食品中克羅諾桿菌分子分型方法研究進展

◎ 周 欽，王宇軒，顧佳豐，余紅民，姜 華，李遠宏

（徐州醫科大學，江蘇 徐州 221004）

克羅諾桿菌（Cronobacterspp.，CR）是一種重要的食源性條件致病菌，可引起嬰幼兒腦膜炎、菌血癥、壞死性結腸炎等疾病，嚴重威脅食品安全和人類健康。現有研究表明，嬰兒配方奶粉是導致CR 感染的重要渠道，但是該菌在谷類、肉類、果蔬類和香辛料等食品中也廣泛存在。CR 包括7 個種和3 個亞種，屬類不同分型的CR 在生存能力、毒力與耐藥性等方面存在較大差異[1]。分子分型技術是一種在食源性疾病暴發和溯源調查中被廣泛應用的技術，通過該技術可以在分子水平快速實現對致病菌的識別和鑒定，解析菌株的遺傳演化規律與分子遺傳特征，為預防和控制CR 引起的感染提供理論依據。基于此，本文對CR的分子分型方法進行簡要綜述。

1 多重PCR 法

多重PCR 法（Multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR）是在同一反應體系下，同時加入兩對或兩對以上引物進行PCR 擴增，通過PCR 擴增獲得大小不等的DNA 片段，可以實現對多種病原菌的同時檢測與分析。CARTER 等[2]基于mPCR 技術建立了一種可同時區分6 種CR 的分子分型方法。該方法基于cgcA基因設計特異性引物進行mPCR 擴增，獲得不同大小的DNA 片段，并通過凝膠電泳將各擴增產物分離，以實現對不同種CR 的鑒別。mPCR 分型是一種較早開發的用于CR 種間區分的分子分型方法，這種技術具有準確度高、操作簡單快捷、費用較低等多種優點。該方法能在種水平實現對CR 的鑒定，但是其分辨率較低，無法在基因水平檢測到不同菌株的變異情況，因此限制了其在診斷、鑒別、溯源和監測等方面的廣泛應用。

2 脈沖場凝膠電泳

脈沖場凝膠電泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是20 世紀80 年代中期發展起來的一種通過電泳分離大分子DNA 的技術，其基本原理是利用稀有位點的限制性內切酶（如XbaI、SpeI）切割細菌基因組DNA，得到的大片段DNA 在脈沖電場作用下進行分離，然后再依據DNA 片段的大小、數量及相對位置關系將不同菌株劃分為不同的基因型。PFGE 是被廣泛認可的用于細菌分子分型的“黃金標準”方法，對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核增生李斯特氏菌、致病性大腸桿菌O157、副溶血弧菌和CR 等食源性致病菌具有很強的鑒定能力。MULLANE 等[3]對30 株CR 分離株進行PFGE 分析，通過XbaI 酶切后，利用隨機引物擴增出3 ～7 條長度為400 ～3 500 bp的DNA 片段，聚類分析后16 株分離株鑒定為丙二酸鹽克羅諾桿菌（C.malonaticus），14 株分離株鑒定為阪崎克羅諾桿菌（C. sakazakii）。LI 等[4]利用PFGE 方法對2008 2018 年溫州市食品和糞便樣本中分離的CR 進行分型，將90 株CR 劃分為75 個克隆群，其中86 株鑒定為C. sakazakii，4 株鑒定為C.malonaticus。PFGE 分型技術具有重復性好、分辨率高以及易于標準化等諸多優點，而且結果穩定可靠，不受表型性狀干擾。但是，該方法也存在一些缺陷，如儀器試劑昂貴、過程煩瑣、耗時長、對操作人員的素質要求高等，從而限制了該技術的推廣普及。

3 隨機多態性擴增DNA

隨機擴增多態性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）分型技術采用隨機引物對基因組DNA 進行PCR 擴增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴增產物，進而分析片段多態性。DRUDY 等[5]分析51 株CR 分離株和6 株CR 標準菌株的RAPD圖譜，發現這些菌株產生了3 ～11 個大小為350 ～2 600 bp 的擴增產物，聚類分析發現大部分菌株被劃至3 個簇群。楊海榮等[6]利用RAPD 技術對38 株CR進行了分子分型分析，利用隨機引物擴增出3 ～7 條長度為400 ～3 500 bp 的DNA 片段，并將這些菌株劃分為8 個基因型，證實了RAPD 技術可用于CR 種間鑒別和分子溯源分析。RAPD 分型方法工作原理簡單、成本低、耗時短、易于操作，且不需要全基因組序列信息來確定特定的靶標，但是不足之處在于可重復性差，技術路線尚未實現標準化，無法區分等位基因，可能會出現假陽性或假陰性結果，因此對實驗結果的解釋具有較大的主觀性。

4 擴增片段長度多態性

擴增片段長度多態性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）是一種用于DNA 多態性的檢測方法，由荷蘭科學家Zabean 和Vos 于1992 年首次提出。該方法首先利用限制性內切酶切割基因組DNA，得到帶有不同酶切末端的限制性酶切片段，然后在酶切片段上加上雙鏈接頭，作為PCR 擴增時引物的結合區，再通過選擇性引物進行PCR 擴增，最后通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增片段的多態性。IVERSEN 等[7]建立了一種可區分CR 的AFLP 方法，采用限制性內切酶EcoR I 和Taq I 對51 株CR 基因組DNA 進行了酶切，然后將酶切后的基因組DNA 與人工接頭在T4 連接酶的作用下連接，以連接了接頭的DNA 為模板進行PCR 擴增，擴增結束后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。AFLP 圖譜分析結果顯示，以相似度70%為基準，51 株CR 菌株被劃分為4 個生物群。另一項研究中，TURCOVSKY 等[8]利用AFLP 技術對98 株CR 進行了分析，以相似度70%為基準，可以將這些菌株劃分為6 個生物群，而以相似度90%為基準，可以將這些菌株劃分為46 個生物群。目前，CR的AFLP 分型技術尚未實現標準化，其具體的操作流程還有待于進一步規范。AFLP 在細菌分子分型中表現出較好的重復性，其分辨能力優于RAPD，但不及PFGE，并且只能檢測到CR 種間基因組差異，對于CR 種內不同亞型的基因組差異則無法完全鑒定。

5 PCR-限制性片段長度多態性

PCR-限制性片段長度多態性（PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP）是一種將PCR技術、RFLP 與凝膠電泳技術聯用的基因多態性分析技術，其原理是先將待測的靶DNA 片段進行PCR 擴增，然后通過限制性內切酶對PCR 產物進行酶切，獲得不同長度的DNA 片段，經瓊脂糖凝膠電泳分析靶DNA 片段的分子量大小而分型。STRYDOM 等[9]基于rpoB基因序列建立了一種可以區分5 種CR 的PCR-RFLP分子分型方法。首先，通過設計特異性引物進行PCR擴增，獲得長度為660 bp 的rpoB基因片段，然后利用限制性內切酶Csp6I 和HinP1I 單獨或聯合消化PCR擴增產物，最后依據瓊脂糖凝膠電泳圖譜的差異將不同種CR 區分開來。VLACH 等[10]建立了一種新的PCR-RFLP 分型方法，該方法使用一對新設計的引物對rpoB基因序列（1 635 bp）進行PCR 擴增，再采用3 種限制性核酸內切酶（Csp6I、HinP1I、MboI）消化，可區分全部7 種CR。PCR-RFLP 分型方法操作簡單、快速、可重復性好、不需要特殊設備，且區分力較高，但其缺點是實驗結果往往因人而異，不便于在各實驗室之間進行比較。

6 多位點序列分型

多位點序列分型（Multiple-Locus Sequence Typing，MLST）是一種基于核酸序列測定的細菌分子分型方法，它通過PCR 擴增多個管家基因（通常為7 個）的內部片段，然后測定這些片段的序列以分析不同菌株的變異程度，從而進行對不同菌株的分型。CR 的MLST 是基于7 個管家基因（atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和pps）序列建立的，為CR 的分子流行病學研究提供了強大的解決方案。LI 等[4]利用MLST 對溫州市食品（n=78）和臨床（n=12）來源的CR 種群結構和耐藥模式進行了分析，結果發現了43 種序列型（Sequence Type，ST） ，其中ST1、ST4、ST8、ST64、ST148 和ST201 最為常見。馬炳存等[11]調查了即食食品中CR 的污染狀況，并采用MLST 對分離得到的10 株CR 進行分子分型分析，結果將這些菌株分為4 個ST 型（ST21、ST73、ST60、ST7）。MLST具有分辨率高、重復性好、可標準化等優勢，其數據結果易于通過網絡實現信息共享，且便于不同實驗室間對比分析，因此廣泛應用于細菌分子分型和分子進化研究領域。

7 全基因組測序分型

全基因組測序（Whole-Genome Sequencing，WGS）分型是通過高通量測序平臺對致病微生物進行全基因組測序后，利用生物信息學方法得到全基因組序列，從基因水平解析不同菌株的分子遺傳特征而進行的分子分型，從而快速準確地解析不同菌株之間的分子進化關系和遺傳特征。PARRA-FLORES等[12]利用高通量測序技術對CR 進行了核心基因組多位點序列分型（Coregenome Multilocus Sequence Typing，cgMLST），將7 株從奶粉中分離出的CR 劃分為2 種ST 型（ST1 和ST83），并基于全基因組序列揭示了分離株的多種抗生素耐藥基因和毒力基因。HOLY 等[13]利用高通量測序技術對從食品和奶粉生產環境中分離的CR 進行了全基因組測序，利用抗生素耐藥數據庫（CARD）、ResFinder 和PlasmidFinder 解析了菌株攜帶的耐藥基因和毒力基因，利用系統進化樹揭示了不同菌株之間的系統發育關系，并基于全基因組信息分析了與環境適應相關的功能基因。相對于其他分子分型技術，WGS 可以更全面、準確地描述不同來源分離株的遺傳特征，為精準解析致病菌的耐藥性、毒力以及致病性提供了幫助，為揭示流行相關菌株的傳染源、傳播途徑和流行規律提供了參考，現已成為分子流行病學研究領域的一個重要的技術手段。

8 結語

CR 是一種新興的食源性條件致病菌，與導致嬰幼兒腦膜炎、菌血癥、壞死性結腸炎等威脅生命的感染有關。分子分型方法對于CR 的流行病學研究有著至關重要的作用，而基于表型差異建立的傳統分型方法如生化分型、血清分型等，已不能滿足當前分子流行病學研究的需要。基于DNA 的分子分型技術，尤其是WGS，由于其具有的準確、快速、高分辨率等特性，必將成為CR 分子流行病學領域中的重要研究工具，在病原菌的快速分型鑒定、分子進化、追蹤污染源等方面發揮重要作用，從而為食品安全提供有力保障。