木薯MeHsfB3a基因的克隆及其抗細菌性枯萎病功能鑒定

李琳琳，王超群，李春霞，駱 凱，王紅剛，陳銀華，張肖飛，耿夢婷*

1.海南大學熱帶作物學院，海南海口 570228；2.國際熱帶農業中心，哥倫比亞卡利 AA 6713

植物在生長發育過程中面臨生物脅迫和非生物脅迫，為了應對脅迫以維持正常生長，植物進化出了許多抵御逆境的機制[1]。其中熱激轉錄因子（heat stress transcription factors, Hsfs）是該防御體系中響應逆境信號的重要元件[2]。研究表明Hsfs參與了高溫、干旱、鹽脅迫和氧化損傷等逆境的調控，在植物抵御非生物脅迫過程中有重要作用[3-4]。在擬南芥中過量表達大白菜BrHsf16基因，可明顯提高轉基因擬南芥植株在熱脅迫下的存活率[5]。沉默辣椒CaHsfa1d基因，導致植株耐熱性降低[6]。過量表達熱激轉錄因子GmHsFA1的大豆植株在受到干旱逆境脅迫下，脯氨酸、可溶性糖含量明顯增高，植株的抗干旱性增強[7]。擬南芥AtHsfA7b可調控下游抗逆相關靶基因表達響應鹽脅迫，通過降低細胞失水率、調節滲透勢來提高植株耐鹽性[8]。用H2O2處理水稻種子，發現水稻中多個OsHsfs表達量增加，在抵抗氧化脅迫等方面發揮重要作用[9]。同時，Hsfs在作物響應病害脅迫過程中也起著重要作用。水稻白葉枯病是由黃單胞桿菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo）引起的病害，分別對水稻抗病品種‘SH5’和感病品種‘8411’接種黃單胞桿菌，6 h后OsHsfA2a、OsHsfA2b、OsHsfB2a、OsHsfB2b、OsHsfB2c、OsHsfC1b和OsHsfC2c表達量顯著上調，OsHsfA2c和OsHsfB4c表達量顯著下調，這說明Hsfs在抵御病害侵染時發揮了作用[10]。過表達AtHsfA1b的擬南芥轉基因植株在接種病原菌Pto DC3000進行抗性實驗證明，過表達植株的細菌數目顯著低于野生型，AtHsfA1b正調控擬南芥對Pto DC3000的抗病性[11]。

木薯（Manihot esculentaCrantz）是大戟科木薯屬多年生灌木，是世界三大薯類作物之一[12]。木薯塊根肉質，富含淀粉，以之為基礎的食品和生物能源等產業是熱區農業經濟的重要組成部分[13]。木薯細菌性枯萎病（cassava bacterial blight, CBB）是由菜豆黃單胞菌屬木薯細菌性枯萎病致病種（Xanthomonas phoseolipv.manihotis,Xpm）引起的病害，是影響我國木薯生產的重要病害之一。前人研究報道Xpm病原菌侵染木薯后，MeWRKY79和MeHsf20基因被誘導表達，MeWRKY79和MeHsf20轉錄因子可分別結合褪黑素合成基因MeASMT2啟動子上的W-box和HSE元件來激活MeASMT2表達，調控褪黑素的合成積累，增強木薯對Xpm病原菌的抗性[14]。木薯 MeHsf3可提高水楊酸信號途徑基因MeEDS1和MePR4的轉錄水平，參與木薯抵御Xpm病原菌的侵染[15]。

本研究基于前期轉錄組數據發現，我國木薯主栽品種‘SC8’在受到XpmHN11病原菌侵染時，熱擊蛋白轉錄因子MeHsfB3a的表達量顯著上調。為了進一步驗證MeHsfB3a在抵御木薯細菌性枯萎病中發揮的作用，本研究從‘SC8’木薯cDNA中克隆了MeHsfB3a全長序列，進行了生物信息學分析，利用qRT-PCR技術分析了該基因在木薯不同器官中的表達模式，并驗證了MeHsfB3a的表達受XpmHN11病原菌誘導；采用病毒誘導基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）技術沉默MeHsfB3a，驗證了MeHsfB3a參與木薯對木薯細菌性枯萎病抗性抗病功能，為木薯抗病育種提供新的抗性基因。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：本研究采用的木薯品種為‘華南8號’（‘SC8’），采自于海南大學木薯種質資源圃。煙草本生煙由本實驗室提供。

質粒和菌株：VIGS沉默載體 pCsCMV-NC質粒由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所周鵬老師課題組贈與。大腸桿菌菌株DH5α、根癌農桿菌菌株GV3101、木薯細菌性枯萎病菌（Xanthomonas phoseolipv.manihotisHN11,XpmHN11）由本實驗室分離獲得。

試劑：LA Taq?高保真酶購于TaKaRa公司，限制性內切酶購于NEB公司，TRIzol Reagent購自 Invitrogen公司，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購自 TaKaRa公司，Nimble cloning試劑盒購自海南壹田生物科技公司，質粒小量快速提取試劑盒、PCR產物純化回收試劑盒等均購自北京艾德萊生物科技公司。

引物：本實驗的引物均由生工生物科技（上海）有限責任公司合成，引物序列如見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2 方法

1.2.1MeHsfB3a基因的克隆 采用TRIzol法提取‘SC8’木薯總RNA，用微量分光光度計檢測提取的總RNA濃度和純度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA質量。采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉錄為cDNA，用于基因擴增。根據木薯基因組數據庫phytozome中獲得的MeHsfB3a（Manes.09G02-0300.1）序列信息，采用Premier 5.0軟件設計擴增引物MeHsfB3a-F、MeHsfB3a-R。以cDNA為模板進行PCR擴增，克隆木薯MeHsfB3a基因編碼區序列。反應體系為：TaKaRa LATaq0.2 μL，10×LA PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各 0.5 μL，模板 2 μL，加 ddH2O 補至20 μL。反應程序為：94℃預變性 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min循環 35次；72℃延伸10 min。用PCR產物純化回收試劑盒回收目的片段，連接pEASY-Blunt載體上，轉化進大腸桿菌DH5α感受態，挑取陽性單克隆進行菌落PCR檢測，送生工生物科技（上海）有限責任公司進行測序后用質粒小量快速提取試劑盒提取pEASY-Blunt-MeHsfB3a質粒。

1.2.2 MeHsfB3a生物信息學分析 將測序得到的片段序列與預測的MeHsfB3a基因編碼區序列進行比對，確定擴增的序列的正確性。MeHsfB3a蛋白的理化性質如氨基酸數、分子式、分子量、等電點、不穩定系數、脂肪指數和平均親水系數由在線網站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）進行預測。運用 GSDS（Gene Structure Display Server）在線網站分析MeHsfB3a外顯子-內含子的結構。采用 Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在線軟件對MeHsfB3a蛋白進行亞細胞定位預測。

1.2.3MeHsfB3a基因的表達分析 設計MeHsfB3a進行qRT-PCR實驗的引物：qRT-MeHsf-B3a-F、qRT-MeHsfB3a-R，以木薯新葉、成熟葉、頂芽、葉柄、塊根、韌皮部、須根為模板進行該基因表達的組織特異性分析，分別以接種了10 mmol/L MgCl2和XpmHN11病原菌不同時間點（0、3、6 h和1、3、6 d）的cDNA為模板進行qRT-PCR，分析MeHsfB3a是否響應病原菌侵染。qRT-PCR反應體系為：TB Green Premix ExTaqⅡ（2×） 10 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 2 μL，加ddH2O補至20 μL。反應程序為：95℃預變性30 s；40個循環包括95℃變性 5 s，58℃退火 30 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸5 min。每個樣品設置3個重復，以EF1α為參照基因。采用2-ΔΔCT法計算基因表達值。

1.2.4MeHsfB3a的VIGS載體構建與侵染‘SC8’木薯 采用在線軟件 SGN VIGS Tool（https://vigs.solgenomics.net/）設計誘導MeHsfB3a的沉默靶基因片段。以 1.2.1獲得的pEASY-Blunt-MeHsfB3a質粒為模板，特異性引物VIGS-MeHsfB3a-F、VIGS-MeHsfB3a-R擴增靶標片段，采用 Nimble cloning試劑盒構建pCsCMV-MeHsfB3a重組質粒。將重組質粒轉入農桿菌 GV3101，挑取陽性單克隆于含卡那霉素和利福平（濃度均為50 mg/L）的LB液體培養基中過夜培養，菌液渾濁后4000 r/min，5 min收集菌體，用10 mmol/L MgCl2清洗菌體2次，加重懸液：1 mol/L MES（嗎啉乙磺酸）+1 mol/L MgCl2+200 mmol/L AS（乙酰丁香酮）重懸菌體并調整OD600=0.75，每個處理組設置生物學重復3株，每株選擇4片發育健康的葉片，用1 mL注射器將懸浮菌液注射進木薯每片裂葉背部主葉脈兩側，每片葉注射8個孔，每個孔注射約10 μL。以含有CsCMV病毒全序列和指示基因ChlI沉默靶點的重組質粒pCsCMV-B+為正對照。ChlI是組成鎂螯合酶的亞基之一，是催化葉綠素生物合成的第一步，沉默ChlI可導致植株出現白化退綠表型。僅含有CsCMV病毒全序列的質粒pCsCMV-A-為負對照。侵染后45 d，正對照葉片出現白化退綠表型，分別提取負對照組和實驗組木薯新葉總RNA并反轉錄為cDNA檢測目的基因表達量。

1.2.5XpmHN11病原菌侵染VIGS沉默植株的抗病功能鑒定 從-80℃冰箱中取出保存的XpmHN11，劃線培養于 LPGA固體培養基上，28℃倒置培養 2 d；蘸取長出的單克隆菌落于500 μL的LPGA液體培養基中，28℃，200 r/min搖床培養20 h左右；吸取渾濁的菌液200 μL，并用涂布棒均勻涂到LPGA固體培養基上，28℃培養24 h左右，10 μmol/L MgCl2洗下菌體，放置在50 mL離心管中；4000 r/min離心5 min收集菌體，用 10 μmol/L MgCl2洗菌 2 次，再用 10 μmol/L MgCl2重懸，調OD600=0.1。使用1 mL注射器將XpmHN11菌液注射到MeHsfB3a沉默植株新葉的葉脈兩側，選擇4片葉片，每片裂葉注射4個孔，每個孔注射約 10 μL，注射后做上標記。木薯葉片侵染XpmHN11后，分別取0、3、6 d的葉片樣品，觀察水漬狀病斑的擴散情況并拍照記錄，使用ImageJ軟件計算病斑面積。

2 結果與分析

2.1 MeHsfB3a基因的克隆

以‘SC8’木薯 cDNA為模板，PCR克隆MeHsfB3a基因全長，獲得了大小約為750 bp的目的片段（圖1）。將該片段純化、回收并連接中間載體 pEASY-Blunt，轉化大腸桿菌獲得陽性克隆進行測序分析。結果表明擴增得到的MeHsfB3a片段大小為729 bp，編碼242個氨基酸。

圖1 MeHsfB3a基因克隆Fig.1 Cloning of MeHsfB3a

2.2 MeHsfB3a的生物信息學分析

利用在線網站 ExPASy分析木薯 MeHsfB3a蛋白的生理生化性質。結果顯示 MeHsfB3a蛋白理論分子式：C1224H1934N350O383S9，理論相對分子質量（Mw）為27.9 kDa，理論等電點pI為7.59。該蛋白富含：谷氨酸 Glu（10.0%）、亮氨酸 Leu（9.1%）、賴氨酸 Lys（8.7%）、絲氨酸 Ser（8.3%）、精氨酸（7.5%）、蘇氨酸（6.6%）、天冬酰胺 Asn（5.8%）。親水指數從-2.744到2.222（負值表示親水性，正值表示疏水性），親水性平均指數-0.880，表明該蛋白水溶性較好（圖2）。理論不穩定系數為56.86，屬于不穩定蛋白質。脂溶指數為65.98。利用GSDS在線網站分析MeHsfB3a基因的結構特點，結果顯示，該基因含有2個外顯子和 1個內含子。利用在線網站 Plant-mPLoc SEfvEf預測MeHsfB3a蛋白可能定位于細胞核。

圖2 木薯MeHsfB3a蛋白親水性分析Fig.2 Hydrophilicity analysis of cassava MeHsfB3a

2.3 MeHsfB3a基因的表達模式分析

采用qRT-PCR技術對MeHsfB3a基因在木薯新葉、成熟葉、頂芽、葉柄、塊根、韌皮部、須根的表達量進行分析。結果發現MeHsfB3a基因在成熟葉的表達量最高，約為新葉的45倍，其次為須根、葉柄，在其他部位中的表達極低（圖3A）。木薯‘SC8’葉片接種了XpmHN11病菌0、3、6 h和1、3、6 d后，以接種了10 mmol/L MgCl2的木薯葉片為對照，提取葉片RNA并反轉錄為cDNA進行MeHsfB3a基因表達量分析，結果發現接種1 d后該基因的表達量急劇升高，其中在6 d時，表達量提高了60倍。這說明MeHsfB3a基因的表達受XpmHN11病菌的誘導（圖3B）。

圖3 MeHsfB3a基因表達模式Fig.3 Expression pattern of MeHsfB3a

2.4 VIGS沉默驗證MeHsfB3a參與木薯對細菌性枯萎病抗病過程

2.4.1 VIGS沉默效果分析 接種VIGS實驗的正對照pCsCMV-B+載體，在侵染45 d后，木薯新葉出現了白化退綠現象，而負對照 pCsCMV-A-與pCsCMV-MeHsfB3a重組質粒的葉片無變化，這表明pCsCMV-NC系統已經對木薯內源的ChlI基因產生了沉默（圖4）。提取實驗組 pCsCMVMeHsfB3a和負對照 pCsCMV-A-的木薯新葉的總RNA并反轉錄為cDNA，通過qRT-PCR檢測目的基因沉默效率。每組數據來自3個生物學重復（3株），結果如圖（圖5），與負對照植株相比，沉默植株新葉中的MeHsfB3a表達量下降了68.26%~82.44%，說明MeHsfB3a基因在新葉受到了有效沉默，可以對新葉進行后續抗性實驗。

圖4 VIGS試驗后木薯葉片表型變化Fig.4 Phenotypic changes of cassava leaves after VIGS test

圖5 VIGS沉默MeHsfB3a的效果檢測Fig.5 Detection of target gene expression after VIGS

2.4.2 VIGS沉默植株抗病性檢測 為了驗證MeHsfB3a在木薯抗細菌性枯萎病過程中的功能，本研究將病原菌XpmHN11接種至MeHsfB3a沉默植株（pCsCMV-MeHsfB3a）和負對照植株（pCsCMV-A-）新葉葉片。在接種 3 d時，MeHsfB3a沉默植株和負對照植株葉片均出現水漬狀病斑，但是MeHsfB3a沉默植株的病斑擴散面積較大。接種6 d時，MeHsfB3a沉默植株的病斑進一步擴大，而負對照植株病斑緩慢擴大（圖6A）。

為了使病斑面積具體量化，采用ImageJ軟件計算接種病原菌3 d和6 d后的病斑面積，并制作柱狀圖進行顯著性分析。在接種3 d時，MeHsfB3a沉默植株的病斑面積是負對照植株的 2.22~2.38倍；在接種6 d時，MeHsfB3a沉默植株的病斑面積是負對照植株的1.86~2.28倍（圖6B）。此結果表明，沉默了MeHsfB3a基因后，木薯對XpmHN11病原菌的敏感性增加。

圖6 XpmHN11侵染后不同時間點植株的抗性分析Fig.6 Phenotypes ofXpmHN11 infected leaves at different time points

3 討論

植物 Hsfs不僅通過特異地結合熱激蛋白（heat shock protein, Hsp）基因啟動子上的熱擊響應元件（heat shock element, HSE），調控Hsp基因的表達，增強植物的耐熱性，還可以調控許多抗逆基因的表達，提高植物抵御生物及非生物脅迫的能力[16]。Hsfs由多個基因家族編碼，其蛋白質結構高度保守，根據不同的保守結構域可分為HsfA、HsfB、HsfC三類[17]。HsfA亞家族在熱、干旱、鹽和氧化損傷反應中的功能已經有很多研究報道，然而對HsfB、HsfC家族的了解還較少。最近的研究表明，HsfB和HsfC家族在植物對生物和非生物脅迫的反應中也具有重要的作用。過量表達OsHsfB2b的轉基因粳稻脯氨酸含量下降，導電率上升，植株抗旱性下降[18]。5℃低溫處理水稻，水稻 HsfA族和 C族成員表達量上調，B族成員表達量下降[19]。低溫條件下甘藍BraHsfC039的表達量上升，小麥過量表達TaHsfC3后，在低溫處理時可承受更長時間[20]。

本研究通過RT-PCR從感病品種‘SC8’基因組中擴增獲得 HsfB家族基因：MeHsfB3a，該基因全長為729 bp，編碼289個氨基酸，含有2個外顯子和 1個內含子。亞細胞定位分析發現，MeHsfB3a預測定位于細胞核，符合轉錄因子的定位特征。通常HsfB族編碼的蛋白缺少轉錄激活結構域，可能對靶基因的轉錄起抑制作用。擬南芥AtHsfB1和 AtHsfB2b定位于細胞核直接抑制AtHsfA2、AtHsfA7a、AtHsfB1和AtHsfB2b的表達[21]。Hsfs在植物的不同器官中表達模式具有差異，如玉米ZmHsf06在根中表達量較高[22]，而ZmHsf12在新葉中表達量高[23]。表達分析顯示MeHsfB3a在成熟中表達量最高，在其他器官中的表達量較低。有研究發現木薯MCOL1522品種在細菌性枯萎病菌株XamORST4侵染時MeHsfB3a基因表達量上調[24]。因此，推測MeHsfB3a可能在木薯抵御細菌性枯萎病過程中發揮作用，但該研究并未克隆MeHsfB3a基因序列并驗證該基因的功能。本研究將在海南分離得到的菌株XpmHN11接種于‘SC8’木薯葉片發現MeHsfB3a的表達被病原菌侵染激活，最高達到 60倍，表明該基因參與‘SC8’木薯對細菌性枯萎病病原菌的響應過程。前人的研究發現，木薯的其他Hsf家族基因成員也同樣受細菌性枯萎病病原菌侵染的誘導。MeHsf3在Xpm病原菌侵染木薯SC124葉片6 h后，轉錄水平上調了8倍[15]。

病毒誘導的基因沉默技術（VIGS）是一種方便有效的反向遺傳學技術，可以通過構建重組病毒載體來沉默植物體內的目的基因。目前已經開發了多種植物病毒載體，可以對植物各個組織的基因進行沉默[25]。其中由煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）介導的VIGS體系對宿主影響較小，因此應用最為廣泛。WEI等[14]在 2017年利用 TRV介導的沉默體系對木薯MeHsf20和MeWRKY79進行了沉默，結果發現沉默了MeWRKY79和MeHsf20的植株中褪黑素合成相關基因MeASMT2的轉錄下調，導致褪黑素減少，植株抗病性降低。LI等[26]在2017年同樣以TRV介導的沉默體系誘導沉默木薯 bZIP轉錄因子中的MebZIP3和MebZIP5，沉默效率分別達到了50%和 40%，接種木薯細菌性枯萎病病原菌后，沉默植株表現出疾病敏感表型、防御相關基因轉錄水平降低、胼胝質沉積減少，說明了MebZIP3和MebZIP5正調控木薯細菌性枯萎病。最近TUO等[27]成功利用木薯普通花葉病毒（CsCMV）開發了適用于木薯的新型VIGS系統pCsCMV-NC。本研究利用pCsCMV-NC介導的VIGS技術沉默木薯MeHsfB3a基因，實時熒光定量結果顯示實驗組MeHsfB3a基因表達量均降低了68.26%~82.44%，這說明MeHsfB3a基因已經受到了顯著沉默。用XpmHN11病原菌接種MeHsfB3a基因沉默木薯植株，發現木薯對細菌性枯萎病的抗病能力顯著降低。基于以上結果，本研究證明了熱擊蛋白轉錄因子基因MeHsfB3a受XpmHN11病原菌誘導表達，參與木薯抗細菌性枯萎病的過程。在未來的研究工作中，本實驗室將利用轉基因技術，過量表達MeHsfB3a進一步驗證該基因的抗病功能，并解析 MeHsfB3a轉錄因子調控的下游抗病通路。