熱休克蛋白HSP90B1影響牛病毒性腹瀉病毒復制的研究

陳俊貞，權 冉，付 強，葛麗娟，袁圓圓，張成遠，李建林，史慧君

(新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)與豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、羊邊界病病毒(border disease virus，BDV)同屬于黃病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒屬(Pesztivirus)[1]，是牛病毒性腹瀉/黏膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD)的主要病原，易感動物有牛、羊、駱駝等[2]。BVDV感染后會損傷機體的呼吸和生殖系統[3]，且病毒會攻擊免疫系統，使機體產生免疫抑制[4]，隨后出現繼發感染，對組織、器官等造成嚴重損傷。近年來，隨著畜牧業的快速發展，進出口運輸頻繁，促進了BVDV的傳播，對畜牧養殖業的健康發展造成嚴重危害，并且對相關生物制品的安全性產生了不利影響。BVDV病毒的致病機制復雜，感染范圍較廣[5]，明確該病毒的感染機制可以為預防和治療BVD提供高效的方法和新的思路。

熱休克蛋白90 β家族成員1(heat shock protein 90 beta family member 1，HSP90B1)是一種由內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)誘導的蛋白[6]，屬于熱休克蛋白90(heat shock protein 90 kDa，HSP90)家族，在蛋白折疊和質量控制中發揮關鍵作用[7]，對Ca2+穩態、ERS以及宿主防御有重要影響[7-8]。HSP90家族的分子伴侶活性對于病毒蛋白的組裝、成熟和維持都有重要作用，如在麻疹和尼帕病毒的L聚合酶折疊中的作用[9]，并且能夠參與到柯薩奇病毒、脊髓灰質炎病毒和鼻病毒等小核糖核酸病毒的衣殼加工和組裝[10]。有研究顯示，調控HSP90B1表達可以抑制黃病毒的復制，包括登革熱病毒和寨卡病毒[11]，能夠導致人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染細胞中CD4受體的表達顯著增加[12]，HSP90B1蛋白表達的差異可能是PEDV致病性差異的原因之一[13]，還有研究發現病毒糖蛋白E2能夠激活ERS反應并誘導HSP90B1的轉錄，敲低HSP90B1能夠抵消E2的抗細胞凋亡作用[14]。課題組以往研究使用BVDV感染胎牛腎細胞(Madin-Darby bovine kidney，MDBK)細胞后進行蛋白組學分析，結果與空白組相比HSP90B1極顯著性差異表達，以此推測HSP90B1可能是影響BVDV復制的關鍵基因之一，使用BVDV感染MDBK細胞后，通過蛋白和mRNA水平檢測了HSP90B1的表達，再利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除MDBK細胞的HSP90B1基因，構建HSP90B1 KO細胞，感染BVDV后，通過免疫熒光，qRT-PCR，病毒滴度以及CPE檢測病毒的復制情況，結果顯示BVDV感染MDBK細胞后，HSP90B1的蛋白水平和mRNA的轉錄水平均顯著性上升，敲除MDBK細胞的HSP90B1基因能夠顯著性抑制BVDV的復制，為研究BVDV的致病機制以及BVD的綜合防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒、質粒及細胞

BVDV TC分離株由新疆農業大學動物醫學學院傳染病實驗室冉多良教授惠贈[15]；pSPAX2、pMD2.G、lentiCRISPR v2、pLenti-GFP質粒購自Addgene公司；胎牛腎細胞和人胚腎293T細胞(Human embryo kidney 293T，HEK-293T)購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2 主要試劑

兔抗GRP94抗體(bs-0194R)購自北京博奧森生物技術有限公司；大腸桿菌Stbl3感受態細胞購自北京博邁德基因技術有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)購自北京天根生化科技有限公司；苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、RIPA裂解液、BeyoECL Moon化學發光試劑盒和嘌呤霉素購自上海碧云天生物技術有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、固體瓊脂粉購自上海生工生物工程股份有限公司；TRIzol購自Ambion公司；高糖DMEM和胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)購自BI公司；Endofree PlasmidMiniprep Kit購自BIOMIGA公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)和0.25%Trypsin-EDTA購自GIBCO公司；T4 DNA Ligase和BsmBⅠ購自New England Biolabs公司；聚乙烯亞胺(Poly ethylenimine，PEI)購自Polysciences公司；GAPDH MAb、HRP標記的山羊抗兔IgG(H+L)和Cy3標記山羊抗鼠IgG(H+L)購自Proteintech公司；J2 anti-dsRNA IgG2a單克隆抗體(MAb)購自Scicons公司；聚凝胺購自Sigma公司；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3 qRT-PCR檢測HSP90B1 mRNA轉錄水平

將MDBK細胞按3×105個·孔-1的密度接種至6 cm細胞培養皿，置于細胞培養箱中培養至匯合度約70%時，加入10 000 TCID50BVDV TC株感染細胞，分別于24、36和48 h時，加入TRIzol裂解液提取細胞和培養液的總核糖核酸(RibonucleicAcid，RNA)，測定濃度后將1 μg總RNA反轉錄為cDNA；以此為模板，按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)說明書配制體系[16]，qRT-PCR檢測HSP90B1 mRNA的轉錄水平。

1.4 Western blot檢測HSP90B1蛋白表達水平

將1×106個MDBK細胞接種至10 cm細胞培養皿，待細胞密度達到80%左右時，感染10 000 TCID50BVDV TC株，48 h后加入600 μL含1 mmol·L-1PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白，測定濃度后變性60 μg總蛋白，利用Western blot檢測HSP90B1蛋白含量，一抗分別為GRP94抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶1 000)，二抗為山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)。

1.5 構建lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重組質粒

根據GenBank數據庫中牛源HSP90B1的基因序列(登錄號：282646)，使用Benchling(www.benchling.com)和Chop-Chop(www.chopchop.cbu.uib.no)設計HSP90B1-sgRNA和Scramble序列(表1)，送至金唯智生物(蘇州)科技有限公司合成；將合成的HSP90B1-sgRNA和Scramble的Forward、Reverse各取10 μL(100 μmol·L-1)，37 ℃孵育30 min，95 ℃孵育5 min后梯度降溫至25 ℃(5 ℃·min-1)，合成雙鏈sgRNA。利用限制性內切酶BsmBⅠ酶切lentiCRISPR v2質粒，利用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，回收12 000 bp處的目的條帶，將合成的雙鏈sgRNA連接至回收的線性載體中構建lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重組質粒；連接產物轉化至大腸桿菌Stbl3感受態細胞，挑取單克隆菌落，對轉化后的lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA菌液進行PCR和測序鑒定。

表1 sgRNA序列

1.6 HSP90B1 KO/Scramble細胞構建及檢測

6 cm細胞培養皿用0.1%明膠包被30 min后，接種3×105個HEK-293T細胞，培養至匯合度約80%時，將3 μg pSPAX2、1.5 μg pMD2.G和3 μg lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA質粒在1.5 mL離心管中混勻，加入37.5 μL PEI (1 mg·mL-1)，細胞棄原培養液，加入2.5 mL DMEM和上述混合液，置于細胞培養箱中孵育3 h后更換含10% FBS的新鮮細胞培養液，置于細胞培養箱中培養48 h，收集上清液得到慢病毒HSP90B1-sgRNA和Scramble-sgRNA。同時轉染pLenti-GFP質粒，包裝GFP慢病毒，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況，估算慢病毒包裝效率。

向慢病毒HSP90B1-sgRNA和Scramble-sgRNA加入聚凝胺(終濃度為8 μg·mL-1)后懸浮感染MDBK細胞，同時設立GFP對照組以觀察慢病毒感染效率；細胞培養箱中孵育24 h后更換含10% FBS的新鮮培養液，置于細胞培養箱中繼續培養48 h，加入終濃度為3 μg·mL-1的嘌呤霉素，連續篩選4代獲得HSP90B1 KO細胞和Scramble陽性細胞。分別收集5×106個HSP90B1 KO和Scramble細胞，提取總蛋白，測定蛋白濃度，檢測HSP90B1的敲除效率。

1.7 細胞生長情況檢測

按3×105個細胞·孔-1的密度將HSP90B1 KO、Scramble和MDBK細胞接種至6孔細胞培養板中，置于細胞培養箱中培養，分別于接種后24、48、72、96、120 h時用0.25% Trypsin-EDTA完全消化后收集細胞，1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，加入1 mL培養液重懸細胞，顯微鏡下進行細胞計數。

1.8 qRT-PCR檢測BVDV 5′UTR RNA水平

分別接種3×105個·孔-1HSP90B1 KO和Scramble細胞至6孔細胞培養板中，待細胞密度達到80%時，感染10 000 TCID50的BVDV TC株，于感染后12、24、36、48 h時收集細胞及培養液提取總RNA，反轉錄為cDNA，采用qRT-PCR檢測BVDV 5′UTR RNA水平[17]。

1.9 免疫熒光檢測BVDV dsRNA含量

24孔細胞培養板鋪爬片并用1%明膠包被30 min，按1×105個·孔-1的密度將HSP90B1 KO和Scramble細胞接種至細胞培養板中，待細胞貼壁后感染10 000 TCID50的BVDV TC株，于感染后12、24、36、48 h后收集爬片；PBS清洗后，加入200 μL 4%多聚甲醛，室溫條件下固定15 min；清洗后加入200 μL含1%山羊血清的封閉液，室溫孵育1 h；清洗3次后加入J2 anti-dsRNA IgG2a單克隆抗體(1∶1 200)，4 ℃孵育過夜；清洗并加入Cy3標記山羊抗鼠IgG(H+L)二抗(1∶200)，室溫下避光孵育1 h；PBS清洗，滴加5 μL抗熒光猝滅封片劑，將爬片置于封閉液上進行封片；利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光分布情況及強度。

1.10 BVDV感染HSP90B1 KO細胞后病毒滴度檢測

以3×105個·孔-1的密度將HSP90B1 KO細胞和對照組Scramble細胞接種至6孔細胞培養板中，置于細胞培養箱中靜置培養；待細胞貼壁后，加入10 000 TCID50BVDV TC株感染細胞，于感染后12、24、36、48 h收集細胞和培養液，置于-80 ℃冰箱中反復凍融3次，液體轉移至2 mL離心管，4 ℃ 1 000 r·min-1離心10 min，收集上清，采用Reed-Muench法測定各上清液中的病毒滴度。

1.11 BVDV感染HSP90B1 KO細胞CPE情況

按3×105個·孔-1的密度接種HSP90B1 KO和Scramble細胞至6孔細胞培養板中，置于細胞培養箱中培養，細胞密度約70%時，接種10 000 TCID50的BVDV TC株感染細胞，于感染后12、24、36和48 h時，使用倒置顯微鏡(TE2000U)觀察細胞病變效應(cytopathic effects，CPE)，并拍照進行對比。

1.12 統計分析

利用SPSS 19.0 for Windows(SPSS Inc. Chicago，IL，USA)對結果進行統計學分析。通過t檢驗確定統計學顯著性(*.P<0.05；**.P<0.01)。

2 結 果

2.1 qRT-PCR檢測HSP90B1 mRNA轉錄水平

為檢測BVDV感染MDBK對HSP90B1 mRNA轉錄水平的影響，使用BVDV TC株感染MDBK細胞后不同時間收集細胞總RNA，反轉錄cDNA，進行qRT-PCR檢測，結果如圖1所示，與空白組相比病毒感染24 h時HSP90B1 mRNA轉錄水平顯著升高(P<0.05)，36和48 h時極顯著升高(P<0.01)，表明BVDV感染MDBK細胞導致HSP90B1 mRNA轉錄增加。

*. P<0.05; **. P<0.01；下同

2.2 Western blot檢測HSP90B1蛋白表達

為進一步檢測BVDV感染MDBK細胞對HSP90B1表達的影響，使用BVDV TC株感染MDBK細胞48 h后提取蛋白，進行Western blot檢測，結果與空白組相比BVDV感染細胞后細胞中的HSP90B1蛋白表達水平明顯增加(圖2)，表明BVDV感染MDBK細胞使MDBK細胞內HSP90B1蛋白的表達量升高。

A. Western blot檢測結果；B. 灰度值分析

2.3 lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重組質粒構建結果

為構建lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重組質粒，利用限制性內切酶BsmBⅠ酶切lentiCRISPR v2質粒，1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果顯示得到兩條大小不同的條帶，一條在12 000 bp，一條在2 000 bp(圖3)，與預期結果一致，回收12 000 bp處的目的條帶，將連接構建的重組質粒lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA轉化至Stbl3感受態細胞，挑取單克隆菌落PCR后，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測重組質粒中HSP90B1 sgRNA 和Scramble sgRNA是否連接成功，結果在260 bp處顯示條帶(圖4)，同時送至公司進行測序并使用Snapgene (v4.2.4)軟件繪制圖譜，以上結果表明lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重組質粒構建成功。

Marker. DL10000 bp DNA相對分子質量標準；1、2. 酶切后lentiCRISPR v2

Marker. DL500 bp DNA相對分子質量標準；1～12. lentiCRISPR v2-HSP90B1-sgRNA；13. 陰性對照

2.4 HSP90B1 KO/Scramble細胞構建及檢測

為得到HSP90B1 KO/Scramble細胞，轉染包裝HSP90B1-sgRNA、Scramble-sgRNA和GFP慢病毒，懸浮感染MDBK細胞，使用熒光倒置顯微鏡觀察GFP對照組的感染效率，結果在顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達量約為50%，表明感染效率為50%(圖5)；加入終濃度為3 μg·mL-1的嘌呤霉素，連續篩選4代獲得陽性細胞，提取細胞總蛋白，進行Western blot，結果與對照組相比HSP90B1蛋白的表達量明顯降低(圖6)，表明HSP90B1 KO細胞構建成功。

A. 明場下HEK-293T；B. 熒光通路下HEK-293T；C. 合并圖。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖

A. Western blot檢測結果；B. 灰度值分析

2.5 細胞生長情況檢測

為檢測敲除HSP90B1基因對細胞生長的影響，將相同數量的不同細胞接種至6孔細胞培養板中，分時間段利用0.25%Trypsin-EDTA消化后，進行細胞計數，結果顯示相同時間的Scramble、HSP90B1 KO細胞的數量與MDBK細胞相比未見差異(圖7)，表明敲除HSP90B1對于細胞的生長沒有影響。

圖7 細胞生長情況檢測結果

2.6 qRT-PCR檢測BVDV 5′UTR RNA水平

為檢測HSP90B1對BVDV 5′UTR RNA表達的影響，于BVDV感染后不同時間收集細胞及培養液，提取總RNA，應用qRT-PCR檢測BVDV 5′UTR RNA水平，結果如圖8所示，與對照組Scramble細胞相比，病毒感染HSP90B1 KO細胞12 h后BVDV 5′UTR RNA水平顯著降低(P<0.05)，感染36 h后極顯著性降低(P<0.01)，表明敲除HSP90B1基因會抑制BVDV 5′UTR RNA的表達水平。

圖8 qRT-PCR檢測BVDV感染HSP90B1 KO細胞中BVDV 5′UTR RNA

2.7 免疫熒光檢測BVDV dsRNA含量

為明確HSP90B1對BVDV dsRNA在細胞中形成的影響，BVDV感染HSP90B1 KO和Scramble細胞后不同時間收集細胞爬片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光分布及強度，結果BVDV dsRNA呈現綠色熒光，細胞核顯示紅色熒光。與對照組相比，HSP90B1 KO細胞中的綠色熒光明顯減少(圖9)，表明敲除HSP90B1能夠減少BVDV dsRNA在細胞中的形成。

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2.8 BVDV感染HSP90B1 KO細胞后病毒滴度檢測

為驗證HSP90B1對BVDV子代病毒形成的影響，BVDV TC株感染HSP90B1 KO細胞和對照Scramble細胞后，分別于12、24、36、48 h收集病毒液，利用Reed-Muench法測定不同病毒液中的病毒滴度，結果在BVDV感染HSP90B1 KO細胞12 h后與對照組相比，病毒滴度顯著降低(P<0.05)，感染36 h后病毒滴度極顯著性降低(P<0.01)(圖10)，表明敲除HSP90B1能夠抑制BVDV子代病毒的形成。

圖10 BVDV感染HSP90B1 KO后病毒滴度檢測

2.9 BVDV感染HSP90B1 KO細胞CPE情況

為驗證HSP90B1對BVDV致細胞病變能力的影響，使用BVDV TC感染HSP90B1 KO細胞和對照Scramble細胞后，于不同時間利用倒置顯微鏡觀察細胞病變效應，結果BVDV感染對照組Scramble細胞12和24 h后出現明顯CPE，而HSP90B1 KO細胞很難觀察到CPE，感染36和48 h HSP90B1 KO細胞出現明顯CPE，但對照組Scramble細胞已出現大量CPE并有細胞脫落(圖11)，結果表明敲除HSP90B1能夠降低BVDV的致細胞病變能力。

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3 討 論

牛病毒性腹瀉病毒是一類無細胞結構、個體極小的微生物[18]，由于病毒缺少細胞結構特征，導致其必須依賴于宿主細胞進行復制和增殖，病毒從進入細胞，到細胞內的組裝、復制、合成等都需要細胞內基因的輔助[19]。HSP90B1是一種熱休克蛋白，主要參與ERS和細胞凋亡過程，Sengupta等[20]發現HSP90B1在日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染的小鼠大腦和Neuro2a細胞中顯示出差異性，并強調了其在黃病毒感染期間對ER膜重塑和ERS的重要性[12]；Zhong等[21]通過STRING分析，發現HSPA5、HSPA1B、HSP90B1和HSPA6四種熱休克蛋白可能與MDBK細胞中山羊副流感病毒3型(caprine parainfluenza virus type 3，CPIV3)的增殖有關；本研究組前期使用BVDV TC感染MDBK細胞后進行蛋白質譜篩選差異基因，結果顯示HSP90B1具有顯著性差異(未發表)。為驗證蛋白質譜的結果，本研究使用qRT-PCR檢測BVDV感染MDBK細胞后HSP90B1 mRNA的轉錄水平，結果感染24 h時HSP90B1 mRNA轉錄水平顯著升高(P<0.05)，36和48 h時極顯著升高(P<0.01)，利用Western blot檢測BVDV感染MDBK細胞后HSP90B1蛋白表達水平，顯示感染后HSP90B1蛋白的表達量明顯升高；表明BVDV感染能夠誘導MDBK細胞中HSP90B1的表達，猜測HSP90B1基因可能會影響BVDV的復制。

為研究基因對病毒的影響，Liang等[22]敲低三基序蛋白26(tripartite motif containing 26，TRIM26)發現，TRIM26參與丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的復制，并且減少TRIM26的表達能夠降低HCV RNA和NS3蛋白表達水平；Mladinich等[23]利用CRISPR/Cas9技術發現C-C基序趨化因子配體5(C-C motif chemokine ligand 5，CCL5)是寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)持久性需要的重要因素；Isken等[24]敲除DNAJC14研究了該基因對于瘟病毒RNA復制的影響。為研究HSP90B1基因對BVDV復制的影響，作者應用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除MDBK細胞的HSP90B1基因，利用Western blot技術檢測敲除效率，結果顯示HSP90B1 KO細胞中的HSP90B1蛋白表達極明顯降低，表明HSP90B1基因被敲除，成功構建HSP90B1 KO細胞，為后期研究HSP90B1對BVDV的復制提供細胞基礎。分不同時間段進行細胞計數，結果顯示相同時間生長內的細胞數量未見明顯差異，表明敲除HSP90B1基因對細胞生長沒有影響。

利用BVDV TC感染HSP90B1 KO和對照組Scramble細胞后，進行病毒含量檢測。宋爽等[25]依據高度保守的BVDV 5′UTR基因，進行特異性引物設計，用熒光定量PCR檢測BVDV，顯示該方法具有靈敏度高、特異性好等優點，通過qRT-PCR檢測BVDV 5′UTR RNA水平，結果與對照組相比，病毒感染HSP90B1 KO細胞12和24 h后BVDV 5′UTR RNA水平顯著降低(P<0.05)，36和48 h后極顯著降低(P<0.01)；間接免疫熒光法在臨床中能夠高效快速地檢測BVDV分子，并且具有較高的特異性和可靠性，利用免疫熒光染色后BVDV dsRNA呈現綠色熒光，細胞核顯示紅色熒光與對照組相比HSP90B1 KO細胞中的綠色熒光明顯減少；病毒滴度及CPE也是顯示病毒表達量的方法之一，利用病毒滴度及CPE檢測感染HSP90B1 KO細胞后的病毒含量，與對照組相比感染HSP90B1 KO細胞的病毒滴度在12 h后顯著降低(P<0.05)，36 h后極顯著降低(P<0.01)，CPE結果顯示在感染12 h后對照組Scramble細胞出現明顯CPE，而HSP90B1 KO細胞很難觀察到CPE，感染36 h后HSP90B1 KO細胞出現CPE，但此時對照組Scramble細胞已出現大量CPE并有細胞脫落；以上結果顯示HSP90B1 KO細胞中的病毒含量明顯少于對照組Scramble細胞，表明敲除HSP90B1基因能夠抑制BVDV的復制。

HSP90B1主要富集于ERS和細胞凋亡通路，有研究顯示BVDV感染能夠誘導ERS信號通路的激活[26]，而且抑制內質網葡糖苷酶的活性，能夠阻止BVDV E2蛋白在高爾基體內的加工，并且降低病毒粒子的感染性[27]，以此推測HSP90B1基因可能通過調控內質網應激通路影響BVDV的復制，具體機制還需進一步研究。

4 結 論

BVDV感染MDBK細胞能夠誘導HSP90B1表達；CRISPR/Cas9成功敲除MDBK細胞的HSP90B1基因，構建HSP90B1 KO細胞，敲除HSP90B1能夠抑制BVDV的復制。