蓯蓉舒痙顆粒對帕金森病模型大鼠延髓的保護作用

林 瑤，唐嵐芳，李茜羽，黃佩珍，許 茜，王 林，袁明洲，蔡 晶*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學修園臨床醫學院，福建 福州 350122）

帕金森病（Parkinson” s disease，PD）是一種中老年人常見的神經系統退行性疾病，主要臨床表現為運動遲緩、靜止性震顫、肌強直等，典型的病理變化是中腦黑質區致密部多巴胺能神經細胞的大量變性缺失，臨床主要治療方法是左旋多巴替代療法。但已有研究表明，當患者出現典型臨床癥狀時，黑質紋狀體區域的多巴胺能神經細胞已經丟失60%～70%，而左旋多巴替代療法只補充減少的多巴胺，并不能促進神經細胞存活，故只能減輕癥狀，并不能延緩病情的進展，且長期使用左旋多巴會出現多種運動并發癥［1］。因此，如果能在神經細胞變性的早期給予神經保護，則可以盡可能地保護更多神經細胞，減少或者延后左旋多巴的使用，達到較好的成本-效益比。

蓯蓉舒痙顆粒由肉蓯蓉、制黃精、丹參、赤芍、牡丹皮等藥物按比例濃縮制成，是課題組多年臨床經驗方。前期臨床應用發現其對早期PD 患者的運動癥狀有一定改善作用［2］，進一步進行動物實驗發現其君藥肉蓯蓉對PD 模型大鼠行為學及黑質區多巴胺能神經細胞凋亡均有減輕作用［3-4］。由于延髓是PD 發病過程中最早受影響的部位，本實驗擬通過觀察蓯蓉舒痙顆粒對PD 模型大鼠延髓的影響，為PD 的早期神經保護治療提供實驗支持。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級6～7 月齡健康雄性SD 大鼠50 只，體質量（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（浙）2019-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007。飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心，溫度20～22 ℃，相對濕度60%～65%，光照/黑暗周期為12 h，飲水攝食自由。

1.2 實驗藥物 蓯蓉舒痙顆粒由肉蓯蓉6 g，制黃精12 g，丹參15 g，赤芍12 g，牡丹皮10 g 組成，由福建中醫藥大學附屬第三人民醫院提供。取蓯蓉舒痙顆粒5 g 溶于100 mL 煮沸的蒸餾水中，配成濃度為50 mg/mL 的蓯蓉舒痙顆粒藥液，分裝后置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 實驗試劑 美多芭（上海羅氏制藥有限公司，批號：H10930198）；魚藤酮、葵花油（美國Sigma 公司，批號：R8875、S5007）；電鏡固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號：G1102）；酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、α-突觸核蛋白（α-synuclein）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ）、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ 共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α，PGC-1α）、B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）、激活型半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）、β-actin 抗體（美國Abcam 公司，批號：ab51134、ab138501、ab178860、ab145641、ab32124、ab32503、ab2302、ab8226）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液（北京索萊寶科技有限公司，批號：T2190、PC0020、R0010）；TH免疫組化試劑盒（福建邁新技術有限公司，批號：KIT-9720）；ECL 化學發光檢測試劑盒（美國Bio-RAD 公司，批號：1705060）。

1.4 實驗儀器 H-7650 透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；RM2235 石蠟切片機、UC6 超薄切片機、MDL 光學顯微鏡（德國Leica 公司）；ELX800 多功能酶標儀（美國Bio-TEK 公司）；Universal Hood Ⅱ化學發光成像儀、PowerPac Basic 電泳儀、PowerPac Basic轉膜儀（美國Bio-Rad 公司）；Motic Med 6.0 組織細胞圖像分析系統（麥克奧迪實業集團有限公司）。

2 方 法

2.1 模型建立及評價 PD模型制備采用SHERER［5］創立的經典方法：將魚藤酮溶于葵花油乳化液，配置終濃度為1.5 mg/mL 的魚藤酮葵花油乳化液，按1.5 mg/（kg·d）于大鼠頸背部進行皮下注射，連續注射14 d。觀察大鼠的行為學改變，參照VOITENKO［6］的行為學評分標準進行評分，2～8 分者為合格的PD 模型大鼠。

2.2 動物分組及干預 將50 只健康SD 大鼠隨機分為對照組10 只和造模組40 只。造模組大鼠按“2.1”項下的造模方法建立PD 模型，對照組大鼠于頸背部皮下注射等體積葵花油。造模結束后，行為學評分1 分有3 只，10 分有7 只，予剔除，最終造模成功的大鼠共30 只。將造模成功的30 只大鼠再次隨機分為模型組、蓯蓉舒痙組、美多芭組，每組各10 只。蓯蓉舒痙組按50 mg/（kg·d）予蓯蓉舒痙藥液灌胃，美多芭組按5 mg/（kg·d）予美多芭混懸液灌胃，對照組和模型組予等量生理鹽水灌胃，每日灌胃1 次，連續灌胃14 d。

2.3 標本采集 灌胃14 d 后各組大鼠以20%烏拉坦按5 mL/kg 腹腔注射麻醉后取材。各組取3 只大鼠心臟灌流后分離中腦黑質與延髓，4%多聚甲醛固定過夜，作石蠟包埋切片，用于免疫組化及TUNEL觀察。各組另取3 只大鼠冰上迅速剝離延髓，用于超微結構觀察。各組剩余4 只大鼠，待其完全麻醉后迅速斷頭取腦，冰盤上分離延髓，用預冷的0.9%氯化鈉反復沖洗，除去組織中血液，濾紙吸干，置于-80 ℃冰箱保存，用于蛋白含量檢測。

2.4 觀察指標

2.4.1 行為學檢測 觀察各組大鼠每天進食、飲水、活動、精神情況，并做好記錄。分別于造模后和干預第7、14 天在同一時間點對各組大鼠進行網格實驗和斜板實驗。① 網格實驗：將大鼠以倒立姿勢置于一個與地面垂直的金屬網格（長80 cm、寬50 cm、格間距1 cm）中央，待其四肢抓牢網格后，開始記錄大鼠從靜止狀態到任意一肢開始活動所需的時間，即為移動潛伏期。每只大鼠重復測3 次，每次間隔5 min。② 斜板實驗：依次將各組大鼠置于覆蓋了2 mm 厚橡膠墊的平板中央，注意不讓大鼠前后肢抓住木板邊緣，初始平板與地面夾角為25°，當大鼠在該角度的平板上停留時間≥5 s，斜板向上增加 5°；當大鼠在斜板上的靜止時間＜5 s 時，記錄該傾斜角度。每只大鼠重復測3 次，每次間隔5 min。

2.4.2 免疫組化檢測TH 陽性細胞數 按照試劑盒說明書對上述中腦黑質石蠟切片進行免疫組化染色，200 倍顯微鏡下觀察，以棕黃色或淡黃色顆粒染色為陽性表達。每張切片隨機選取5 個視野，應用麥克奧迪組織細胞圖像系統分析圖片，計算TH陽性反應細胞數。

2.4.3 TUNEL 檢測大鼠延髓細胞凋亡率 按試劑盒說明書將各組大鼠延髓石蠟切片進行TUNEL 染色，200 倍顯微鏡下觀察大鼠延髓區細胞凋亡情況，TUNEL 陽性細胞核即凋亡細胞核在鏡下呈現棕色，正常細胞核為藍色。每張切片隨機選取5 個視野統計TUNEL 陽性細胞及細胞總數。

細胞凋亡率＝TUNEL 陽性細胞/細胞總數×100%

2.4.4 透射電子顯微鏡觀察大鼠延髓線粒體超微結構 將修整過的蠟塊置于3%戊二醛固定液中，乙醇梯度脫水，環氧樹脂包埋，制作超薄切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察延髓線粒體超微結構并攝片。

2.4.5 Western blot法檢測大鼠黑質區及延髓相關蛋白表達 取相應腦組織50 mg，BCA 法測定蛋白濃度。經過蛋白變性、SDS-PAGE電泳、濕轉轉膜后，5%脫脂牛奶封閉1 h。加一抗α-synuclein（1∶1 000）、PPARγ（1∶1 000）、PGC-1α（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000），4 ℃搖床過夜。TBST 洗滌，加入二抗稀釋液（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST 洗滌，ECL 顯影并成像，Image Lab 4.0 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin 條帶灰度值的比值做為目的蛋白相對表達量。

2.5 統計學方法 采用SPSS 24.0 軟件進行統計學處理。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法或Games-Howell 法，檢驗水準α＝0.05。

3 結 果

3.1 4 組大鼠行為學實驗結果比較 與對照組比較，模型組大鼠造模后和干預7、14 d 后移動潛伏期明顯縮短，斜板傾斜角度明顯減小（P＜0.05）；與模型組比較，蓯蓉舒痙組和美多芭組大鼠干預7、14 d后移動潛伏期明顯延長，斜板傾斜角度明顯增大（P＜0.05）。見表1、表2。

表1 4 組大鼠網格實驗移動潛伏期比較（±s） s

表1 4 組大鼠網格實驗移動潛伏期比較（±s） s

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別對 照 組模 型 組蓯蓉舒痙組美多芭組造模后2.93±0.21 1.55±0.131）1.60±0.10 1.58±0.13干預7 d 2.93±0.21 1.55±0.121）2.03±0.152）2.17±0.152）干預14 d 3.03±0.21 1.53±0.131）2.60±0.202）2.67±0.232）

表2 4 組大鼠斜板實驗傾斜角度比較（±s） °

表2 4 組大鼠斜板實驗傾斜角度比較（±s） °

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別對 照 組模 型 組蓯蓉舒痙組美多芭組造模后60.00±4.88 44.77±4.451）43.00±3.80 44.40±3.14干預7 d 59.43±6.78 42.47±3.201）50.43±4.072）50.33±3.232）干預14 d 60.10±5.90 42.10±3.151）55.40±4.412）56.60±3.912）

3.2 4 組大鼠中腦TH 陽性細胞數比較 與對照組比較，模型組大鼠黑質區TH 陽性細胞數明顯降低；經蓯蓉舒痙顆粒與美多芭干預后，黑質區TH陽性細胞數較模型組明顯增多（P＜0.05）。見圖1、圖2。

3.3 4 組大鼠延髓神經細胞凋亡情況比較 模型組大鼠延髓神經細胞TUNEL 陽性細胞數較對照組明顯增加（P＜0.05）；經蓯蓉舒痙顆粒及美多芭干預后，TUNEL 陽性細胞數明顯減少（P＜0.05）。見圖3、圖4。

3.4 4 組大鼠線粒體超微結構比較 模型組大鼠延髓線粒體腫脹，雙層膜結構不清，嵴排列紊亂，部分發生斷裂和空泡化；蓯蓉舒痙組和美多芭組大鼠延髓大部分線粒體形態基本正常，腫脹少見，雙層膜結構清晰，嵴排列相對整齊。見圖5。

圖1 4 組大鼠中腦黑質區TH 免疫組化圖（×200）

圖2 4 組大鼠中腦黑質區TH 陽性細胞數比較

圖3 4 組大鼠延髓細胞凋亡率比較

圖4 4 組大鼠延髓神經細胞TUNEL 染色圖（×200）

圖5 4 組大鼠延髓神經細胞線粒體透射電鏡圖（×50 000）

3.5 4 組大鼠中腦黑質區和延髓相關蛋白表達比較 與對照組比較，模型組大鼠中腦黑質區α-synuclein 和延髓cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達明顯提高（P＜0.05），延髓Bcl-2、PPARγ 和PGC-1α 蛋白明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，蓯蓉舒痙組和美多芭組組大鼠中腦黑質區α-synuclein 和延髓cleaved caspase-3、Bax蛋白表達明顯降低（P＜0.05），延髓Bcl-2、PPARγ 和PGC-1α 蛋白明顯提高（P＜0.05）。見圖6～8。

圖6 4 組大鼠中腦黑質區α-synuclein 蛋白表達比較

圖7 4 組大鼠延髓Bcl-2、cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達比較

圖8 4 組大鼠延髓PPARγ、PGC-1α 蛋白表達比較

4 討 論

中醫學將PD 歸入“顫證”范疇，認為其病位雖然在腦，但實則肝腎虧虛，氣血不足，筋脈失養，痰瘀內生，阻滯腦絡，發為顫振［7］。蓯蓉舒痙顆粒中肉蓯蓉為君藥，補益肝腎、填精益髓；制黃精為臣藥，健脾益氣、滋養腎陰；丹參、赤芍、牡丹皮為佐藥，祛瘀生新、清熱涼血、舒痙止痛。諸藥配伍，充實腦髓，濡潤筋脈。課題組前期研究也證實蓯蓉舒痙顆粒能減輕帕金森患者的癥狀，提高帕金森綜合評分量表評分［2］。

BRAAK 等［8］通過尸檢發現，PD 最早累及的部位是延髓，之后依次進展至橋腦、中腦，最后累及間腦和皮層。當患者出現典型臨床癥狀時，延髓、中腦黑質等部位均已受累，且多巴胺神經細胞丟失超過60%。本實驗應用網格實驗評估各組大鼠肌肉僵直狀態，移動潛伏期越短說明肌肉越僵直；應用斜板實驗評估大鼠的運動協調能力，斜板傾斜角度越大表示運動協調能力越強。TH 陽性神經細胞數可反映腦內存活的多巴胺能神經元的數量，而αsynuclein 的過度堆積是PD 的重要病理特征，二者均為PD 動物模型造模是否成功的重要標志。本實驗結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠移動潛伏期縮短，斜板傾斜角度減小，黑質區TH 陽性細胞數減少，α-synuclein 蛋白表達提高，提示造模成功；與模型組比較，蓯蓉舒痙組大鼠移動潛伏期延長，斜板傾斜角度增加，黑質區TH 陽性細胞數增加，αsynuclein 蛋白表達降低，且與陽性對照的美多芭組比較差異無統計學意義，提示蓯蓉舒痙顆粒能改善PD 模型大鼠肌肉僵直狀態和運動協調能力，保護神經細胞，對PD 模型大鼠具有治療作用。

線粒體功能障礙是PD 多巴胺能神經細胞凋亡的核心機制，PPARγ 及其輔助激活因子PGC-1α 是重要的細胞分化轉錄因子，主要表達于高能量需求且富含線粒體的組織中，如腦、脂肪組織、心臟、肝臟等，廣泛參與線粒體生物合成及能量代謝［9］。PGC-1α作為PPARγ 的輔助激活因子，與PPARγ 相結合，能調節腦組織線粒體基因表達，促進線粒體氧化磷酸化，維持線粒體形態，從而正性調節線粒體功能與代謝［10］。本實驗發現，蓯蓉舒痙干預后，線粒體腫脹、嵴排列紊亂、斷裂等現象較模型組有所緩解，PPARγ、PGC-1α 的蛋白表達量有明顯增加，延髓神經細胞凋亡率明顯下降，提示蓯蓉舒痙顆粒可能通過提高延髓PPARγ、PGC-1α 表達來保護線粒體結構，從而保護神經細胞。

中醫學講求“辨證論治”和“整體觀念”，具有毒副作用相對較小的優勢，中西醫結合治療PD，可以減少或者延后西藥的使用。本實驗采用經典的魚藤酮PD 模型，主要病理損傷在黑質紋狀體，實驗中發現其延髓神經細胞也會出現一定損傷，蓯蓉舒痙顆粒可通過提高延髓PPARγ、PGC-1α 表達來保護線粒體結構，為蓯蓉舒痙顆粒應用于早期PD 的治療提供了理論基礎與依據。