低濃度阿奇霉素對豬鏈球菌2型蛋白表達、莢膜多糖與藥物敏感性的影響

楊艷北，許 晶，劉婉萍，陶艾妮，馮育林，孫 勇，王 闖，劉 建

(1.江西中醫藥大學博士后流動站/正邦集團有限公司博士后工作站，南昌 330000；2.南昌師范學院生物技術研究院/江西省地方雞種遺傳改良重點實驗室，南昌 330000；3.南昌師范學院生命科學學院，南昌 330000； 4.江西正邦養殖有限公司，南昌 330000)

阿奇霉素屬于人用大環內酯類抗生素，被農業農村部列為畜禽禁用獸藥。目前，阿奇霉素違規用于畜禽養殖，雖然國家明令禁止，但是養殖戶仍將阿奇霉素等人用抗生素添加于飼料中或通過其他途徑使用，導致人用抗生素被濫用于畜禽，已成為威脅畜禽產品安全的新隱患[1]。阿奇霉素的濫用，致使養豬環境中出現大量殘留，導致豬鏈球菌2型與低濃度阿奇霉素有機會長期共存，豬鏈球菌2型改變自身狀態以應對阿奇霉素的選擇壓力[2]。環境中殘留的低濃度抗生素會改變細菌的棲息環境，對細菌的生存構成嚴重威脅，極易產生耐藥菌株[3-4]。

莢膜多糖是豬鏈球菌2型的主要毒力因子，位于細胞表面，能讓豬鏈球菌2型逃避免疫監視，促進致病性感染，具有抗吞噬、黏附和定植等多種生理功能。莢膜多糖在豬鏈球菌2型生長、繁殖和應對不良環境過程中起著關鍵作用，受cps基因調控。豬鏈球菌2型cps基因由cpsA～cpsV共22個基因組成，主要發揮糖鏈長度的調節、糖基的聚合、多糖的運輸和特化修飾等重要生物學功能[5-6]。

細菌對抗生素的外排作用是細菌多重耐藥的重要機制。細菌外排泵是存在于細胞膜上的，具有外排功能的膜轉運蛋白，能夠將進入胞內的抗菌藥物泵出胞外，使菌體內藥物濃度降低而導致耐藥，ABC轉運蛋白屬于細菌多重耐藥的主動外排泵[7-9]。ABC轉運蛋白通過ATP結合和水解推動藥物自由排出。ABC轉運蛋白作用的底物種類較多，除抗生素外，還包括氨基酸、糖類、離子和多糖類化合物等[10-13]。

本研究用低濃度阿奇霉素處理豬鏈球菌2型，利用蛋白質組學iTRAQ技術，篩選關鍵差異表達蛋白，測定豬鏈球菌2型的莢膜多糖含量和藥物敏感性，為進一步研究環境中低濃度抗生素對微生物的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

豬鏈球菌2型ATCC700794購自美國模式培養物保藏中心(ATCC)。Todd-Hewitt肉湯(THB)培養基購自海博生物科技有限公司。阿奇霉素(ABT070-5 g)購自金克隆(北京)生物技術有限公司。

1.2 阿奇霉素對豬鏈球菌2型最小抑菌濃度(MIC)的測定

MIC的測定，以大腸埃希菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為質控菌，嚴格按照美國臨床檢驗標準委員會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法進行，待豬鏈球菌2型增至108cfu·mL-1后，稀釋為105～106cfu·mL-1，接種于含不同藥物濃度的96孔板中，37 ℃恒溫培養24 h，觀察結果。藥敏結果判定標準參照 CLSI-VET01S[14]。

1.3 蛋白質組學iTRAQ技術篩選關鍵差異表達蛋白

試驗分組：豬鏈球菌2型在含有1/4 MIC阿奇霉素的THB中，37 ℃培養72 h后，8 000 r·min-1離心10 min，用離心管收集菌體，用生理鹽水沖洗3次，于-80 ℃冰箱中備用，作為處理組。以無阿奇霉素處理的豬鏈球菌2型作為對照組。iTRAQ 試驗方法參照文獻[15]進行，方法如下。

將上述樣品裂解，超聲破碎，取上清，Bicinchoninic Acid Assay法測定蛋白濃度。樣品進行 SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色。樣品酶解后，OD280 nm肽段定量。樣品按照 AB 公司試劑盒：iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit (AB SCIEX)說明書進行標記。將試驗標記后的肽段混合，進行SCX預分級。樣品采用納升流速HPLC液相系統Easy nLC進行分離。樣品經毛細管高效液相色譜分離后，用Q-Exactive質譜儀(Thermo Finnigan)進行質譜分析。質譜原始數據進行查庫鑒定及定量分析。在蛋白質定量過程中，要求每個蛋白至少包含2個唯一肽段。當差異倍數>1.1且P<0.05時，認為該蛋白差異顯著。利用Proteome Discoverer軟件對鑒定的差異表達蛋白進行GO分類注釋，包括分子功能、細胞組分和生物過程。

1.4 莢膜多糖含量測定

試驗分組：豬鏈球菌2型在含有1/4 MIC阿奇霉素的 5 L THB液體培養基中，37 ℃培養72 h后，離心收集菌體，作為處理組。在相同環境下培養5 L豬鏈球菌2型，并離心收集菌體，作為對照組(無阿奇霉素)。莢膜多糖提取及測定方法參照文獻[16]進行，方法如下，略有改動。

莢膜多糖提取：離心獲得的菌體，分別在生理鹽水中沖洗、離心，懸浮于含有溶菌酶的100 mL甘氨酸緩沖液(甘氨酸0.1 mol·L-1，溶菌酶1 mg·mL-1，pH 9.2)，37 ℃作用6 h，離心取上清。取50 mL上清，加入終濃度為100 μg·mL-1蛋白酶K，55 ℃作用2 h，然后加入脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶，37 ℃作用1 h，然后加入蛋白酶K，并在上清中加入終濃度為0.1 mol·L-1的CaCl2，攪拌1 h，再加入終濃度為25%的無水乙醇，4 ℃放置2 h，離心除去上清液中沉淀出來的核酸，之后加入終濃度為80%無水乙醇，4 ℃放置過夜沉淀，得到處理組和對照組莢膜多糖。

采用硫酸-苯酚法測定莢膜多糖含量：取處理組和對照組莢膜多糖，分別配成5.0 mg·mL-1溶液。取2 mL上述溶液，依次加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL濃硫酸，靜止10 min，搖勻，室溫放置20 min。測定上述溶液中OD490 nm吸光度，用于反映處理組和對照組莢膜多糖含量。

1.5 藥物敏感性

以1/4 MIC 阿奇霉素作為誘導藥物，人工誘導豬鏈球菌2型。將100 μL豬鏈球菌2型，在含有1/4 MIC阿奇霉素的10 mL THB液體培養基中，37 ℃培養16～24 h，將其作為下一代誘導的母菌，一共盲傳誘導15代(誘導菌株)。將誘導菌株在不含阿奇霉素的液體培養基中盲傳10代，即為第25代菌株(恢復菌株)。依次取第5、10、15和25代的菌株，測定其對大環內酯類抗生素(紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素)、氨基糖苷類抗生素(卡那霉素、鏈霉素、安普霉素、慶大霉素)、喹諾酮類抗生素(諾氟沙星、環丙沙星、氧氟沙星)的MIC。無阿奇霉素處理的豬鏈球菌2型作為對照組。MIC的測定參照“本研究方法1.2”進行。

2 結 果

2.1 阿奇霉素對豬鏈球菌2型MIC的測定

阿奇霉素對豬鏈球菌2型ATCC 700794的MIC 是0.007 812 5 mg·L-1，根據美國 CLSI 判定標準，阿奇霉素的敏感折點為 0.5 mg·L-1，因此豬鏈球菌2型 ATCC 700794 對阿奇霉素敏感(非耐藥菌株)。

2.2 蛋白質組學iTRAQ技術篩選關鍵差異表達蛋白

2.2.1 蛋白樣品定量結果 樣品經裂解后，BCA法測定蛋白濃度。處理組蛋白質濃度為2.94 μg·μL-1，對照組蛋白質濃度為2.31 μg·μL-1。樣品濃度符合后續試驗要求。

2.2.2 SDS-PAGE電泳 蛋白樣品經 SDS-PAGE 電泳分離后，如圖1所示，樣品條帶分離清晰，較為均一，蛋白質樣品符合后續試驗要求。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.處理組；2.對照組

2.2.3 酶解肽段濃度測定 酶解后肽段以OD280 nm吸收值評估其相對濃度，以相關系數OD280 nm=1.1 為 1 μg·μL-1，將吸光度值換算為蛋白質濃度。處理組酶解肽段濃度為2.15 μg·μL-1，對照組酶解肽段濃度為1.98 μg·μL-1。

2.2.4 蛋白質鑒定結果 SCX分級并脫鹽后的10個樣品經質譜分析及Mascot查庫，結果合并后，以Peptide FDR≤0.01篩選過濾。結果顯示，唯一肽段為15 919個，蛋白質組為1 565個。

2.2.5 定量分析結果 本研究分為兩組，一組為處理組(1/4 MIC阿奇霉素)，二組為對照組(無阿奇霉素)。定量時分別以每組的對照組為內參，各組蛋白質的比值均采取各通道標簽與內參的比值。本研究中共鑒定到的蛋白質組為1 565個，其中，各通道標記標簽皆有定量信息的蛋白質有1 501個。

2.2.6 生物信息學分析 本研究中共鑒定到1 501個蛋白質，按照差異倍數>1.1且P<0.05進行篩選，共得到差異表達蛋白174個，差異表達蛋白占總鑒定蛋白的11.6%。大多數鑒定出的差異表達蛋白具有催化活性，參與代謝過程，屬于膜蛋白(圖2)。低濃度阿奇霉素將全面影響豬鏈球菌2型催化活性和代謝過程。膜蛋白對于豬鏈球菌2型適應阿奇霉素的選擇壓力具有重要作用。總之，豬鏈球菌2型通過改變自身蛋白質組的表達量，以適應阿奇霉素的選擇壓力。

圖2 低濃度阿奇霉素處理后的豬鏈球菌2型差異表達蛋白GO分析

2.2.7 關鍵差異表達蛋白的iTRAQ鑒定 利用同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術，本研究分析處理組(1/4 MIC阿奇霉素)和對照組(無阿奇霉素)的關鍵差異表達蛋白，如表1所示。3個莢膜多糖蛋白(M1VJJ3、G8DTL7、M1VE09)上調表達。8個莢膜多糖蛋白(K0FG35、M1VRI8、M1VK55、M1VE47、E9 NQ13、M1VRH4、M1VRG0、E9 NQ29)下調表達。9個ABC轉運蛋白(R4 NLJ6、A4VW83、G5L0Q7、A4 W271、G7S3 W1、G7SAB5、A4VTM2、G7S5E3、G7SD52)上調表達。1個50S核糖體蛋白(A4 W1B7)上調表達。4個50S核糖體蛋白(G5L0U4、A4VYQ7、G7S1 W2、A4VSF4)下調表達。4個30S核糖體蛋白(A4 W3Q2、A4VYR6、A4 W3 W8、R4 NLK5)下調表達。1個核糖體RNA甲基轉移酶(G7SM56)上調表達。1個核糖體RNA甲基轉移酶(A4 W3H4)下調表達。1個DNA回旋酶(R4 NVK5)上調表達。1個DNA聚合酶IV(G5KZN4)下調表達。

表1 低濃度阿奇霉素處理后的豬鏈球菌2型關鍵差異表達蛋白

2.3 莢膜多糖含量測定

采用硫酸-苯酚法測定處理組(1/4 MIC 阿奇霉素)和對照組(無阿奇霉素)莢膜多糖含量，以OD490 nm吸光度反映莢膜多糖含量。結果顯示，1/4 MIC 阿奇霉素處理的豬鏈球菌2型莢膜多糖含量與對照組相比，不具有統計學差異(P>0.05)，莢膜多糖含量未發生大幅度變化(圖3)。

圖3 低濃度阿奇霉素處理后的豬鏈球菌2型莢膜多糖含量測定

2.4 藥物敏感性

采用微量肉湯稀釋法測定誘導菌株(第 5、10、15 代)以及恢復菌株(第25代)對大環內酯類抗生素、氨基糖苷類抗生素、喹諾酮類抗生素的 MIC。根據美國 CLSI 判定標準，結果顯示，豬鏈球菌2型ATCC 700794對紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素、氧氟沙星敏感，對環丙沙星、諾氟沙星、卡那霉素、鏈霉素、安普霉素、慶大霉素耐藥。誘導菌株對大環內酯類抗生素(紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素)、部分氨基糖苷類抗生素(卡那霉素、鏈霉素)、部分喹諾酮類抗生素(諾氟沙星)的藥物敏感性與對照組相比差異顯著(P<0.05)。誘導菌株對部分抗生素的敏感性降低。誘導菌株恢復正常培養后，誘導菌株的藥物敏感性與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。誘導菌株對抗生素的敏感性迅速恢復到原始菌株狀態(圖4)。

圖4 豬鏈球菌2型對大環內酯類(A)、氨基糖苷類(B)、喹諾酮類(C)抗生素的藥物敏感性

3 討 論

豬鏈球菌2型為應對阿奇霉素的選擇壓力，3個莢膜多糖蛋白(基因名：cps6J、cps1/2H、cps30N)上調表達，8個莢膜多糖蛋白(基因名：cpsR、cps28Q、cps28H、cps33F、cps16F、cps26L、cps22M、cps16U)下調表達，阿奇霉素處理后的豬鏈球菌2型莢膜多糖含量未發生大幅度變化。cpsF基因編碼鼠李糖轉移酶，功能是催化和添加鼠李糖。cpsH基因編碼半乳糖基轉移酶，參與半乳糖的合成。cpsJ基因編碼N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶，該酶參與合成N-乙酰葡萄糖胺寡聚物。cpsK基因編碼β-1,4-半乳糖基轉移酶，該酶將半乳糖苷基團轉移到葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖上。cpsN基因編碼唾液酸轉移酶，參與唾液酸寡糖合成。cpsQ基因編碼尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺-2-異構酶，該酶是唾液酸合成的起始限速酶。cpsR基因編碼乙酰轉移酶，該酶將唾液酸生成O-乙酰化的單磷酸胞苷-N-乙酰神經氨酸。cpsL基因、cpsM基因、cpsU基因編碼產物尚不清楚，功能也尚不清楚[17-24]。豬鏈球菌2型為適應阿奇霉素的選擇壓力，影響莢膜多糖蛋白的表達，從而提高其在環境中的生存能力。

豬鏈球菌2型為應對阿奇霉素的選擇壓力，9個ABC轉運蛋白上調表達，推測這些ABC轉運蛋白涉及到細菌多重耐藥的主動外排功能。9個ABC轉運蛋白上調表達，可能導致豬鏈球菌2型對多種抗生素的敏感性下降，其中，ABC型多藥轉運系統ATP酶(A4VW83)已被證實是細菌多重耐藥的主動外排泵，屬于細菌的一種防御機制[25]。ABC超家族ATP結合盒轉運體(G7SD52)上調表達約5.6倍，上調表達量最為顯著，推測該蛋白對于豬鏈球菌2型外排阿奇霉素起著關鍵作用。豬鏈球菌2型為適應阿奇霉素的選擇壓力，大量表達多重耐藥的主動外排泵(ABC轉運蛋白)。ABC轉運蛋白對于豬鏈球菌2型適應阿奇霉素的選擇壓力具有重要作用。用低濃度阿奇霉素處理豬鏈球菌2型，發現其對多種抗生素的敏感性下降，存活下來的菌株，恢復正常培養后，藥物敏感性恢復。與低濃度阿奇霉素共存時，豬鏈球菌2型的生理適應性，例如開啟外排泵系統，足以應對阿奇霉素的選擇壓力，消除阿奇霉素后，容易恢復藥物敏感性。外排作用雖然只是賦予了細菌低水平的耐藥，但為染色體突變導致的高水平耐藥提供了寶貴的時間。

豬鏈球菌2型為應對阿奇霉素的選擇壓力，1個50S核糖體蛋白(A4 W1B7)上調表達，4個50S核糖體蛋白(G5L0U4、A4VYQ7、G7S1 W2、A4VSF4)下調表達，4個30S核糖體蛋白(A4 W3Q2、A4VYR6、A4 W3 W8、R4 NLK5)下調表達，1個核糖體RNA甲基轉移酶(G7SM56)上調表達，1個核糖體RNA甲基轉移酶(A4 W3H4)下調表達。豬鏈球菌2型為適應阿奇霉素的選擇壓力，改變核糖體蛋白表達量，從而提高其在環境中的生存能力。

4 結 論

蛋白質組學試驗顯示，低濃度阿奇霉素將全面影響豬鏈球菌2型催化活性和代謝過程。膜蛋白，例如藥物外排泵蛋白，對于豬鏈球菌2型適應阿奇霉素的選擇壓力具有重要作用。總之，豬鏈球菌2型通過改變自身蛋白質組的表達量，以適應阿奇霉素的選擇壓力。與低濃度阿奇霉素共存時，豬鏈球菌2型開啟外排泵系統，會增加細菌產生多重耐藥的風險。