖可知(圖2)，獲得了預期目的片段。

M.DNA相對分子質量標準；1.S1-894 bp；2.S2-887 bp；3.S3-1 108 bp；4.S4-756 bp；5. S5-748 bp；6. S6-813 bp；7. HE-1201 bp

2.3 BCoV的HE、S基因序列測定及遺傳進化分析

將PCR擴增產物使用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒對目的片段進行回收純化，送至測序公司。測序成功的序列HE、S1-S6分別應用DNAMAN軟件進行拼接，HE、S兩條序列均拼接成功。登錄NCBI網站，分別將HE、S序列進行blast比對，結果表明其與BCoV的相似性高達99%，證實所擴增的序列確實為BCoV的HE、S序列。

應用DNAStar軟件中的Megaline，將HE、S基因序列同GenBank上傳的30條國內外BCoV序列進行同源性分析及遺傳進化樹的構建。發現此研究中的HE基因序列同GenBank中不同毒株序列的核苷酸相似性均較高(96.20%～99.60%)，其中，與中國四川株(MW711306.1)相似性最高，相似性為99.60%；與美國經典株Mebus株相似性為96.90%。通過構建進化樹發現，此研究中的BCoV-JL的HE基因序列與中國四川株(MW711306.1)親緣關系最近，位于同一分支，并與另外3株中國四川株、1株中國青海株(MW711309.1、MH475914.1、MN982191.1、MW711319.1)聚為一小分支，親源關系較近(圖3、4)。S基因同GenBank中不同毒株序列的核苷酸相似性均較高(89.50%～99.10%)，其中，與中國四川株(MN982198.1、MW711287.1、MN982199.1)相似性均達99%以上，與美國經典株Mebus株相似性為89.90%。通過構建遺傳進化樹發現，此研究中的BCoV-JL株與中國河北株(MK903506.1)距離最近，并與中國四川株(MN982198.1、)MN982199.1、MW711287.1)中國新疆株(KU886219.1)聚為一小分支(圖5、6)。

圖3 HE基因核苷酸同源性

▲.本研究擴增的毒株；△.與所擴增的毒株親緣關系相近的毒株

圖5 S基因核苷酸同源性

▲.本研究擴增的毒株；△.與所擴增的毒株親緣關系相近的毒株

2.4 牛冠狀病毒病的抗體情況

通過調查吉林省各地區1 298份血清樣品的BCoV的抗體水平發現：吉林省各地區BCoV的總體抗體陽性率為1.08%，東中西部平均抗體陽性率為1.39%,其中東、西、中部地區的陽性率分別為2.50%、1.10%、0.56%，結果見表3。

表3 吉林省各地區牛冠狀病毒病抗體情況

3 討 論

牛冠狀病毒(BCoV)在全球范圍內流行，該病是牛呼吸道疾病綜合征(BRDC)重要的病毒性病原之一[13-15]，可引起包括嚴重的呼吸道病和消化道腹瀉癥狀，可導致病牛死亡，目前缺少有效的防制手段。自1990年我國學者姚火春等[16]首次發現牛冠狀病毒病后,牛冠狀病毒在我國各省份牛臨床樣本中陸續檢出[17-21]。近兩年在臨床腹瀉和呼吸道疫病的臨床樣本中，牛冠狀病毒的檢測逐年增加。2020年以前，吉林省中部地區牛呼吸道及腹瀉樣本核酸檢測以牛病毒性病毒(BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(BHoV-1)和牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)較為常見，以BVDV最多[22-24]。2020年以后，在吉林省各個地區均有大量臨床樣檢測到BCoV，或者BCoV與其他病毒混合感染的情況，混合感染的牛場犢牛病死率更高，總體來看，吉林省各地區均存在牛冠狀病毒的感染情況，BCoV的流行主要集中在吉林省的東部地區，中部地區和西部地區感染率稍低。2020年冬季，吉林雙遼某牛場規模化犢牛因BCoV單純感染，導致3～4月齡犢牛死亡率接近70%。吉林四平某規模化牛場因BCoV與BVDV混合感染導致新生犢牛死亡率高達76.8%，吉林豐滿區某家庭型養牛戶6只牛犢5頭死亡，損失慘重。本研究調查顯示，急性發病期牛臨床剖檢肺部、心臟及腸道病變嚴重，且可形成毒血癥，侵襲動物機體各組織臟器，同時鼻拭子及糞便中均可檢測到病毒。BCoV 的HE蛋白的單克隆抗體在體外有效中和了BCoV感染性，并在體內保護牛的腸上皮免受病毒感染[25]，與S蛋白有相似功能，在誘導BCoV感染的保護作用中發揮重要作用。另外BCoV 的S蛋白參與受體識別、宿主特異性、抗原多樣性和免疫原性[26]。其基因序列是可變的，該蛋白的突變與病毒抗原性、病毒致病性、宿主范圍和組織取向的改變有關[27]，因此對吉林省內BCoV流行毒株的HE、S基因進行了分析，其序列同GenBank中29株代表性毒株序列分析結果顯示，不同毒株序列的核苷酸相似性均較高，相似性均達90%以上，與中國四川株、河北株親緣關系最近，處于同一分支，與美國經典株Mebus株親緣關系較遠，屬于國內流行毒株。

該病入秋以后陸續發生，冬春兩季高發，與抗原檢測的陽性率相比，牛血清樣品中BCoV抗體陽性率較低，分析原因可能與采樣時間有關，部分血清采集自發病牛場，處于疫病急性期，血清抗體滴度低，一部分采集自9月份，可能原因為春季疫病流行過后抗體持續期時間較短導致，但未見有相關研究文獻報道，是否為抗體陽性率低的原因尚待進一步研究分析。后續將對病原學陽性地區和陽性牛群進行重點采樣，進行血清流行病學檢測，以進一步評估BCoV的流行分布情況， 支撐對BCoV的流行病學調查及綜合防控的理論指導。

新冠疫情的突然暴發，對養殖業行業也產生了深遠影響，非洲豬瘟暴發之后，畜牧業動蕩，產業格局正在發生變化。吉林省是我國肉牛業大省，是東北肉牛優勢產業帶的核心，肉牛業為吉林省畜牧業支柱產業之一。雖然我國養牛業發展迅速，牛存欄數量和牛肉消費量位于世界前列水平，但肉牛養殖水平整體落后，科學研究技術水平相對滯后，尤其疫病研究起步晚，可用于支持產業的發展的生物制品少，重視度不夠。近年來規模化養殖場逐漸增多，但標準化科學養殖體系尚未形成，疫病防控監管力度不夠，防病意識薄弱，尤其以牛呼吸道疾病問題突出，本病秋冬兩季發病率高，死亡率也呈上升趨勢，嚴重制約產業的發展。本研究對吉林省中部地區BCoV流行情況進行了全面調查，豐富了牛冠狀病毒的流行病學調查數據，為指導牛冠狀病毒的防控工作奠定了基礎，為制定和指導牛冠狀病毒的防控提供科學依據。

4 結 論

吉林省地區牛冠狀病毒已廣泛流行與傳播，2021—2022年間，平均感染率為21.10%，犢牛更易感，多發病于冬春季節，東部地區屬于高發，屬于國內流行毒株。