條件性敲除D1133L基因的重組非洲豬瘟病毒的構建及增殖特性

張 婷，馮 濤，楊金柯，郝 雨，楊 行，張大俊，史喜絹，閆文倩，陳玲玲，劉湘濤，鄭海學，張克山

(中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室農業部畜禽病毒學重點開放實驗室 國家口蹄疫參考實驗室，蘭州 730046)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus， ASFV)感染引起的豬的一種烈性、高度致死性的重大傳染病，目前暫無商品化的疫苗和防控藥物可用[1-4]，嚴重威脅全球養豬業[5]。

ASFV是Asfarviridae家族的唯一成員，屬于核質巨DNA病毒(nucleocytoplasmiclarge DNA viruses，NCLDV)[6-7]。ASFV是目前唯一報道的DNA蟲媒病毒[3]。ASFV粒子呈現出獨特的多層結構，整體形態呈二十面體，直徑約250 nm[8- 9]。病毒基因組是雙鏈DNA (dsDNA)分子，長度為170～190 kbp，編碼超過150個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其中大約一半ORF缺乏任何已知或可預測的功能[6]。病毒粒子包含約70種不同的多肽[10]，包括用于病毒結構的多種成分，以及一組參與病毒轉錄和mRNA修飾以及維持病毒基因組完整性的酶。ASFV主要在豬單核細胞和巨噬細胞中復制[11-14]。ASFV編碼的D1133L基因在ASFV中高度保守[15]，與牛痘病毒(vaccinia virus，VACV)的轉錄因子蛋白D6R相似[16]，具有SF2解旋酶家族相似的基序，值得注意的是，D1133L在病毒感染晚期表達，屬于晚期表達基因，D1133L定位于胞質[17]，可能參與病毒轉錄過程[6, 11-12]。目前對D1133L在病毒復制過程中發揮的作用及其機制知之甚少。

ASFV編碼的結構蛋白在病毒復制不同階段發揮相關的功能，為了探究病毒蛋白在復制階段發揮的功能，乳糖操縱子中編碼的酶在阻遏物——乳糖操縱子阻遏蛋白(lac repressor Lac I，Lac I)負調控下，可特異性地與乳糖操縱基因(lac operator LacO，Lac O)結合并以高親和力與其21 bp序列結合，阻遏酶表達。Lac I也可以與異乳糖或異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)結合，從而降低阻遏物對操縱子的親和力，通過這種方式，IPTG可以減少Lac操縱子轉錄的抑制，從而誘導表達。該系統可調節哺乳動物細胞中轉染和整合基因的表達，在VACV中已使用該系統可以用來研究病毒形態，成為調控病毒蛋白與宿主互作的有力工具[18]。基于乳糖Lac操縱阻遏系統的ASFV誘導表達系統[19]。例如p72蛋白誘導重組的ASFV，利用該策略對ASFV其他蛋白在病毒復制中發揮的功能進行探究，比如pE120R[20]和 pE199L[21]構建誘導表達pE120R和pE199L基因的ASFV重組病毒，探究這兩種病毒蛋白在病毒入侵和出芽過程發揮作用。因此ASFV感染與致病功能與其編碼的病毒蛋白息息相關，構建缺失病毒相關蛋白的ASFV重組病毒是研究病毒編碼致病基因及其機制的重要手段。本研究團隊發現缺失D1133L基因ASFV無法復制，利用大腸桿菌阻遏系統條件性敲除D1133L基因，探究了D1133L在ASFV病毒復制過程中發揮的功能，獲得ASFV條件性敲除D1133L基因的重組病毒vD1133Li，比較了重組病毒和親本毒株的復制能力，本研究結果為D1133L基因功能研究和機制的探究提供了基礎，為條件性基因缺失ASFV弱毒疫苗的研發提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與病毒 MA-104細胞和MA-104/D1133L細胞系由蘭州獸醫研究所口蹄疫流行病實驗室保存；ASFV CN/GS/2018分離株、由蘭州獸醫研究所非洲豬瘟區域實驗室構建并保存。豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages, PAM) 和骨髓源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages，BMDM)的分離、鑒定和培養參照European Union Reference Laboratory for ASF, SOP/CISA/ASF中的操作程序。

1.1.2 試劑和抗體 ASFV p30單克隆抗體，兔抗ASFV p72多克隆抗體由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供；peGFP-N1載體、pUC118載體均購于蘭州瑞博萊生物科技有限公司；無內毒素的質粒提取試劑盒，購于OMEGA公司；胎牛血清(FBS)和0.25%EDTA-Trypsin(Gibco)購自博鑫生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液(三抗)和PBS緩沖液購自北京索萊寶公司；大腸桿菌Trans5a感受態、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、Trizol 試劑購自SYBR Permix Ex Taq II均購于寶生物工程大連有限公司；RPIM1640培養基(Gibco)和高糖DMEM(Gibco)培養基購自購自Thermo Fisher Scientific公司；鼠抗β-actin單克隆抗體購自英濰捷基(上海)貿易有限公司，HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，Goat Anti-Mouse，蛋白預染marker購自proteintech公司。

1.2 不同轉移載體的構建

本研究中使用的表達盒參考相關報道由三部分組成[22]，通過PCR擴增得到p72啟動子序列，即從p72基因上游的-97 nt到ATG起始密碼子之前序列，以peGFP-N1載體為模板，擴增得到綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)基因，合成以u104L為啟動子的Lac I系統，最后合成以p72啟動子的Lac O系統。將這幾個部分部分連接，獲得eGFP篩選表達盒基因片段，命名p72-eGFP-U104L-Lac I-p72-Lac O。為便于后續純化病毒，在合成調控序列的同時，合成p72啟動子啟動表達的eGFP 基因篩選標記元件。

1.3 重組載體的構建與鑒定

利用pU118載體作為骨架載體，構建D1133L基因敲除同源重組轉移載體。步驟如下：分別設計D1133L基因起始密碼子的上下游序列1.0 kb作為同源重組臂，分別克隆入骨架載體中，兩個同源臂中插入p72-eGFP-U104L-Lac I-p72-Lac O表達盒基因片段。得到用于條件性敲除D1133L基因的同源重組轉移載體，經測序正確后，將該同源重組轉移載體命名為ASFVΔi130；用去內毒素的質粒提取試劑盒提取質粒DNA，測定濃度，-20 ℃保存備用。

1.4 質粒轉染和重組病毒篩選與鑒定

1.4.1 重組質粒轉染 將同源重組轉移載體pUC-p72-eGFP-U104L-LacI-p72-LacO用4 μL JetPER-Macrophage DNA轉染試劑轉染至豬BMDM細胞中(細胞數約為106個·孔-1)，6 h后，感染ASFVCN/GS2018，至感染48 h，熒光顯微鏡觀察熒光細胞數，挑取所有單孔中的熒光細胞，在新的培養皿中小心吹散，沉降1 h，挑取所有單個熒光細胞，反復凍融后，接種預先鋪好的96孔板BMDM細胞，每12 h觀察一次，連續觀察至72 h；在熒光顯微鏡下可見有零星綠色熒光，即視為可疑重組毒感染的細胞。挑取熒光細胞，在新的培養皿中小心吹散，沉降1 h，挑取單個熒光細胞，收集后反復凍融3次，接種預先鋪好的96孔板PAMs，每12 h觀察一次，連續觀察至72 h。熒光細胞數量比例達100%的為全陽性孔，表明重組毒構建基本成功。

1.4.2 重組病毒鑒定 在1.5 mmol·L-1IPTG的情況下，對陽性孔進行有限稀釋擴大培養，挑取第11代重組病毒孔消化成單個細胞，吸取10個熒光細胞，分別接種于預先鋪好的96孔板PAMs，生長72 h。挑取GFP熒光較多的細胞，用病毒基因組提取試劑盒提取ASFV野毒和基因缺失ASFV的基因組，用針對D1133L的引物進行PCR鑒定，確認是否缺失成功。通過加入IPTG，擴大培養，純凈性檢驗、目的基因通過Western blot測定，以確定純化的ASFV vD1133Li在沒有IPTG情況下，D1133L蛋白的表達被阻止。檢測引物序列表見表1。

表1 重組病毒檢測引物序列表

1.5 病毒生長曲線

將PAM細胞接種于24孔細胞培養板，ASFV重組毒株vD1133Li和親本毒株感染(MOI=0.1)PAMs，吸附2 h后，親本毒株沒有IPTG及重組毒株vD1133Li更換培養基IPTG(1.5 mmol·L-1)和沒有IPTG的培養基中培養。在感染后指定時間將感染細胞與培養上清一起收集，反復凍融三次后，用qPCR測定病毒拷貝數。反應體系25 μL，用Qiagen公司的QIAamp DNA Mini試劑盒提取樣本DNA，設計以ASFVp72基因為靶點的定量引物來分析病毒增殖的拷貝數，引物序列如下，上游引物序列f：5′-CAGGCAAAACAAGTGAAACA-3′，下游引物序列r：5′-GCAAACTGCTCATCCAATAT-3′；探針(probe)：TGTTCTTCACGCGTAGCGAATGGGC，探針的5′端標記fam熒光報告基團，3′端標記熒光淬滅基團bhq1，擴增條件:95 ℃預熱30 s， 95 ℃預熱5 s，58 ℃預熱30 s， 40次循環。計算ASFV基因組的數量，并以每微升含有病毒基因組拷貝數表示。

1.6 熒光觀察

利用熒光顯微鏡觀條件性缺失D1133L重組病毒(vD1133Li)感染PAM細胞的熒光值，將PAM細胞按1×105密度接種于六孔板中，感染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察并在綠色和白光通道并拍照記錄，細胞放大倍數為20×。

1.7 實時定量 PCR(RT-qPCR)

采用 Trizol 裂解法提取細胞的總 RNA，并反轉錄為 cDNA，用于實時定量 PCR，反轉錄體系 20 μL：10 μL反轉錄酶，5 μL DEPC 水，5 μL RNA。反應程序：37 ℃ 15 min，82 ℃ 5 s。RT-qPCR的反應體系(10 μL)：5 μL SYBR Permix Ex TaqⅡ，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，3 μL DEPC 水和1 μL cDNA。反應程序：95 ℃預變性 3 min，95 ℃變性 10 s，60 ℃退火和延伸 34 s，共 40 個循環，同時進行熔解曲線分析，采用 2-ΔΔCt方法，計算目的基因的相對表達量并進行分析。引物序列見表2。

表2 RT-qPCR引物序列

1.8 Western blot

MA-104/D1133L和MA-104細胞以每孔1×105細胞量接種于12孔板，感染ASFV(MOI=1.5)，不同時間點收取蛋白，用PBS洗滌后加入100 μL 1×loading蛋白上樣緩沖液裂解細胞，取20 μL蛋白上樣量進行SDS-PAGE，電泳結束后用100 V恒壓轉膜1.5 h，用5%的脫脂奶粉室溫封閉2.5 h，加入對應D1133L單克隆抗體和p72多克隆抗體，4 ℃過夜孵育，加入山羊抗鼠和山羊抗兔(1∶5 000)室溫孵育2 h，用ECL顯色液全自動化學發光成像分析。

1.9 數據分析

用GraphPad Prism 軟件進行統計學分析并作圖，采用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，*.P<0.05 說明數據間有顯著差異，**.P<0.01 說明數據間有極顯著差異。

2 結 果

2.1 重組病毒ASFV vD1133Li的構建及鑒定

為研究D1133L基因在病毒復制中的作用。首先構建了條件性缺失D1133L的重組病毒，構建策略如圖1A所示，同時針對該基因表達元件設計了內源性檢測引物和外源性檢測引物，病毒純凈性檢測結果如圖1B所示，結果表明在無IPTG的條件下，利用內源性檢測引物LP3056/3057檢測基因組，i130#1和i130#2無法檢測到D1133L相關條帶；利用外源性檢測引物LP2918/3057檢測大腸桿菌阻遏元件，WT檢測不到相關條帶，說明成功構建條件性誘導D1133L缺失的重組病毒，該重組病毒命名為ASFV vD1133Li。

A.重組病毒vD1133Li基因組構建策略圖；B.重組病毒vD1133Li基因組核酸檢測圖

2.2 重組病毒ASFV vD1133Li感染細胞狀態

為進一步明確重組病毒vD1133Li感染PAM細胞后病毒的復制差別。條件性缺失重組病毒vD1133Li感染PAM細胞，48 hpi后熒光顯微鏡觀察，結果表明在IPTG(1.5 mmol·L-1)存在時熒光數量明顯增多，當D1133L基因缺失后，ASFV復制能力明顯減弱。

2.3 重組病毒ASFV vD1133Li的生長特性

為明確探究D1133L缺失對ASFV復制的影響，在存在或不存在IPTG的情況下，分析了重組病毒vD1133Li的生長曲線，如圖3C所示，在添加IPTG(1.5 mmol·L-1)誘導表達D1133L蛋白，重組病毒vD1133Li(+)和親本毒株的生長曲線相似，而在IPTG不存在，即D1133L不表達，重組病毒vD1133Li(-)在48 hpi后復制明顯低于親本毒株。以上結果表明D1133L基因對ASFV復制至關重要。

2.4 條件誘導下的D1133L基因功能

為檢測D1133L蛋白的誘導表達， Western blot分析了感染親本ASFV或重組vD1133Li的MA-104細胞在存在和不存在IPTG(1.5 mmol·L-1)情況下的細胞裂解液。如圖4A所示，D1133L在親本病毒感染和在誘導劑IPTG存在下生長的重組病毒vD1133Li，表達水平相似。在沒有IPTG誘導的情況下，重組vD1133Li幾乎檢測不到D1133L蛋白表達。作為對照組， p72的表達水平在所有感染條件下是一致的。為進一步證明D1133L對病毒復制的作用，將重組毒株vD1133Li在IPTG不存在(D1133L不表達)的情況下，感染穩定表達D1133L的MA-104細胞系MA-104/D1133L，在不同時間點收取樣品，利用RT-qPCR、Western blot檢測了ASFV p30、p72的轉錄水平(圖4B和4C)和蛋白水平(圖4D)，結果表明在不存在IPTG的條件下，重組病毒在MA-104/D1133L細胞的復制能力顯著高于野生型MA-104細胞。綜上所述，重組vD1133Li的病毒復制能力與D1133L相關，進一步證明D1133L對病毒復制是必須基因。

存在IPTG[(vD1133Li(+)]或不存在IPTG[vD1133Li(-)]的情況下，重組病毒vD1133Li感染PAMs，感染48 h后，熒光顯微鏡觀察

存在IPTG[vD1133Li(+)]或不存在IPTG[vD1133Li(-)]的情況，用vD1133Li病毒感染PAMs。在指定的感染時間內，測定每個樣品的病毒拷貝數，親代GS/CN2018 (WT)感染作為對照

A.D1133L蛋白的誘導表達，在IPTG存在或不存在的條件下，用親本GN/CS2018株(WT)和重組毒株vD1133Li病毒(MOI=1.5)感染MA-104細胞，在36 hpi時，用抗病毒蛋白D1133L和p72的抗體進行免疫印跡分析；B、C. vD1133Li病毒感染MA-104/D1133L細胞和MA-104細胞ASFV p30和p72轉錄水平表達；D. vD1133Li病毒感染MA-104/D1133L細胞ASFV p30、p72和D1133L蛋白水平表達

3 討 論

ASFV編碼的病毒蛋白較多，為驗證基因功能，采用CRISPR/Cas9技術或者同源重組技術缺失單個和多個病毒毒力基因，在取得毒力減弱的同時，也可驗證基因功能；而對于病毒存活的必需基因，用上述方法無法獲得敲除毒株。研究采用CRISPR/Cas9技術構建缺失毒力基因的重組毒株在豬體內的評價研究為疫苗的研發提供有利的基礎[23-24]，本文利用大腸桿菌Lac阻遏操作系統實現目的基因的條件性敲除[21, 25]，探究病毒編碼的基因功能，為ASFV致病機制的研究和相關防控產品研發提供依據[26-27]。

本文利用乳糖阻遏操作系統實現目的基因的條件性敲除，構建了條件性敲除D1133L蛋白的ASFV重組毒株vD1133Li，在PAM細胞，觀察了重組病毒vD1133Li的感染狀態，測定了重組毒株vD1133Li在IPTG存在的條件下和親本毒株CN/GS2018在PAM細胞中的生長特性。利用穩定表達D1133L的MA-104細胞系MA-104/D1133L感染vD1133Li，與野生型MA-104細胞相比，在沒有IPTG的條件下，穩定表達D1133L的MA-104細胞中ASFV p30和p72的表達量顯著高于野生型MA-104，證實D1133L蛋白對病毒復制是至關重要的。針對ASFV復制過程中利用病毒蛋白靶點來設計抗病毒藥物引起大家關注，比如DNA結合蛋白pA104R在ASFV基因組包裝中的作用及作為疫苗和藥物開發的新靶點[28-29]；ASFV編碼的基因S273R具有sumo-1特異性蛋白酶和腺病毒蛋白酶的保守催化殘基特征，針對ASFV pS273R蛋白酶的小分子化合物靶向抑制劑，通過用一種小分子抑制劑阻斷pS273R蛋白酶的活性來潛在抑制ASFV復制[30]。因此本研究證實的D1133L基因功能，為針對D1133L設計與之結合的小分子化合物來抑制ASFV復制的抗病毒藥物研發提供了新的研究策略。

4 結 論

本次研究首次成功構建了條件性誘導缺失D1133L的 ASFV重組病毒vD1133Li，利用ASFV重組病毒vD1133Li感染PAM細胞和穩定表達D1133L的MA-104細胞，研究了重組病毒增殖特性，明確了D1133L對ASFV復制至關重要，此研究結果為探究D1133L作用的分子機制和基因缺失ASFV疫苗株的研發提供關鍵的生物學材料和新的研發思路。