右美托咪定對腦出血患者神經細胞保護及氧化應激反應的影響

趙世軍 李銀宏 劉磊 霍保善

(1青海大學附屬醫院麻醉科，青海 西寧 810001；2佛山市第二人民醫院重癥醫學科)

腦出血是神經外科的常見病，急性期進行血腫清除術有重要意義，但是血腫清除后可繼發再灌注的損傷，同時由于殘留血腫對細胞的毒性作用及機體強烈的應激性因素均可以引起繼發性神經細胞損傷〔1〕。右美托咪定(DEX)是近年應用于臨床的新型高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，具有鎮靜、鎮痛及抗交感等作用〔2〕。近年發現右美托咪定在麻醉誘導期應用，對術中血流動力學平衡有一定的調控作用，對術后神經系統的功能恢復有一定價值〔3〕。基于此本研究應用前瞻性研究，構建神經細胞的損傷模型，同時收集腦出血手術患者，應用右美托咪定進行干預，觀察其對神經細胞保護因子及氧化應激指標的影響，探討其意義。

1 材料與方法

1.1細胞培養 人神經母細胞瘤細胞系(SH-SY5Y)購自中國科學院細胞庫。培養方法：置于37℃、95%濃度的O2、5%濃度的CO2培養箱中孵育，應用的培養液為含90%的DMEM、10%的胎牛血清及100 U/ml的青霉素和100 mg/ml鏈霉素，細胞均呈貼壁生長狀態。實驗前接種，密度為5 000個/cm2。建立對照組(C組)、實驗組(FeCl2組)和右美托咪定組(FeCl2+DEX組)。參照預實驗及相關文獻選擇100 μmol/L的FeCl2的濃度構建損傷的細胞模型〔1〕。DEX選擇20 μmol/L最理想的濃度。

1.2臨床資料及麻醉方法 選擇2018年5月至2019年6月確診為腦出血并行手術治療的76例患者，按入院順序進行編號，隨機分為觀察組和對照組各38例。納入標準：①腦出血急性期行全麻下血腫清除術；②美國麻醉醫師協會(ASA)≤Ⅳ級，Glasgow評分≥5分。排除標準：①伴有其他器官嚴重內科疾病者；②有精神疾病史；③合并蛛網膜下腔出血者。剔除標準：①術中出血量超過1 500 ml；②術后出血行二次手術者。患者或家屬均簽署知情同意書，研究經醫院倫理委員會批準。

麻醉方法：患者入室后行氣管插管，觀察生命體征平穩后，觀察組應用0.5 μg/(kg·h)持續輸注DEX至術畢，對照組輸注等量生理鹽水。面罩預充氧3 min后，丙泊酚TCI初始靶濃度3 μg/ml，待效應室濃度平衡。靜脈注射苯磺酸順式阿曲庫銨，靶控輸注瑞芬太尼后，經口插入氣管導管，調節通氣，監測血氧及中心靜脈壓。調節麻醉藥的血漿靶濃度，持續泵注順式阿曲庫銨至術畢，關閉硬腦膜前靜注芬太尼20 μg，術畢前30 min靜注氟比洛芬酯，術后注意鎮痛，并應用托烷司瓊。積極處理不良反應及并發癥。

1.3方法

1.3.1CCK-8法檢測細胞活力 取對數生長期細胞接種在96孔板中，孵育過夜，每孔加100 μl培養液和10 μl CCK8試劑，避光孵育2 h，用酶標儀在波長450 nm處測定吸光度(A)值，細胞活力計算公式：細胞活力(%)=(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.3.2miR-146a表達的檢測 應用實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測miR-146a的表達。引物上游：5＇-GGGATGCGTGCGATTCCA-3＇，下游：5＇-CATGTGCGTCACGTGGATG-3＇，產物為98 bp。U6為內參，上游：5＇-GCATAACACTAGAGGGTCCA-3＇，下游：5＇-CAGGTGAATTTCCCAGGTCGG-3＇，產物為75 bp。應用TRIzol提取總RNA。cDNAs由TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒合成。反應程序：95℃ 10 min，循環1次；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，循環35次，72℃延伸7 min。60℃采集信號。記錄Ct值，通過2-ΔΔCt法計算目的基因和相對表達水平。

1.3.3細胞系中BDNF、S100B和PCNA的檢測 內參應用GAPDH。BDNF、S100B和PCNA的試劑武漢博士德生物技術公司。制備分離膠后加樣，應用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉膜、洗膜、封閉，依次滴加一抗、二抗，顯影。行灰度分析，應用Image J完成，以蛋白與GAPDH的比值的半定量結果進行分析。

1.3.4血清中BDNF、S100B、超氧化物歧化酶(SOD)和miR-146a的檢測 檢測術前、術中、術畢、術后第1、2、3天患者血清中BDNF、S100B、SOD和miR-146a的表達。試劑盒均購自蘇州睿贏生物技術公司。BDNF、S100B的檢測應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。SOD的檢測應用黃嘌呤氧化酶法。MiR-146a的檢測應用qPCR法。

1.4統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1各組細胞系中細胞活力的比較 利用CCK-8試劑盒，檢測0～5 d細胞的活力。從第2天開始，FeCl2組細胞活性明顯低于C組，此種改變持續至第5天。而FeCl2+DEX組細胞活性明顯高于FeCl2組(P<0.05)。即DEX能改善細胞的增殖作用。見表1。

表1 各組細胞系中細胞活力的比較(%，n=3)

2.2各組細胞系中miR-146a表達水平的比較 應用qPCR法檢測第5天各組細胞中miR-146a表達，結果顯示FeCl2組miR-146a表達(0.98±0.09)明顯高于C組(0.65±0.08,P<0.05)，FeCl2+DEX組miR-146a表達(0.86±0.08)明顯低于FeCl2組(P<0.05)。即DEX能下調miR-146a的表達。

2.3各組細胞系中BDNF、S100B和PCNA表達的比較 應用Western印跡檢測第5天各組細胞系中BDNF、S100B和PCNA表達，結果顯示FeCl2組BDNF和PCNA表達明顯低于C組，S100B表達明顯高于C組，而FeCl2+DEX組BDNF和PCNA表達明顯高于FeCl2組，S100B表達明顯低于FeCl2組(P<0.05)。即DEX能上調BDNF和PCNA的表達，下調S100B的表達。見圖1、表2。

圖1 各組細胞系中BDNF、S100B和PCNA表達的比較

表2 各組細胞系中BDNF、S100B和 PCNA表達比較

2.4腦出血患者基線資料 觀察組共38例患者，1例術中出血量超過1 500 ml提前終止干預；對照組共38例患者，1例術后顱內出血行二次手術。均排除觀察。兩組各37例完成觀察及檢測。觀察組中男21例，女16例；年齡34～84歲，平均(59.6±7.5)歲；身高146～189 cm，平均(169.1±22.6)cm；體重40～102 kg，平均(69.7±19.7)kg。對照組中男19例，女18例；年齡35～83歲，平均(58.9±12.6)歲；身高149～187 cm，平均(168.9±32.1)cm；體重42～99 kg，平均(65.6±18.3)kg。兩組一般資料無明顯差異(P>0.05)。

2.5兩組譫妄發生率比較 術后第1、2天及術后3 d內觀察組譫妄發生率明顯低于對照組(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 兩組譫妄發生率比較〔n(%),n=37〕

2.6兩組各時點 BDNF、S100B、SOD和miR-146a表達比較 兩組術前血清中BDNF、S100B、SOD和miR-146a表達無統計學意義；觀察組術中、術畢、術后第1、2天時BDNF、S100B、SOD和miR-146a表達與對照組比較有統計學差異(P<0.05)。見表4。

表4 兩組各時點BDNF、S100B、SOD和miR-146a表達比較

3 討 論

腦出血急性期神經細胞伴有直接損傷和間接損傷。間接損傷主要為損傷因子誘發的。本實驗選擇SH-SY5Y細胞，構建神經細胞損傷的細胞模型，由于FeCl2對神經細胞的毒性作用強〔4〕，且受損的神經細胞與出血后的神經細胞功能相似(均為鐵過載狀態)，因此選擇FeCl2為損傷因子〔5〕。實驗發現FeCl2和DEX組的細胞活性明顯增強，且趨于正常細胞的活性，提示DEX能改善損傷神經細胞的增殖能力，提高修復功能〔6〕，此種作用經PCNA表達的實驗證實。有研究認為DEX可以減少由Caspase-3介導的細胞凋亡，使細胞損傷的內質網因素也起到了不同程度的抑制〔7〕。BDNF是神經細胞保護因子，本研究提示DEX對神經細胞的保護作用可能是通過介導BDNF上調實現的。研究顯示DEX調控時可引起下游核因子κB的活化，調節凋亡和炎癥反應〔8，9〕。這個作用可能也是DEX對神經細胞保護的重要途徑之一。S100B是本實驗選擇的神經細胞損傷因子，是膠質細胞的鈣結合蛋白，其在神經細胞損傷后在神經細胞、神經細胞周圍及血清中均能檢測到其表達升高，這與神經細胞的降解相關，也與神經細胞的損傷后周圍炎性因子的刺激相關。S100B激活后氧自由基產生增多、興奮性氨基酸釋放過量、細胞內鈣超載、線粒體損傷、凋亡基因激活、炎癥反應及免疫應答等均可以加重腦損傷。本實驗顯示，DEX能使損傷的神經細胞中S100B的表達下調，抑制神經細胞周圍的液體環境，對正常內環境細胞因子網絡平衡的恢復有重要價值。MiR-146a和SOD是氧化應激指標，SOD是保護因子，有研究顯示SOD可能是miR-146a的下游靶基因，二者可共同調控局部的應激性反應〔10〕。本研究證實了DEX對miR-146a的下調作用及對SOD的上調作用，使神經細胞損傷程度減弱，應激反應減弱〔11，12〕。也有研究顯示，氧化應激反應與局部神經細胞損傷后鐵蛋白增高有關〔13，14〕。本研究雖然未顯示出二者靶的靶向關系，但是DEX對二者均有調控也間接證實了二者的協同性。DEX使機體的氧化應激反應控制在一定的水平。本實驗細胞系干預中DEX對miR-146a進行調控，但是對細胞內的鐵無明顯作用，使本研究結果更客觀。

本實驗表明，腦出血患者術中應用DEX可以減少應激反應，提高血清中神經細胞保護因子的表達。DEX可以引起術后患者譫妄發生率明顯下降，這與DEX應用后減輕腦水腫，改善神經系統評分，抑制炎癥反應均有關。DEX在術中應用是安全的，也有研究顯示DEX可以抑制炎癥因子的升高〔15，16〕。DEX應用后血清中BDNF、S100B、SOD和miR-146a的表達有趨勢性改變，這與細胞系實驗中的結果較為一致。DEX的藥理作用是抑制藍斑核去甲腎上腺素釋放和神經元細胞膜的超級化，通過抑制腺苷酸環化酶的活性減少環磷酸腺苷(cAMP)的生成〔17，18〕。DEX的藥理作用是改善不完全損傷神經細胞的形態，通過ERK通路刺激星形膠質細胞產生BDNF，降低S100B蛋白的表達，同時對應激反應進行調控，改善機體內環境中細胞因子網絡的平衡〔19，20〕。DEX減弱患者術中和術后的應激損傷〔21，22〕。這種作用與DEX能降低血漿中兒茶酚胺的濃度、抑制交感神經興奮可能有關〔23〕。

綜上，DEX能發揮腦出血神經細胞的保護功能，降低氧化應激水平。腦出血患者應用DEX后譫妄發生率低，血清學指標趨勢于穩定，臨床中可以積極應用。