云南八倍體割手密84-268血緣F2群體表型多樣性分析

俞華先，安汝東，董立華，桃聯安，劉家勇，田春艷，經艷芬，郎榮斌，邊 芯，周清明，孫有芳，張 鈺

云南省農業科學院甘蔗研究所瑞麗育種站，云南瑞麗 678600

割手密（Saccharum spontaneumL.）即甘蔗細莖野生種，又名甜根子草、小巴茅，是禾本科（Gramineae）蜀黍族（Andropogoneae）甘蔗屬（Saccharum）及其近緣屬植物中一個最有研究價值和育種價值的野生種[1]?，F代甘蔗品種幾乎都含有割手密的血緣，其血緣占現代甘蔗品種血緣的 10%~20%[2-3]。割手密在甘蔗屬的野生種中分布最廣，基因型變異較豐富，具有抗逆性強、適應性廣、強宿根性、較高糖分等特性，最早被用于高貴化育種，是拓寬甘蔗遺傳基礎最有利用價值的野生種質資源[4]。中國既是割手密的原產地之一，也是割手密重要的多樣性分布中心之一[5]。我國割手密主要分布在北緯 18°15′~33°20′、東經97°~122°，海拔 1~2460 m[6]，據陳輝等[7]和范源紅等[8]的研究結果，云南省可能是割手密資源的重要起源中心。割手密是染色體數極其復雜的多倍體植物，染色體數（2n）介于40~128之間，染色體以 8為基數，其中 2n=64、80、96、112和128等 5種染色體類型最多[9]。蔡青等[10]以國家甘蔗種質資源圃保育的247份割手密開展染色體類型研究，結果發現整倍體割手密主要有5種，依次是八倍體（2n=64）、九倍體（2n=72）、十倍體（2n=80）、十二倍體（2n=96）、十三倍體（2n=104），其中材料數以2n=80（十倍體）最多，其次為2n=64（八倍體）。陳如凱[11]研究認為與“甘蔗屬復合體”的野生種相比，割手密與甘蔗栽培原種或品種雜交，染色體的親和力和重組率高，后代具有較好的抗逆性、適應性、分蘗力、長勢等特性。

回顧世界各個國家的甘蔗育種史，可發現整倍體割手密對世界甘蔗產業的發展起著重要作用，如利用十四倍體的爪哇割手密（2n=112）、八倍體的印度割手密（2n=64）所育成的POJ2878、Co281、Co290和Co213等重要親本，極大程度地改良了甘蔗品種的產量、糖分及抗性[12-13]。20世紀中期，中國海南甘蔗育種場基于崖城割手密（2n=64，八倍體）創制了一系列崖城親本，并基于這些親本選育出 32個品種，大大推動了中國甘蔗產業的快速發展[14]。鑒于整倍體割手密資源對于甘蔗品種改良的重要性，前人對中國保育的整倍體割手密資源開展了大量研究。劉新龍等[9]2012年對171份中國十倍體割手密資源表型性狀的表型相關性及遺傳多樣性進行評價，研究結果為十倍體割手密資源的利用提供了重要的參考依據；李旭娟等[15]2014年對中國保育的50份十倍體割手密抗逆功能標記的遺傳多樣性進行研究，結果發現十倍體割手密在抗旱功能標記方面表現出更為豐富的遺傳變異；劉新龍等[16]2014年對國家甘蔗種質資源圃保育的 30份云南八倍體割手密資源進行產量和品質性狀相關性和聚類分析，研究結果表明云南八倍體割手密資源產量性狀的遺傳變異較品質性狀豐富；李旭娟等[17]2015年對國家甘蔗種質資源圃保育的 30份云南八倍體割手密資源的抗逆功能標記遺傳多樣性進行了探討，研究發現八倍體割手密中還有很多抗逆血緣未滲透到現代甘蔗品種中；劉新龍等[5]2017年對62份不同倍性的割手密的遺傳多樣性及抗病分蘗基因多態性展開研究，結果發現八倍體和十倍體割手密在形態、品質性狀和基因組水平上擁有更為豐富的遺傳變異，并且具有較大的潛力可挖掘；近年來，云南省農業科學院甘蔗研究所利用內陸型的云南蠻耗割手密（2n=80），創制了一系列云瑞親本[18-19]。另外我國的甘蔗種質資源圃也保育了大量的整倍型割手密，由于對它們所具備的優異特性、遺傳背景和評價利用研究較少，致使其優異的性狀或優異基因開發利用率不高。八倍體割手密是我國倍數較低的整倍體割手密，其雜交一、二代（F1、F2）的創新種質，是甘蔗有性雜交育種中云南八倍體割手密優良基因世代升級的遺傳載體，亦是云南八倍體割手密在利用過程中克服細莖、低糖和早花等不利野生性狀，保留其廣適應性、強宿根性和抗逆性的重要途徑，對其F2創新種質開展表型性狀的多樣性研究是甘蔗優良品種選育的基礎。云南省農業科學院甘蔗研究所瑞麗甘蔗育種站（國家內陸甘蔗雜交育種站）課題組一直致力于利用云南割手密創新種質、培育創新親本、改良甘蔗品種抗逆性的研究[20-27]，在2018/2019雜交季節創制了云南八倍體割手密84-268的F2群體材料，目前針對該群體資源的遺傳多樣性的評價研究還是空白，極大限制了該類資源在甘蔗品種改良中的利用，鑒于此，本研究針對該群體的100份種質材料的倍性性狀進行評價、鑒定、篩選和分類，為下一步對該群體的創新利用及優異基因挖掘提供重要指導。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為云瑞新創制優良親本云瑞06-1598（白樓蔗×51NG90）與云南八倍體割手密血緣F1優良種質云瑞14-258（云瑞09-163×云南84-268）雜交所創制的云南割手密F2群體材料，共計208個雜交單株，通過SSR標記鑒定真假雜種和剔除病死單株，最終獲得1個包含100個雜交后代材料的云南八倍體割手密F2群體，由于該新群體組合號為 226號，對其重新編號為云割F218-226-1至云割F218-226-100。

1.2 試驗設計

試驗布置在東經 97°51′44″、北緯 24°1′33″，海拔778.6 m的云南省農業科學院甘蔗研究所瑞麗育種站內，該試驗地光溫資源豐富，年均溫20℃，年降雨量1394 mm，屬于南亞熱帶季風性濕潤蔗區。試驗地前作為甘蔗，土壤為沙壤土，肥力均勻。于2018年3月上旬完成試驗材料實生苗播種，4月中旬假植，5月下旬完成大田定植。試驗采用隨機區組設計，設3個重復。小區面積7.2 m2，小區行長6 m，行距1.2 m，田間管理與大田生產一致。

1.3 測定項目與方法

分別于2018年11月中旬和2019年11月下旬，大田收集每行成活叢數、莖徑、有效莖數（大于1 m的蔗莖）、錘度、株高和莖徑等農藝性狀的新植和宿根數據，其中株高、莖徑和錘度每叢隨機選取3株進行調查，選用2018、2019年1月中旬的新植、宿根錘度，參照經艷芬等[28]的方法利用以下公式計算單莖重、單產和11月理論糖產量，參試農藝性狀的指標取新植、宿根平均值。

單莖重（kg）=（株高-50）×莖徑2×0.785/1000

單產（t/hm2）=莖徑2×（株高-50）×0.785×叢有效莖數×10-6

糖產量（t/hm2）=單產×11月份理論蔗糖分/100

式中，株高、莖徑單位為cm，叢有效莖數為每公頃有效莖數（條/hm2），理論蔗糖分單位為%。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2019軟件整理各農藝性狀指標的原始數據，采用 SPSS22軟件計算各農藝性狀的平均值、標準差、變異系數并制作頻數分布圖，利用DPS 13.5數據處理系統進行逐步回歸分析、主成分分析和判別分析，利用 RStudio的軟件包進行相關分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 7個主要農藝性狀的種質頻數分布

云南八倍體割手密84-268血緣F2創新種質材料主要農藝性狀的頻數分布見圖1~圖4。從圖1~圖4可知，該群體的7個主要農藝性狀頻數分布呈現較好的正態分布。不同性狀的頻數分布峰值與Y軸的距離有差異，數據分布范圍較廣，表明這100份云南八倍體割手密84-268血緣F2創新種質材料確實存在廣泛的遺傳多樣性。

圖1 株高和莖徑頻率分布直方圖Fig.1 Histogram of frequency distribution of plant height and stalk diameter

圖4 糖產量頻率分布直方圖Fig.4 Histogram of frequency distribution of sugar yield

圖2 錘度和單莖重頻率分布直方圖Fig.2 Histogram of frequency distribution of brix and single stalk weight

圖3 有效莖數和蔗莖產量頻率分布直方圖Fig.3 Histogram of frequency distribution of effective stem number and cane yield

2.2 主要農藝性狀的遺傳多樣性分析

由表1可見，云南八倍體割手密84-268血緣F2創新種質材料7個農藝性狀間的變異系數分布幅度比較大，范圍為9.91%~50.76%，其中變異系數最大的是糖產量達到 50.76%，變幅為 2.94~32.45 t/hm2，其次是蔗莖產量的變異系數最大，達到50.03%，變幅為19.08~181.98 t/hm2，由此說明，這 100份云南八倍體割手密 84-268血緣 F2創新種質材料的糖產量和蔗莖產量遺傳變異最為豐富。因此，在云南割手密創新種質材料的選擇利用上要重點考慮糖分和產量；有效莖數、單莖重、莖徑、株高和錘度的變異系數依次為37.25%、32.13%、13.75%、10.75%和9.91%，其變幅依次為 27 274.09~272 740.91條/hm2、0.21~1.09 kg、1.29~2.43 cm、134~255 cm和12.60~20.80%。孫銘等[29]研究認為變異系數大于 10%表示樣本間差異較大，本研究中7個主要農藝性狀的變異系數除錘度的變異系數為 9.91%外，其余性狀變異系數均大于10%，說明該群體材料性狀分離明顯、變異豐富，存在可利用的特異性種質材料。

表1 云南八倍體割手密84-268血緣F2群體的農藝性狀表現Tab.1 Performance of agronomic traits of Saccharum spontaneum L.F2 population in Yunnan

2.3 7個農藝性狀的相關性分析

由圖5的相關性分析可見，株高、莖徑與單莖重呈極顯著正相關，蔗莖產量、蔗糖產量與株高、莖徑、單莖重和有效莖數呈極顯著正相關，蔗莖產量與錘度呈負相關，蔗莖產量與糖產量呈極顯著正相關。由此可知，各農藝性狀指標之間存在顯著相關性，7項指標間是相互影響、相互制約的，若直接利用這些指標進行群體創新材料的評價會產生信息重疊，為了科學客觀地利用云南八倍體割手密 84-268血緣 F2群體創新材料農藝性狀指標，有必要對其降維處理。

圖5 群體參試材料農藝性狀的相關性分析Fig.5 Correlation analysis of agronomic traits in the tested materials

2.4 蔗莖產量和糖產量的逐步回歸分析

分別以蔗莖產量（y1）和糖產量（y2）為因變量，以株高（x1）、莖徑（x2）、錘度（x3）、單莖重（x4）、有效莖數（x5）為自變量進行多元逐步線性回歸分析，分別得到回歸方程：

y1=-278.4781+0.4721x1+132.7984x2-98.0620x4+0.0005x5

y2=-52.6577+0.0692x1+19.3600x2+0.6289x3-11.6935x4+0.0001x5

方程的決定系數依次分別為R1=0.9282和R2=0.9160。從回歸方程可以看出，蔗莖產量主要由株高、莖徑、單莖重和有效莖數4個因素決定，糖產量有株高、莖徑、錘度、單莖重和有效莖數5個因素決定。

2.5 主成分分析

對該群體的7個主要農藝性狀進行主成分分析（表2），根據主成分分析的原理，結合特征值≥1的原則或主成分累積方差貢獻率應≥85%的標準[30-31]，取前3個特征值作為100份云南八倍體割手密 84-268血緣 F2群體材料的主成分。從表2可以看出，選取的前3個主成分的累計貢獻率為86.985%，特征向量總和為6.089，概括了該群體的絕大部分信息。主成分 1的特征值為3.333，貢獻率為47.615%，此主成分特征向量中，糖產量和蔗莖產量的特征向量最大依次分別為0.519和 0.511，其次是單莖重（0.410）和莖徑（0.368），因此把主成分 1稱為糖分產量因子。主成分2的特征值為1.718，貢獻率為24.545%，此主成分特征向量中，有效莖數向量值最大為0.587，其次是糖產量和錘度分別為 0.244和0.232，因此把主成分2稱為莖數因子。主成分3的特征值為1.038，貢獻率為14.824%，此主成分特征向量中，錘度的向量值最大為0.831，其次是株高（0.476）和單莖重（0.096），因此把主成分3稱為錘度株型因子。參照陸鑫等[32]、田江等[33]和俞華先等[34]的方法計算主成分得分系數矩陣（表3）。根據主成分計算公式，得到3個主成分與7項農藝性狀的線性方程組合：

表2 群體參試材料的特征值、貢獻率和累積貢獻率Tab.2 Eigenvalues, contribution rates and cumulative contribution rates of the tested materials

表3 主成分及其得分系數矩陣Tab.3 Matrix of principal components and their scoring coefficients

W1=0.077X1+0.111X2+0.000X3+0.123X4+0.094X5+0.156X6+0.153X7

W2=-0.053X1-0.293X2+0.315X3-0.287X4+0.342X5+0.113X6+0.142X7

W3=0.458X1-0.081X2+0.801X3+0.092X4-0.199X5-0.146X6+0.024X7

式中，W表示主成分得分，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7分別表示經標準化處理后的株高、莖徑、有效莖數、單莖重、錘度、蔗莖產量、糖產量數值。將7個農藝性狀數值代入以上公式即可得到主成分得分（表4）。

參照張軍科等[35]的方法，利用數學模型：S=b1y1+b2y2+…+bnyn（S表示綜合得分值；bn為第n個主成分對應的方差貢獻率；yn為第n個主成分的得分），求 100份創新材料農藝性狀綜合得分，并把農藝性狀綜合得分值依次降序排列（表4），由表4可知，100份云南八倍體割手密84-268血緣F2群體材料7個農藝性狀綜合評價得分依次為：云割 F218-226-7＞云割 F218-226-14＞云割F218-226-89＞ 云 割 F218-226-48＞......＞ 云 割F218-226-58。

表4 主成分得分及其綜合得分Tab.4 Scores of principal components and their comprehensive scores

續表4 主成分得分及其綜合得分Tab.4 Scores of principal components and their comprehensive scores (continued)

續表4 主成分得分及其綜合得分Tab.4 Scores of principal components and their comprehensive scores (continued)

2.6 聚類分析

根據主成分的分析結果，利用R語言軟件，對100份云南八倍體割手密84-268血緣F2群體材料7個農藝性狀的綜合評價得分值進行標準化轉換，以歐氏距離、可變類平均法對種質進行系統聚類分析。由圖6和表5可知，在歐氏距離6.00處，可將100份種質資源分為3個大類群，第Ⅰ類包括云割F218-226-7、云割F218-226-14、云割F218-226-4和云割F218-226-17等33份創新材料，占總材料的33.00%，該類材料植株高大、中莖，平均錘度最高，有效莖數最多，蔗莖產量和糖產量最高，可以考慮重點加強利用；第Ⅱ類包括云割 F218-226-76、云割 F218-226-47、云割F218-226-80、云割F218-226-75和云割F218-226-63等29份材料，占總材料的29.00%，7個農藝性狀變異系數均大于 8.10%，該類材料中大莖、蔗莖產量和糖產量的變異系數最大，田間表現為高產高糖，要選擇性利用。第Ⅲ類包括云割F218-226-33、云割 F218-226-25、和云割F218-226-24等38份材料，占總材料的38.00%，其變異系數錘度為10.34%，其余性狀的變異系數均大于11.00%，其余農藝性狀的變異系數變幅在11.24~35.67%，這些材料表現為植株高大、中莖，蔗莖產量和糖分不很理想，可以考慮選擇性利用或者淘汰。

表5 3個聚類群及其性狀特征Tab.5 Three Cluster groups and their characteristics

圖6 基于7個農藝性狀綜合評價得分值的聚類圖Fig.6 Dendrogram of Cluster diagram based on the score values of the comprehensive evaluation of 7 agronomic traits

為了判斷聚類結果是否可靠，采用多類逐步判別法對其進行判別（表6）。結果表明，第Ⅰ類群判對概率為 78.79%，第Ⅱ類群判對概率為89.66%，第Ⅲ類判對概率為97.37%，根據判別分析原理可知，判別概率越高，證明種質被正確分類的機率越大。從表6可以看出，每個種質被正確分類的概率較高，平均判對概率為88.61%。

表6 判別分析矩陣Tab.6 Lists of discriminant analysis matrices

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的重要內容之一,也是生物所攜帶遺傳信息的總和，研究生物遺傳多樣性具有重要的理論和實際意義[36]。盡管現代分子生物學手段為種質資源的研究提供了穩定有效的方法，但對于表型性狀的調查和分析仍不可缺少，尤其對于云南野生割手密的鑒定和創新利用，表型農藝性狀的評價尤為重要。割手密倍性遺傳多樣性的分析是割手密種質資源保育和育種方案設計的前提，甘蔗種質資源的遺傳多樣性是其育種工作的基礎[37]，充分挖掘云南八倍體割手密農藝性狀的遺傳變異和遺傳背景，可以為甘蔗育種工作提供理論基礎。遺傳變異系數是種質間遺傳變異性狀差異的一種標志[38]，也是遺傳變異潛力大小的標志，表示群體中直接選擇的范圍。劉建樂等[39]認為變異系數大的性狀，從該群體中選出具有該性狀的優良個體的幾率大，反之則小。本研究發現100份云南八倍體割手密84-268血緣F2群體材料具有豐富的遺傳變異性，7個農藝性狀除錘度的變異系數為9.91外，其余性狀的變異系數均大于10%，其中糖產量的變異系數最大為50.76%，其次是蔗莖產量變異系數為50.03%，錘度的變異系數最小為9.91%。齊永文等[40]對64份廣東割手密資源農藝性狀遺傳多樣性評價中，其株高、莖徑、錘度的變異系數遠遠低于本研究結果，這可能是其實驗材料來源地都是廣東地區，遺傳距離接近所致；張革民等[41-42]在 2006年對94份割手密主要數量性狀的主成分及聚類分析及2007年對 21份廣西高糖割手密無性系遺傳多樣性的表型和PAPD進行的分析中，株高、莖徑、錘度和蔗莖產量等表型性狀的變異系數與本研究結果近似。另外，本研究中單莖重的變異系數為32.13%，與劉新龍等[16]在對 30份云南八倍體割手密的6個產量性狀和3個品質性狀研究中單莖重的變異系數達到60.70%不一致，其原因可能是本研究的試驗材料是同一個無性系，以及不同評價體系所造成。

相關性分析表明，株高、莖徑分別與單莖重、蔗莖產量、蔗糖產量呈極顯著正相關；單莖重與蔗莖產量、蔗糖產量均呈極顯著正相關，蔗莖產量與蔗糖產量呈極顯著正相關；糖分相關性狀如修正錘度與蔗糖分呈極顯著正相關等結論與張革民等[41]、劉新龍等[16]、齊永文等[40]和俞華先等[43]的研究結果基本一致。此外，本研究群體材料是特定的云南八倍體割手密雜交F2群體，在相關性分析中，株高與蔗糖產量呈極顯著正相關，蔗莖產量與蔗糖產量呈極顯著正相關，與趙俊等[44]對113個國外甘蔗種質13個工農藝性狀的相關性相關分析的結論一致；有效莖數與蔗莖產量和糖含量呈極顯著正相關，與陸鑫等[45]、秦昌鮮等[46]的研究結果一致；其中有效莖數與莖徑呈負相關，與生產實踐相吻合。在對100份云南八倍體割手密84-268血緣F2群體材料的7個性狀的回歸分析表明，對高產高糖甘蔗種質的選育中，株高、莖徑、錘度和有效莖數是要重點考察的關鍵性狀，該結論與徐志軍等[47]對209個甘蔗F1群體材料8個性狀的回歸分析和吳建濤等[48]對10個粵糖系列甘蔗產量與產量構成因子多元回歸分析結論一致。

云南八倍體割手密84-268血緣F2群體材料的農藝性狀大多數受微效多基因控制，結合本研究的相關性分析可知，不同農藝性狀間存在不同程度的相關性，即其中某一性狀的改變會導致其他性狀的改變，郭元元等[49]認為在育種中改良重要性狀的同時也會引起次要性狀的改變。趙俊等[44]、秦昌鮮等[46]和俞華先等[50]研究認為甘蔗各農藝性狀指標間存在相互聯系、相互制約關系，各農藝性狀在大田生產中的綜合信息容易出現交叉重疊，若直接用這些性狀進行分析評價，結果會存在較大誤差，為了科學評價參試材料，本研究采用主成分分析法對原始數據進行降維處理。

主成分分析作為一種多元統計分析技術，其各主成分之間就是一個獨立系統，數值直觀、容易分析，且可以簡化資源篩評、價選的程序。朱東旭等[51]、唐啟明等[52]認為，主成分分析法有利于提高育種水平和多目標育種的親本選配效率。本研究將7個性狀簡化為3個主成分即糖分產量因子、莖數因子和株型因子，累積貢獻率為86.985%，說明這3個主成分反映了100份云南八倍體割手密血緣F2的7個農藝性狀的絕大部分信息，與張革民等[42]、秦昌鮮等[46]的研究結果存在差異，可能與甘蔗的血緣基礎和所分析的農藝性狀不同有關。

在主成分分析的基礎上進行聚類分析，可有效剔除一些不重要的重疊信息，減少統計分析的復雜性，使得分析結果更加客觀科學。閆世江等[53]認為聚類分析結果可為育種決策提供有價值的參考依據。本研究基于 100份云南八倍體割手密84-268血緣F2群體材料7個農藝性狀的綜合評價得分值進行系統聚類，將100份材料分成各具特征的三大類群，為了判斷聚類結果是否可靠，采用多類逐步判別法對其進行判別，其平均判對概率為88.61%，較科學客觀地反應出該群體材料基因型分離的差異性與相似性特點，在以后的高產高糖材料育種或研究中，可以利用該系統聚類圖結合育種目標選擇高糖、高產和高抗類型的極端材料，從而提高育種或研究效率。

本研究僅針對 100份云南八倍體割手密84-268血緣F2群體創新種質材料的 7個表型性狀進行了分析評價，畢竟所研究的表型農藝性狀有限且受到環境的影響較大，因此下一步還有待于從分子生物學角度進一步對這些資源進行研究，以期更加客觀地評價云南八倍體割手密種質資源特性，促進割手密優質種質資源的高效創新利用。