基于免疫磁珠凈化間接競爭酶聯免疫吸附試驗檢測氟喹諾酮類藥物

黃婧潔，李 苗，陳瑩嫻，鐘雅蘭，張婷婷，姜廷超男，李建成*

(1.中國農業大學, 動物源性食品安全檢測技術北京市重點實驗室，北京 100193；2.中國農業大學動物醫學院，北京 100193)

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones, FQs)為人工合成的抗菌藥，它能抑制細菌DNA螺旋酶[1]，干擾DNA合成，具有抗菌譜廣、高效、低毒等特點，廣泛用于畜牧和水產養殖[2-4]。沙拉沙星是喹諾酮類化合物第三代產品——氟喹諾酮類藥物的一種，是第一個被美國批準用于食品動物的氟喹諾酮類藥物，有報道表明沙拉沙星(sarafloxacin, SAR)在體內分布極為廣泛，組織穿透力強具有較強的抗菌活性，可用于全身及深部組織感染的治療[5]，因此在國內外應用較為廣泛。可以作為氟喹諾酮類藥物的代表藥物進行研究，但該類藥物有潛在的致癌性和遺傳毒性，誘發低血糖[6]，并進一步危害人類的身體健康[7]，因此其殘留監控和檢測必不可少。目前，氟喹諾酮藥物常用的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)[8-10]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[11-13]、酶聯免疫法(ELISA)[14]、毛細管電泳法(CE)[15]、膠體金免疫層析技術(GICA)、化學發光法(CL)[16-17]、比色法[18]等。與其他方法相比，免疫法具有操作簡單、價格低廉的優點，可以實現氟喹諾酮類藥物的快速檢測。

免疫磁珠(immunomagnetic beads, IMB)是發展起來的一項新的免疫學技術，是運用核-殼的合成方法合成含有超順磁性物質的高分子表面覆蓋的復合材料，其穩定性好、能進行后期標記，利用這些物質表面的功能基團如氨基、羧基、巰基等進行抗體的共價或者非共價偶聯[19-21]，可用于結合相應的抗原或抗體，在外加磁場下做定向移動，從而達到分離，檢測的目的[22-24]。童麗[25]運用免疫磁珠結合化學發光法，實現了赭曲霉毒素a的快速檢測。免疫磁珠最近也被證明是能檢測人類腫瘤的標志物，具有高靈敏度的優點[26-28]。Olejnik等[29]和Tian等[30]對免疫磁珠凈化和SPE前處理進行比較，結果顯示，免疫磁珠清除法有較高的準確性和特異性，且材料可以重復使用。與傳統的親水親油平衡柱凈化法相比，該方法的抑制效率和靈敏度均有所提高，此外免疫磁珠凈化法簡便快速、重復性好，滿足國內外殘留檢測的要求，在實際應用中具有良好的前景，為復雜基質中藥物殘留的分析提供了一種新方法，新思路。

本研究建立了一種高效、簡便的基于免疫磁珠凈化的間接競爭酶聯免疫吸附試驗(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay, icELISA)檢測雞肉、雞肝和魚肉中氟喹諾酮類藥物的檢測方法。將代表藥物沙拉沙星單克隆抗體固定在直徑為2.8 μm的羧基化磁珠表面。簡單提取后，藥物被免疫磁珠特異性吸附，上清液被磁選去除。在icELISA之前，通過甲醇洗脫釋放保留在磁珠上的分析物，分別對免疫磁珠制備、免疫磁珠凈化和icELISA條件進行了優化，該法準確可靠，方便快速，靈敏高效，可滿足11種氟喹諾酮類藥物殘留檢測的要求，在實際應用中具有良好的前景。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

羧基磁珠：生物級，蘇州海貍生物醫學工程有限公司；沙拉沙星、環丙沙星、諾氟沙星、萘啶酸、培氟沙星、奧比沙星、依諾沙星、鹽酸二氟沙星、達氟沙星、氟羅沙星、洛美沙星、鹽酸金霉素、美他環素、鹽酸多西環素、吉他霉素、替米考星、羅紅霉素：標準品，國藥集團化學試劑有限公司；十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、蔗糖、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、碳酸鈉(Na2CO3)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、疊氮化鈉(NaN3)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、Tween-20、嗎琳乙磺酸(MES)、0.1 mol·L-1鹽酸溶液、濃硫酸溶液、Proclin 300：生物級，美國Sigma公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、甲醇、乙腈：生物級，阿拉丁公司；沙拉沙星單克隆抗體、沙拉沙星包被原(SAR-OVA)、底物顯色液(A/B液)、羊抗鼠IgG，北京維德維康生物技術有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒：美國 Thermo公司。

試驗所用雞肉、雞肝、魚肉為市場購買，經高效液相色譜串聯質譜(HPLC-MS/MS)檢測為氟喹諾酮類藥物陰性。0.1 mol·L-1MEST緩沖液、0.1 mol·L-1PBS緩沖液、0.1 mol·L-1碳酸鹽緩沖液(CB液，包被用)均為實驗室配制。磁珠用封閉液(0.1 mol·L-1，500 mL 0.01 mol·L-1PBST中加入25 g脫脂奶粉，混勻備用)；ELISA用封閉液(0.05 mol·L-1，Na2HPO4·12H2O 5.8 g，NaH2PO4·2H2O 0.693 g，蔗糖 50 g，酪蛋白 2.5 g，小牛血清50 mL，Proclin 500 mL，加蒸餾水水定容至1 L)；酶稀釋液(750 mL蒸餾水中加入Na2HPO4·12H2O 4.35 g，NaH2PO4·2H2O 0.65 g，甘油50 mL，恒溫加熱攪拌12 h，待冷卻室溫后加入小牛血清200 mL、Proclin 300 mL，混合均勻，4 ℃保存備用)。

1.2 主要儀器與設備

Multiskan FC酶聯免疫測定儀：美國Thermo公司；Quattro LC超高效液相色譜儀串聯質譜儀：美國 Waters 公司；Mag-12-1-2磁分離架：深圳市博爾熙科技發展有限公司；BE-1200z旋轉混合儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Primo R臺式高速冷凍離心機：德國賀力氏臺式高速冷凍離心機；PHSJ-3F pH檢測儀：上海雷磁儀器有限公司；WH-I 型微型漩渦混合儀：上海儀電分析儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；RP508恒溫搖床：上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 制備免疫磁珠與條件優化

1.3.1 磁珠活化 取100 μL(10 mg·mL-1)羧基化磁珠于 2 mL圓底離心管內，渦旋混勻10 s，置于磁分離架上磁性分離3 min，去除上清。加入200 μL MEST (pH 7.2)洗滌磁珠，渦旋混勻 10 s，磁分離去除上清，重復洗滌3次。加入新鮮配置EDC(10 mg·mL-1)和 NHS(10 mg·mL-1)各 100 μL活化磁珠，置于垂直混合儀上，25 ℃活化30 min。加入MEST 200 μL洗滌磁珠，渦旋混勻10 s，磁分離去除上清，重復洗滌2次后，去上清備用。

1.3.2 抗體與磁珠偶聯及優化 分別添加5、10、15、20、25 μg 5個水平的沙拉沙星單克隆抗體至上述離心管，控制單一變量，添加五個pH(4.4～8.4)水平的PBST緩沖液使總體積為100 μL，渦旋混勻室溫孵育時間分別為30、60、90、120 min。離心管置于磁力架上分離3 min，收集上清液和第1次PBST緩沖液清洗的上清(使用BCA試劑盒測定上清液中沙拉沙星單克隆抗體的濃度，每種上清液做3份平行，取平均值根據體積100 μL，計算上清液中的抗體剩余量，按式(1)計算偶聯率)，重復洗滌3次。在旋渦混合儀上加入200 μL PBST緩沖溶液(0.01 mol·L-1，pH 7.4，5%脫脂奶粉)封閉1 h后磁分離去上清， 0.01 mol·L-1PBST緩沖液洗滌3次后，根據磁珠使用說明，用200 μL PBST(含0.02 mL·L-1Proclin 300，0.1 mL·L-1BSA)重懸磁珠能維持磁珠性能穩定，4 ℃保存備用。

(1)

1.3.3 免疫磁珠穩定性測定 取200 μL濃度為1 mol·L-1的NaCl溶液對偶聯了抗體的磁珠分別洗脫3次、5次，除去磁珠表面結合很松散的抗體，通過使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測NaCl溶液連續洗脫后上清中剩余抗體量，從而確定抗體偶聯量。按式(2)計算免疫磁珠偶聯抗體的穩定性。

(2)

其中，φ表示免疫磁珠穩定性(%)，z1為洗脫后免疫磁珠上偶聯的抗體量，z2為洗脫前免疫磁珠上偶聯的抗體量。

1.4 間接競爭ELISA檢測方法的建立

1.4.1 免疫磁珠捕獲抗原與抗原洗脫的優化 吸取已經制備好的免疫磁珠1.5 mg (50 μL)于1.5 mL尖底離心管中，用500 μL PBST (pH 6.4)洗滌，重復3 次，置于磁力架上分離，棄上清備用。分別取1、10、100 ng·mL-1的沙拉沙星標準溶液500 μL加入上述離心管，確定最佳抗原添加量，室溫孵育時間分別為20、30、40 min，磁力架分離收集上清。用 PBST (pH 6.4) 洗滌 4 次，分別取400 μL, 60～100 mL·L-15個不同濃度甲醇水溶液洗脫抗原，37 ℃洗脫6 min，磁力架分離并收集上清。用500 μL PBST(含0.02 mL·L-1NaN3，0.5 mL·L-1BSA)重懸磁珠，置于4 ℃保存備用。免疫磁珠捕獲抗原和抗原洗脫的情況分別用吸附率式(3)和洗脫率式(4)來評價。

(3)

(4)

1.4.2 沙拉沙星單克隆抗體交叉反應率 采用icELISA方法，測定標準品分別為不同濃度的10種常見的氟喹諾酮類藥物，3種四環素類藥物和2種大環內酯類藥物，計算競爭物的IC50。用式(5)計算各競爭物的交叉反應率：

(5)

1.4.3 icELISA方法的優化 SAR-OVA稀釋至實際濃度約為4、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1，SAR單抗分別稀釋1 000倍、3 000倍、9 000倍、27 000倍，根據OD450 nm為1.5左右時ELISA試驗靈敏度較高，選擇抗體的最佳稀釋倍數為3 000，濃度約為1.5 μg·mL-1，包被原的濃度選擇2 μg·mL-1。用免疫磁珠凈化抗原后，建立icELISA方法來檢測抗原量。將2 μg·ml-1SAR-OVA以100 μL·孔-1加入96孔酶標板內，37 ℃溫育2 h。以PBS(0.01 mol·L-1，pH 7.4)為洗液，洗滌兩遍，甩干。封閉：加入150 μL·孔-1的封閉液，37 ℃溫育1 h，直接甩干。沙拉沙星標準品以50 μL·孔-1加入96孔酶標板，零標孔加入PBS，每孔各加2 μg·mL-1沙拉沙星單抗50 μL·孔-1，37 ℃溫育30 min，PBS洗滌4次，甩干。加入酶標二抗(酶稀液1∶5 000倍稀釋)100 μL·孔-1，37 ℃溫育30 min，PBS洗滌4次，甩干。加入新鮮配置底物顯色液A液和B液(1∶1)混合液100 μL·孔-1，室溫避光反應15 min后加入濃硫酸終止反應，用酶標儀測得OD450 nm。為了提高檢測的靈敏度，對用單抗建立的 icELISA 方法進行優化，建立標準曲線，優化過程中設立3個平行，1個空白對照。ELISA結果的IC50通過軟件origin8.5計算，抑制率通過以下公式(6)計算：

(6)

以單一變量的原則，通過對包被條件(4 ℃包被過夜、室溫包被2 h和37 ℃包被2 h)、包被液(CB溶液和PBS溶液)與封閉液(0.2%和0.5%脫脂奶粉水溶液、0.05 mol·L-1BSA封閉液)、封閉時間(30、60、90、120 min)、緩沖液中離子濃度(0、0.01、0.05、0.2 mol·L-1的PBS緩沖液)及二抗最佳反應時間(15、30、60 min)分別優化。根據上述優化試驗選出的最佳icELISA條件，建立標準曲線，進行實際樣品的檢測。

1.4.4 樣品的添加回收試驗

1.4.4.1 樣品前處理：稱取均質后的雞肉、雞肝、魚肉樣品各(1.0±0.02) g，置于50 mL離心管中，空白雞肉、雞肝中加入甲醇，魚肉中加入乙腈，各8 mL，勻質儀24 000 r·min-1混合10 s，旋渦震蕩5 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清至10 mL離心管中，37 ℃氮氣吹干，用5 mL 2.5 mL·L-1的甲醇-PBST(含0.25%甲醇的PBST溶液)復溶。

1.4.4.2 基質加標：向待檢樣品加入適量沙拉沙星標準品至濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、10 ng·mL-1。向免疫磁珠離心管中加入500 μL上述制備的待檢樣品，渦旋混勻，37 ℃搖床上反應30 min，磁分離后，用PBST溶液洗滌免疫磁珠3次。再向磁珠中加入500 μL 90 mL·L-1甲醇水，重懸磁珠，渦旋混勻，37 ℃搖床上反應30 min以洗脫抗原，磁分離架分離保存上清液，所述上清液即為icELISA待檢樣品。以添加濃度對數為橫坐標，以OD450 nm值為縱坐標，用Origin8.5軟件進行非線性擬合分析，得到雞肉、雞肝和魚肉基質中的標準曲線，并分析基質效應大小。

1.4.4.3 檢測限的確定：分別測定20份空白雞肉、雞肝和魚肉樣品，經前處理后進行icELISA檢測，取OD450 nm的平均值減3倍標準偏差，對應基質標準曲線上的濃度即為檢測限(LOD)[31]。

1.4.4.4 準確度與精密度的測定：分別在空白雞肉、雞肝和魚肉樣品中添加經2.5 mL·L-1甲醇-PBST溶液(含0.25%甲醇的PBST溶液)稀釋的沙拉沙星、環丙沙星、諾氟沙星、萘啶酸、培氟沙星、奧比沙星、依諾沙星、鹽酸二氟沙星、達氟沙星、氟羅沙星、洛美沙星11種標準品，至終濃度分別為1、2和4 μg·kg-1，每個濃度設立3個平行，經前處理后稀釋10倍進行icELISA檢測，測定樣品OD450 nm值，根據建立的基質加標曲線計算出各個樣品中藥物濃度，計算添加回收率式(7)和變異系數。

(7)

1.4.5 與儀器方法比較 取10份經LC-MS/MS確證為氟喹諾酮類藥物陰性的雞肉樣品，加入沙拉沙星標準品使其濃度分別為1.0、2.0和4.0 μg·kg-1，同時使用本研究所建立的icELISA方法和GB 31650—2019《動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測-高效液相色譜法》(農業部1025號公告14-2008)標準[32]進行檢測，并對2種測定方法進行分析。

2 結 果

2.1 免疫磁珠制備條件優化

選用5個水平的沙拉沙星單克隆抗體添加量與羧基磁珠偶聯，結果見圖1a，當抗體添加量達到15 μg時，偶聯率達到最大。本試驗選擇添加15 μg的抗體與磁珠偶聯。反應體系中的pH會影響抗體氨基和羧基磁珠的反應程度，過酸或過堿條件會影響抗體的活性，通過在pH 5個水平的PBST緩沖液中偶聯磁珠與抗體，確定偶聯緩沖液的最佳pH。所測得的偶聯率見圖1b，pH在4.4左右時，抗體與免疫磁珠偶聯率最高。抗體與磁性微球偶聯的時間結果見圖1c，偶聯率隨時間增加而逐漸升高，偶聯時間在90～120 min時，偶聯率增加不明顯。為了達到最佳效果同時節省時間成本，選擇偶聯時間為90 min，對偶聯抗體的磁珠洗脫3、5次穩定性分別為99.96%和89.34%，為保證磁穩定性，磁珠重復利用次數為3次。

2.2 免疫磁珠凈化條件優化

本研究選擇1、10、100 ng·mL-13個濃度的標準品溶液沙拉沙星，用吸附率來評價不同濃度抗原中免疫磁珠對抗原的吸附情況。如圖1 d所示，隨著抗原添加濃度的增大，抗原吸附率也隨之增大，在沙拉沙星藥物添加量為1 ng·mL-1濃度時，抗原吸附率為53.31%，說明本研究制備的免疫磁珠可捕獲到微量的藥物分子。圖1e展示了抗原捕獲反應時間的優化結果。在40 min時，抗原吸附率達到最大。選擇不同濃度的甲醇水作為洗脫液，優化結果見圖1f。

圖中數值表示(每個數值代表3次重復試驗的平均值)：a. 不同抗體添加量下的偶聯率；b. 不同pH緩沖液下的偶聯率；c. 不同偶聯時間下的偶聯率；d. 不同抗原添加量的抗原吸附率；e. 不同時間下的抗原吸附率；f. 不同洗脫液下免疫磁珠洗脫率

2.3 沙拉沙星單克隆抗體交叉反應率

交叉反應率是評價單克隆抗體特異性的重要標志，本研究的沙拉沙星單克隆抗體具有廣譜性，與10種氟喹諾酮類藥物具有良好的交叉反應，可用于氟喹諾酮類藥物的殘留檢測。與四環素和大環內酯類藥物均沒有交叉反應，說明該抗體具有良好的特異性，結果見表1。

表1 沙拉沙星單克隆抗體的交叉反應率測定結果

2.4 間接競爭ELISA方法的優化

為了提高檢測的靈敏度，根據IC50和零標孔OD450(B0)，確定最佳反應條件。結果表明。選擇37 ℃孵育2 h作為包被條件、最佳包被液為CB液、將BSA作為封閉液封閉1 h，緩沖液PBS最佳離子濃度為0.01 mol·L-1，競爭反應時間37 ℃溫育30 min，二抗反應時間30 min，在此條件下初步建立基于免疫磁珠清除的間接競爭ELISA檢測方法。

2.5 建立標準曲線

根據上述優化試驗選出的最佳icELISA條件，建立標準曲線，如圖2。IC50值為0.732 81，方法的線性范圍為0.56～3.21 ng·mL-1。

圖2 沙拉沙星標準曲線

2.6 基質效應

向空白樣品中加入一定量的沙拉沙星標準品制備梯度濃度的待檢樣品，與圖2的標準曲線進行比較，分析基質效應大小。結果如圖3，基質加標IC50為0.822 6～0.930 7 ng·mL-1，線性范圍為0.53～3.78 ng·mL-1，可以看出二者基本一致，免疫磁珠凈化效果較好，基質對icELISA的影響可以忽略。

圖3 雞肉、雞肝、魚肉基質中沙拉沙星標準曲線

2.7 準確度和精密度

每個水平做3個平行。將各樣品測得的OD450 nm值，代入基質標準曲線，計算得出添加回收率[33-34]，結果見表2。氟喹諾酮類藥物在雞肉、雞肝、魚肉的檢測限均不超過1.33、2.17、2.31 μg·kg-1，添加回收率均在76.83%～98.70%，且日間日內變異系數均不超過15%。符合對殘留檢測方法準確度 (60%～120%)和精密度的要求(<20%)。

表2 沙拉沙星、環丙沙星等11種氟喹諾酮類藥物在空白樣品添加回收結果

(續表2 Continued)

(續表2 Continued)

2.8 與儀器方法進行比較

根據本研究建立的免疫磁珠凈化icELISA方法檢測雞肉中氟喹諾酮類藥物，與HPLC方法進行對比，結果相關性分析如圖4所示，按照國標方法GB 31650—2019規定的HPLC方法得到雞肉中檢測限為1.7 μg·kg-1，本文“2.7”部分測定本方法的雞肉檢測限為1.33 μg·kg-1，該方法與儀器分析結果高度一致(相關系數R2=0.993)，說明經免疫磁珠進行前處理的icELISA方法結果可靠，可以用于氟喹諾酮類藥物在實際樣品中的殘留檢測。

圖4 本方法與儀器方法的相關性分析

3 討 論

氟喹諾酮類藥物具有致癌性和致突變性，危及消費者健康及生命安全，目前食品中氟喹諾酮類藥物檢測方法主要是儀器方法，但該方法價格昂貴，前處理過程復雜，耗時較長。為了提高效率，降低檢測成本，本研究開發了一種免疫磁珠凈化的前處理過程，結合ELISA實現了氟喹諾酮類藥物的快速檢測。

免疫磁珠凈化方法將固化試劑特有的優點與免疫學反應的高度特異性結合于一體，在免疫檢測、細胞分離、生物大分子純化和分子生物學等方面得到了越來越廣泛的應用。該分離技術實現了對目標物質的快速富集與分離，提高了免疫測定的靈敏度[35-36]，縮短了檢測時間[37]。免疫磁珠的合成是建立磁珠凈化方法的核心，高質量的抗體對于免疫富集的特異性與準確性具有重要意義[38]，抗體添加量及偶聯時間直接影響偶聯率從而影響檢測方法的靈敏度。

本研究制備的免疫磁珠中沙拉沙星抗體偶聯量約為15 mg·g-1。φ值為89.9%，說明該免疫磁珠的穩定性良好，本研究中通過90%甲醇溶液洗脫免疫磁珠上的抗原，在保證檢測結果的準確可靠的前提下，該免疫磁珠可重復使用3 次。結果顯示，本研究建立的氟喹諾酮類藥物免疫檢測方法，在雞肉、雞肝、魚肉的檢測限分別為1.33、2.17、2.31 μg·kg-1，本研究較好地簡化前處理步驟，省去萃取步驟，與儀器方法相比，極大縮短了檢測時間；與生物學方法相比[39]，克服了試劑及環境的污染；與全基因測序相比，對檢測人員的技術要求不高。但不足之處在于，該檢測方法對于抗體特異性要求較高，因此在抗體方面還有待進一步研究，總之，本研究建立了一種快速簡便，靈敏度高、選擇性好的雞肉、雞肝和魚肉中氟喹諾酮類藥物的檢測方法。

4 結 論

本研究建立的磁珠凈化與檢測一體化icELISA法檢測氟喹諾酮類藥物操作簡便，僅用一個磁力架就能完成前處理，經過免疫磁珠對樣本中待測物質的特異性捕獲，濃縮富集，既提高了靈敏度，又有效地降低了基質的影響，降低假陽性率，大大提高了檢測方法的靈敏度和特異性。因此進一步探究免疫磁珠凈化在實際殘留檢測中的應用具有重要意義。同時證實了磁珠富集與icELISA聯合檢測的應用效果，檢測結果與HPLC法結果一致，通過偶聯不同的單克隆抗體，以期可建立更多的藥物殘留量檢測方法，為保障動物性食品安全提供新思路。