仔鼠哺乳期補充參苓白術散改善抗生素誘導的腸道穩態失衡

張文嫦，王志華，練家樂，屈 倩，呂偉杰，陳淑愛，郭世寧*

(1.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642； 2.山東莒縣畜牧獸醫管理服務中心，莒縣 276500)

生命早期，腸道菌群的建立是一個循序漸進的過程，而母體的營養健康狀況、分娩方式和飲食的變化等[1-3]能顯著影響其仔代腸道菌群的發育及成熟。此外，從母乳轉換到固體食物(或實施斷奶)[4]及抗生素的使用[5-7]，能導致腸道微生物的組成發生顯著變化，特別是在畜牧養殖行業中，仔豬、犢牛、羔羊等在早期斷奶時容易出現腹瀉、免疫力下降、攝食減少、生長緩慢等一系列應激反應，嚴重影響養殖業的經濟效益[8-9]；研究表明，仔畜斷奶應激導致的腹瀉與腸道屏障結構破壞及功能受損有關[9]。胃腸道作為體內最大的免疫器官，其屏障功能的正常運行在維持機體免疫平衡中發揮重要作用。其中，腸上皮細胞中的緊密連接蛋白是構成腸道物理屏障的主要成分，包括緊密連接蛋白Claudin、Occludin、ZO-1(Zonula occludens 1)等[10]。已有研究表明，腸道微生物可以影響腸道屏障功能[11]，如乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)以及Bacteroidesthetaiotaomicron、Akkermansiamuciniphila等新一代益生菌，這些菌屬可以通過分泌細胞外蛋白有效減弱病原體的黏附，或增加JAM-1(Junctional adhesion molecule 1)、Occludin、Claudin-1和ZO-1在內的緊密連接蛋白的表達來保護腸道屏障，維持腸上皮穩態，促進腸道健康[12-14]。

參苓白術散出自宋代《太平惠民和劑局方》，具有健脾益氣、滲濕止瀉之功。臨床上，參苓白術散既可以單獨使用以治療潰瘍性結腸炎，又可以與中藥復方如附子理中丸[15]、桃花湯[16]、理中湯[17]等聯合使用治療克羅恩病等腸道疾病。本研究主要目的是探討哺乳期母鼠使用抗生素對仔代腸道菌群、斷奶應激的影響，同時觀察應用參苓白術散能否通過改善仔鼠腸道健康而減輕早期斷奶應激，以期為畜牧養殖業中調節母畜腸道穩態，提高仔畜腸道健康提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料與試劑 參苓白術散中藥飲片購自北京同仁堂有限公司；鹽酸萬古霉素、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、甲硝唑、硫酸新霉素購自北京索萊寶科技有限公司；ZO-1、Occludin抗體購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.2 試驗動物 妊娠SD大鼠，SPF級，購自南方醫科大學試驗動物中心。

1.1.3 儀器設備 MK3型酶標儀，賽默飛(上海)儀器有限公司； EPS600電泳儀，上海天能科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 分組 9只妊娠17～18 d雌性SD大鼠，隨機均分成3組，分組及處理見圖1，抗生素的使用劑量參考文獻[18]方法。

圖1 試驗過程流程圖

1.2.2 樣品采集 分娩后第7、14和21天記錄每組仔鼠體重，第14和21天采集糞便于-80 ℃保存；仔鼠安樂死后記錄心、肝、脾、肺、腎重量；分離結腸于-80 ℃保存，同時另取0.5 cm近盲腸端結腸固定于4%甲醛溶液中，用于HE染色。

1.2.3 微生物群落多樣性組成譜研究 采用DNeasy PowerSoilKit對仔鼠糞便樣本進行DNA抽提，并通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量；采用F:ACTCCTACGGGAGGCAGCA、R:CGGACTACHVGGGTWTCTAAT序列對16S rRNA V3-V4區域進行擴增，并通過Illumina測序平臺對群落微生物DNA片段進行雙端測序，使用DADA2插件對擴增序列進行去引物、質量過濾、去噪、拼接和去嵌合體等優化，經DADA2方法處理后的序列稱為ASVs(amplicon sequence variants)；基于細菌16S rRNA Greengenes數據庫(gg_13)進行物種注釋，基于默認參數使用QIIME2中的Naive bayes分類器對ASVs進行物種分類學分析。

1.2.4 蛋白免疫印跡檢測結腸組織中ZO-1和Occludin的表達量 將結腸組織加入適量裂解液低溫勻漿后，12 000×g離心5 min，取上清；BCA法測定蛋白濃度，按蛋白總量10 μg每孔等體積上樣；電泳時間為70 v，30 min； 100 v，2 h；轉膜：150 mA，90 min；TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min，用5%牛血清蛋白于搖床上室溫封閉1.5 h；封閉結束后TBST洗滌3次，每次5 min；4 ℃過夜孵育一抗ZO-1(1∶1 000)、Occludin(1∶1 000)；TBST清洗3次，每次5 min，室溫孵育二抗(1∶10 000)1 h；TBST清洗3次，每次5 min，加入發光液顯影，掃描拍照。

2 結 果

2.1 參苓白術散對仔鼠體重的影響

對不同天數不同組別的仔鼠進行稱重，結果如表2所示，在第7、14和21天，與CON組相比，ABX組的仔鼠體重顯著降低(P<0.05)。第21天時，與ABX組相比，SLBZS組仔鼠的體重顯著增加(P<0.05)。

表2 各組仔鼠的體重情況

2.2 參苓白術散對仔鼠臟器指數的影響

如表3所示，在第21天時，與CON組仔鼠比，ABX組及SLBZS組仔鼠的肝臟指數顯著降低(P<0.05)，ABX組仔鼠的脾臟指數顯著降低(P<0.05)；與ABX組仔鼠比，SLBZS組仔鼠的脾臟指數顯著升高(P<0.05)。

表3 第21天各組仔鼠的臟器指數

2.3 參苓白術散對仔鼠腸道微生物區系組成的影響

根據16S rRNA基因測序結果分析，使用韋恩圖展示各組ASVs數目，在第14天時，CON組和ABX組之間共有的ASVs數目為143個，而CON組中獨有的ASVs數目為3 921個，ABX組中獨有的ASVs數目為656個(圖2a)；在第21天時，三組共有的ASVs數目為84個，CON組與ABX組之間共有的ASVs數目為38個，CON組與SLBZS組之間共有的ASVs數目為122個，ABX組與SLBZS組之間共有的ASVs數目為1 004個(圖2b)。樣品的稀疏曲線(Rarefaction Curve)趨于平緩(圖2c)，說明測序數據量漸進合理，滿足測序要求，物種的豐富度較高，物種分布均勻。在第14天時，與CON組相比，ABX組的微生物群落在綱、目、科、屬、種五種分類水平上的單元數均顯著降低(P<0.05，表4)。在第21天時，與CON組相比，ABX組與SLBZS組的微生物群落在門、綱、目、科、屬五種分類水平中的單元數均顯著降低(P<0.05)，而SLBZS組的微生物群落在種分類水平中的單元數有所增加(表5)。

表4 第14天各水平微生物分類單元數統計表

表5 第21天各水平微生物分類單元數統計表

a、b. 第14和第21天ASVs韋恩圖；c. 第14和第21天稀疏曲線

2.4 參苓白術散對仔鼠腸道微生物區系多樣性的影響

選取Chao1、Observed species、Shannon、Simpson等指數評估微生物群落的α多樣性。結果顯示，在第14天時，ABX組微生物群落的Chao1、Observed species、Shannon、Simpson指數顯著低于CON組(P<0.05，圖3a)。第21天時，ABX組微生物群落的Chao1、Observed species指數顯著低于CON組(P<0.05)，Shannon、Simpson指數差異不顯著(圖3b)。此外，與ABX組比，SLBZS組Chao1、Observed species指數顯著升高(P<0.05)，Shannon、Simpson指數差異不顯著(圖3c)。通過主坐標分析(Principal coordinate analysis，PCoA)對多維的微生物數據進行β多樣性分析，結果顯示，在第14天時，距離矩陣的比例為51.2%時能將CON組與ABX組樣本分開(圖3 d)；在第21天時，距離矩陣的比例為30.5%時能將CON組與其余兩組分開，距離矩陣的比例為16.5%時能將ABX組和SLBZS組分開。以上結果說明CON組、ABX組與SLBZS組樣品中的微生物的多樣性存在差異(圖3e)。

a、b、c: 第14和21天Alpha多樣性指數的分組箱線圖；d、e: 第14和21天PCoA分析二維排序圖；* 表示 P <0.05，** 表示 P<0.01

2.5 參苓白術散對仔鼠腸道微生物物種在門、屬水平顯著差異性的影響

第14天時，在門水平上，ABX組仔鼠糞便樣本中Firmicutes和Bacteroidetes的相對豐度低于CON組，而Proteobacteria的相對豐度高于CON組(圖4a)；在屬水平上，ABX組中Lactobacillus、Shigella的相對豐度高于CON組，而Bacteroides、Blautia等菌屬的相對豐度低于CON組(圖4b)。第21天時，在門水平上，ABX組仔鼠糞便樣本中Firmicutes和Bacteroidetes的相對豐度低于CON組，而Proteobacteria的相對豐度高于CON組(圖4c)；與ABX組仔鼠比，SLBZS組仔鼠糞便樣本中Firmicutes的相對豐度明顯升高，Proteobacteria的相對豐度明顯降低(圖4c)；此外，在SLBZS組仔鼠糞便樣本中Verrucomicrobia的相對豐度明顯高于CON組與ABX組(圖4c)。在屬水平上，ABX組仔鼠糞便樣本中Shigella、Sutterella、Enterococcus等菌屬的相對豐度高于CON組，而Lactobacillus、Prevotella、Blautia等菌屬的相對豐度低于CON組(圖4 d)；與ABX組仔鼠比，SLBZS組仔鼠糞便樣本中Shigella、Sutterella、Enterococcus等菌屬的相對豐度降低，Lactobacillus、Clostridiaceae_Clostridium、Blautia等菌屬的相對豐度升高，且在SLBZS組中觀察到Akkermansia的相對豐度明顯升高(圖4 d)。

采用LEfSe(LDA Effect Size)分析方法對不同組樣本間在所有分類水平上進行差異性比較分析，并以LDA score柱狀圖展示每個組內顯著富集的物種。結果顯示，第14天時，在CON組與ABX組間(LDA閾值為3時)共有45個差異項，其中在ABX組中富集的有g_Aggregatibacter、f_Enterobacteriaceae_g_Pseudomonas等8個；在CON組中富集的有p_Bacteroidetes、g_Bacteroides、g_Blautia,g_Bifdobacterium、g_Akkermansia等37個(圖4e)。第21天時，在CON組、ABX組及SLBZS組中(LDA閾值為4時)共有37個差異項，其中在ABX組中富集的有p_Proteobacteria、c_Gammaproteobacteria、c_Betaproteobacteria、g_Enterococcus、g_Shigella、g_Sutterella等14個；在CON組中富集的有p_Bacteroidetes、g_Prevotella、g_Paraprevotella、g_Bacteroides等11個；在SLBZS組中富集的有p_Verrucomicrobia、g_Eubacterium、g_Akkermansia、g_Clostridium等14個(圖4f)。

a.第14天各組門水平相對豐度柱狀圖；b. 第14天各組屬水平相對豐度柱狀圖；c. 第21天各組門水平相對豐度柱狀圖；d. 第21天各組屬水平相對豐度柱狀圖；e. 第14天LDA score柱狀圖；f. 第21天LDA score柱狀圖

2.6 參苓白術散對仔鼠結腸中Occludin和ZO-1蛋白表達的影響

第14天ABX組仔鼠結腸中Occludin蛋白表達量顯著低于CON組(P<0.05，圖5a)，ZO-1蛋白表達情況無顯著差異(P>0.05，圖5c)。第21天ABX組中的仔鼠結腸中ZO-1、Occludin的表達量顯著低于CON組(P<0.05)，SLBZS組中的仔鼠結腸中ZO-1、Occludin的表達量顯著高于ABX組(P<0.05，圖5b、5d)。

a.第14天仔鼠結腸緊密連接蛋白Occludin表達量；b.第21天Occludin蛋白表達量；c.第14天ZO-1蛋白表達量；d.第21天ZO-1蛋白表達量。左邊為蛋白表達灰度圖，右邊為灰度分析柱狀圖。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.7 參苓白術散對仔鼠結腸組織病理學的影響

結腸組織切片結果顯示，CON組仔鼠結腸組織結構完整、清晰，且排列整齊、連續性好，無炎性細胞浸潤；ABX組仔鼠結腸組織有明顯的炎性細胞增生浸潤(圖中紅色圈所指)；給仔鼠灌胃參苓白術散后炎性細胞浸潤程度減輕(圖6)。

圖中紅色圈中提示出現炎性細胞浸潤

3 討 論

在生命早期，幼崽出現腸道感染的幾率較高，而其中一個重要的原因是幼崽腸道菌群發育的不成熟，不能有效地防止病原體在腸道中的定植。此外，仔代腸道菌群的早期建立在很大程度上受到母體菌群的影響，研究發現，哺乳期給母鼠連續使用萬古霉素能顯著降低母乳菌群的α多樣性，同時其后代仔鼠腸道菌群的α多樣性也顯著下降，并伴隨著脾中B細胞數量顯著下降[19]，這可能降低新生仔鼠對病毒的抵抗力[20]。與此相似，在本試驗結果中，對哺乳期的母鼠使用抗生素，顯著降低其仔代腸道微生物的α多樣性及各分類水平上的物種單元數，增加Shigella、Sutterella、Enterococcus等有害菌屬的相對豐度，并下調仔鼠結腸緊密連接蛋白的表達，這可能導致結腸上皮中有害菌的易位從而增加其仔代患腸道炎癥的風險。有研究表明，參苓白術散可以恢復脾虛模型小鼠的黏膜層厚度及增加腸腺數目[21]，上調CD(Crohn’s disease)模型大鼠結腸緊密連接蛋白中Claudin-1蛋白的表達[22]，還可以調節腸道菌群，增加有益菌如雙歧桿菌的豐度并降低病原菌如腸球菌的豐度，提高宿主腸道黏膜對致病菌定植的抵抗能力[23]。與他人研究結果相似，本研究也發現給仔鼠灌胃參苓白術散水煎液后，仔鼠腸道微生物中乳桿菌屬(Lactobacillus)和嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)等有益菌屬的相對豐度升高，腸道屏障功能得到改善。

3.1 參苓白術散對仔鼠體重及臟器指數的影響

在腸道菌群正常的發育過程中，厚壁菌門和擬桿菌門始終作為優勢菌群，厚壁菌門與擬桿菌門的比例失衡能引起仔鼠糖代謝與脂代謝的失調，從而影響仔鼠的正常發育與體重的變化[24-26]，本研究中，ABX組仔鼠體重的顯著降低可能與其厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著降低有關，而對仔鼠灌胃參苓白術散后其體重得以恢復則可能與其厚壁菌門的相對豐度升高有關。有報道發現，營養不良兒童腸道微生物中變形菌門顯著富集，而擬桿菌門相對豐度則顯著降低[27]，本試驗中，仔鼠在接受參苓白術散治療后厚壁菌門的相對豐度升高，與此相對應，SLBZS組仔鼠的體重恢復至正常水平，此外，參苓白術散灌胃后還降低了變形菌門的的相對豐度，但沒有恢復擬桿菌門的相對豐度，分析原因可能是在斷奶前后，由于變形菌門豐度的增多改變了仔鼠的腸道環境，如pH和氧氣濃度等，而腸道免疫系統尚未完善，無法調節腸道的穩態，導致擬桿菌門中的微生物無法在腸道定植[28]。脾是一個由結締組織和淋巴組織組成的復雜的外周淋巴器官，是多種免疫細胞產生、定殖和產生免疫應答的場所[29]。作為動物體內重要的免疫器官，脾臟指數的高低可以衡量動物機體免疫能力的強弱[30]。本研究中，ABX組仔鼠脾臟指數顯著低于CON組仔鼠，說明母鼠使用抗生素可能會降低其仔代的免疫力，而使用參苓白術散治療后，脾臟指數恢復至CON組水平，說明參苓白術散有助于促進脾的發育并可能提高仔鼠機體的免疫力。

3.2 參苓白術散對仔鼠腸道微生物物種組成差異的影響

抗生素的使用能夠破壞腸道微生物群的正常定植，改變宿主腸道菌群的結構組成及生物多樣性，甚至可以在出生前損害仔代的腸道微生物群[31-32]；而本課題組前期研究發現，參苓白術散可治療抗生素相關性腹瀉，并對抗生素誘導的腸道微生物結構變化有一定的恢復作用[33]。在本研究LEfSe分析結果中，可觀察到ABX組仔鼠糞便中出現有害菌屬明顯富集，如巴斯德氏菌科(f_Pasteurellaceae)、假單胞菌屬(g_Pseudomonas)、放線桿菌屬(g_Aggregatibacter)、γ變形菌綱(c_Gammaproteobacteria)、志賀氏菌屬(g_Shigella)、薩特氏菌屬(g_Sutterella)和腸球菌屬(g_Enterococcus)等，其中志賀氏菌屬、薩特氏菌屬、腸球菌屬等為已知的有害菌屬，均可引起腸道炎[34]，甚至可以破壞結腸上皮細胞之間的緊密連接進而導致腸上皮完整性的缺失，加重炎癥感染程度[35-36]；Pasteurellaceae和Gammaproteobacteria則與細菌耐藥性升高相關，且Gammaproteobacteria相對豐度的升高還被認為是腸道菌群結構被破壞的表現[37-38]，這表明母鼠在哺乳期使用抗生素，會導致其仔鼠腸道菌群結構被破壞，增加有害菌屬的定植，并可能破壞結腸上皮的完整性，從而誘發腸道炎癥。但在接受參苓白術散灌胃后，仔鼠糞便中Shigella、Sutterella、Enterococcus等腸道致病菌的相對豐度明顯降低，而乳桿菌屬(Lactobacillus)、布勞特氏菌屬(Blautia)、阿克曼氏菌屬(Akkermansia)、真桿菌屬(Eubacterium)等有益菌屬的相對豐度升高，有研究表明，嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)不僅可以通過調節腸道內黏液厚度和維持腸道屏障的完整性發揮益生作用[39]，其還可通過調節結腸炎小鼠腸道中的免疫細胞及免疫因子發揮抗炎功能[40]；Lactobacillus和Blautia則有助于增加糞便中丁酸的濃度，而丁酸鹽能修復高脂飲食導致的腸黏膜損傷，并增加腸組織中ZO-1的表達，改善腸道健康[41]；而Eubacterium則被證明參與腸道中多種重要物質的代謝和轉化，如短鏈脂肪酸、膽固醇和膽汁酸等[42]。所以參苓白術散可能通過抑制有害菌屬的增殖，并通過增加產短鏈脂肪酸菌屬的數量，進而調節腸道緊密連接蛋白的表達，降低仔鼠患炎癥腸病的風險，達到改善仔鼠腸道健康的效果。

3.3 參苓白術散對仔鼠結腸緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1的影響

在健康動物腸腔表面，腸道共生菌與腸上皮細胞分泌物(如緊密連接蛋白，黏蛋白等)互作，形成一層生物保護屏障，有助于維持宿主腸道健康。然而，腸上皮緊密連接功能的破壞，可增加腸道的通透性并促進腸道菌群易位，從而引起腸道炎癥如IBD等[43]，而腸道菌群也能影響結腸屏障的結構和功能，如Akkermansiamuciniphila、Lactobacillus、Blautia、Bifidobacterium和Bacteroides等可以增加腸道中緊密連接蛋白的表達[44-46]。此外，Lactobacillus和Blautia在腸道中還可以通過發酵膳食纖維產生大量的短鏈脂肪酸，目前短鏈脂肪酸已被證明可以通過激活G蛋白偶聯受體，抑制組蛋白去乙?；富钚?，并下調促炎因子基因的表達，其中丁酸鹽還可以通過改變腸道中Claudin-2的水平來緩解TNF-α/IFN-γ等細胞因子誘導的屏障功能障礙[47-48]。在本試驗中，仔鼠在使用參苓白術散之后，結腸中ZO-1和Occludin的表達量顯著上升，這可能是由于灌胃參苓白術散升高了Akkermansiamuciniphila、Lactobacillus、Blautia和Eubacterium等菌群的豐度，這些微生物通過代謝使腸道內短鏈脂肪酸的含量升高，從而上調緊密連接蛋白的表達量，改善仔鼠腸道屏障結構的完整性。

4 結 論

本試驗結果表明，在母鼠哺乳期使用抗生素能導致仔鼠腸道穩態的失調，腸道菌群豐富度及多樣性顯著下降進而抑制仔鼠腸道菌群的定植與成熟，影響仔鼠的腸道屏障功能，而給予仔鼠參苓白術散可改善腸道菌群紊亂，促進仔鼠腸道菌群的定植與成熟，增強仔鼠腸道上皮屏障功能。這表明，參苓白術散具有改善腸道健康、緩解幼仔早期斷奶應激的作用。