過表達SIRT1對口腔癌細胞增殖、免疫應答及氧化應激的影響

畢磊 賀釗 劉輝 武燃 陳暉

(1華北理工大學附屬醫院口腔科，河北 唐山 063000；2唐山市第二醫院麻醉科)

口腔癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，由于早期無明顯癥狀，導致許多患者確診時已發生淋巴結轉移〔1〕。據統計，全球口腔癌發病率呈逐年遞增的趨勢，且多發于中年男性〔2〕。研究表明，口腔癌發病與長期生活作息不良、吸煙及口腔類疾病長期刺激有關〔3，4〕。目前，臨床上針對口腔癌的治療方法主要有手術治療、放射治療、化療和中醫中藥治療等〔5，6〕。沉默信息調節因子(SIRT)1是NAD+依賴的去乙酰化酶，通過使底物去乙酰化而參與調節細胞凋亡、免疫應答、氧化應激等生理功能〔7～10〕。研究發現，SIRT1過表達在多種腫瘤和癌細胞中發揮抑癌作用，如SIRT1過表達通過增強局部炎癥反應抑制乳腺癌細胞生長〔11〕，SIRT1過表達通過抑制p65乙?；种蒲装Y細胞因子激活的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)產生，破壞間質干細胞免疫抑制能力12，SIRT1過表達通過抑制核轉錄因子(NF)-κB信號傳導減弱骨橋蛋白誘導的非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲和遷移〔13〕等。但SIRT1過表達在口腔癌中的研究鮮見報道，本研究通過口腔癌CAL27細胞轉染SIRT1過表達，檢測SIRT1過表達對CAL27細胞增殖、免疫應答及氧化應激水平的影響。

1 材料與方法

1.1細胞、試劑及儀器 人口腔癌細胞CAL27由中國科學院上海細胞生物研究所提供，pcDNA過表達質粒和載體購自上海艾博思生物技術有限公司。轉染試劑Lipofectamine?2000購自美國CST公司(貨號11668030)，反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒、Trlzol試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(貨號RP1100、RP2401、PC0020)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自北京邁瑞達科技有限公司(貨號MF01544、MF01310、MF01360、MF01963、MF16742、MF16113)，10%胎牛血清和DMEM培養基購自美國Gibco公司(貨號10100147、10313039)，兔抗鼠SIRT1單克隆抗體(ab32441)、兔抗鼠含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3多克隆抗體(ab13847)、大鼠p21單克隆抗體(ab107099)、兔抗鼠NF-κB p65多克隆抗體(ab16502)、兔抗鼠活性氧(ROS)單克隆抗體(ab238986)及辣根過氧化物酶(HRP)標記的對應山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G均購自美國Abcam公司。GeneAmp PCR系統9700、ABI7500 Real-Time PCR系統(Applied Biosystems)；酶標儀(Rayto，RT6100)，臺式高速離心機(大龍，D3024R)，成像系統(上海天能科技有限公司，Tanon-1600R)，光學顯微鏡(日本尼康，Nikon Eclipse E100)。

1.2細胞培養及轉染 口腔癌細胞CAL27置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，5%CO2、37℃培養箱中培養至對數生長期后用于實驗研究。按照轉染試劑Lipofectamine?2000說明書將pcDNA過表達質粒和空載體轉染至CAL27細胞中，轉染24 h后，收集細胞進行后續實驗。CAL27細胞分為對照組、陰性對照組和SIRT1過表達組，陰性對照組和SIRT1過表達組按照轉染試劑Lipofectamine2000說明書將空載體和pcDNA SIRT1過表達質粒轉染至CA127細胞中，對照組不轉染，24 h后收集細胞進行后續實驗。

1.3RT-PCR檢測SIRT1 mRNA表達水平 選擇對數生長期的CAL27細胞，經胰酶消化處理后收集細胞懸液，用Trlzol試劑盒提取細胞總RNA，測定RNA濃度和純度。按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，按RT-PCR試劑盒操作說明配制反應體系。在PCR擴增儀上進行擴增(擴增條件：保持步驟96℃ 15 s，和40個循環95℃ 10 s和60℃ 30 s)采用2-ΔΔCt法分析結果。獨立重復實驗3次，取平均值。SIRT1上游引物：5′-TGCGGGAATCCAAAGGATAATTCA-3′，下游：5′-CTT-CATCTTTGTCATACTTCATGGCT-3′；GADPH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCT-CCAAAAT-3′，下游：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.4克隆形成實驗檢測細胞生長 收集各組生長至對數生長期的細胞，經胰酶消化后制備細胞懸液，將細胞按梯度倍數進行稀釋并接種至培養皿中，培養2～3 w，至肉眼可見克隆時終止培養，棄上清液，結晶紫染色液染色10～20 min，選取培養皿拍照計數，克隆形成率=(克隆數/接種細胞數)×100%。

1.5Western印跡檢測SIRT1、caspase-3、P21和p-P65蛋白水平 取各組對數生長期的CAL27細胞，胰酶消化處理細胞。用RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定細胞蛋白濃度，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉模、脫脂奶粉封閉后，加入抗體SIRT1(1∶200)、caspase-3、p21、P65(1：500)，4℃孵育搖床過夜?；厥找豢?，加入按比例稀釋HRP標記的對應二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。采用電化學發光(ECL)法于暗室下曝光顯影(GADPH作內參)。將膠片進行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件分享光密度值。獨立實驗重復3次，取平均值。

1.6ELISA檢測iNOS、白細胞介素(IL)-6、IL-10含量 收集各組對數生長期的CAL27細胞，制備細胞懸液，4℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，按ELISA試劑盒操作說明書測定iNOS、IL-6、IL-10、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和乳酸脫氨酶(LDH)含量，酶標儀下測450 nm處吸光值，(實驗組OD450-空白組OD450)/(對照組OD450-空白組OD450)×100%，重復實驗3次，取平均值。

1.7免疫熒光檢測ROS含量 取對數生長期細胞，接種至24孔板中，待細胞貼壁爬片后吸取培養基，用提前預熱的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，加入0.01 mol/L PBS洗滌3次，加入3%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，37℃條件下封閉1 h。棄封閉液后加入ROS一抗(1∶300)，4℃孵育過夜。0.01 mol/L PBS液洗滌3次，加入對應的二抗(1∶100)室溫孵育2 h后加入0.01 mol/L PBS洗滌3次。10 μmol/L DCFH-DA室溫標記15 min，PBS洗滌3次，熒光封片后顯微鏡下觀察。獨立重復實驗3次，取平均值。

1.8統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行方差分析、LSD法。

2 結 果

2.1SIRT1過表達效率 與對照組相比，陰性對照組SIRT1 mRNA及蛋白表達水平無明顯差異(P>0.05)，SIRT1過表達組SIRT1 mRNA及蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)。見表1、圖1。提示過表達體系構建成功。

2.2SIRT1過表達對CAL27細胞生長的影響 與對照組〔(32.21±6.88)%〕相比，陰性對照組克隆形成率〔(35.45±7.82)%〕無明顯差異(P>0.05)，SIRT1過表達組細胞克隆形成率〔(6.46±4.73)%〕明顯降低(P<0.05)。見圖2。

表1 RT-PCR和Western印跡檢測各組細胞SIRT1 表達水平

圖1 Western印跡檢測各組細胞SIRT1表達水平

圖2 克隆形成實驗檢測各組SIRT1轉染后的細胞增殖(結晶紫染色)

2.3SIRT1過表達對CAL27細胞凋亡的影響 與對照組相比，陰性對照組細胞中Cleaved caspase3/caspase3和p21表達水平無明顯差異(P>0.05)，SITR1過表達組Cleaved caspase3/caspase3和p21表達水平明顯上調(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 SIRT1過表達對CAL27細胞凋亡相關蛋白表達、iNOS、IL-6和IL-10水平及 p-P65蛋白磷酸化的影響

2.4SIRT1過表達對CAL27細胞免疫因子表達水平的影響 與對照組相比，陰性對照組細胞上清液中iNOS、IL-6和IL-10含量無明顯變化(P>0.05)，SIRT1過表達組細胞上清液中iNOS和IL-6含量明顯降低，IL-10含量明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.5SIRT1過表達對CAL27細胞中p-P65表達水平的影響 與對照組相比，陰性對照組細胞中p-P65/P65蛋白表達水平無明顯差異(P>0.05)，SIRT1過表達組細胞中p-P65/P65蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表2、圖4。

圖3 Western印跡檢測Cleaved caspase3/caspase3和 p21蛋白表達水平

2.6SIRT1過表達對CAL27細胞氧化應激的影響 與對照組相比，陰性對照組SOD、MDA和LDH含量無明顯差異(P>0.05)，SIRT1過表達組SOD含量明顯降低，MDA和LDH含量水平明顯升高(P<0.05)。見表3。

2.7SIRT1過表達對CAL27細胞ROS活性氧含量水平的影響 與對照組〔(6.92±2.44)U/ml〕相比，陰性對照組細胞中ROS含量〔(7.48±2.13)U/ml〕無明顯差異(P>0.05)，SIRT1過表達組細胞ROS活性氧含量〔(26.67±3.58)U/ml〕明顯增高(P<0.05)。見圖5。

圖4 Western印跡檢測各組細胞中p-P65/P65 蛋白表達水平

表3 SIRT1過表達對CAL27細胞氧化應激的 影響

圖5 免疫熒光檢測各組ROS含量(×400)

3 討 論

研究表明，SIRT1表達水平對口腔癌的病理生理改變具有重要影響，SIRT1表達下調促進口腔癌細胞增殖、侵襲轉移，而SIRT1穩定表達或表達上調則抑制口腔癌細胞增殖、侵襲轉移，同時SIRT1表達上調能夠誘導口腔癌上皮細胞中E-cadherin表達并抑制轉化生長因子(TGF)-β介導的口腔癌惡性轉化、侵襲和轉移〔14～16〕。本研究結果發現，過表達SIRT1顯著抑制CAL27細胞增殖，促進細胞凋亡和氧化應激，調節細胞免疫應答。

口腔癌的發生發展依賴于癌細胞增殖、侵襲和轉移等過程。p21是近年來發現的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族成員之一，p21與腫瘤增殖、分化和轉移密切相關，研究發現，p21在口腔癌細胞中表達上調導致口腔癌細胞中G0/G1細胞周期停滯，抑制細胞增殖，并誘導細胞凋亡〔17，18〕。caspase-3是細胞凋亡執行蛋白，在細胞凋亡過程中，上游的caspase-9啟動caspase-3并發生級聯反應，誘發細胞凋亡〔19〕。本研究結果顯示，過表達SIRT1顯著上調p21和caspase-3表達水平，結合克隆形成實驗結果進一步說明過表達SIRT1抑制口腔癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。

iNOS、IL-6和IL-10是重要的多功能細胞因子，參與調節細胞生長分化、炎癥、免疫反應等，與多種腫瘤發生發展密切相關。大量研究表明，IL-6通過調節細胞間的黏附力、活動力及腫瘤細胞特異性抗原的表達而影響腫瘤的發生發展〔20〕。Singh等〔21〕發現，iNOS表達增加可作為口腔鱗狀細胞癌的早期診斷指標，同時也是口腔鱗狀細胞癌的預后指標。IL-10是一種免疫調節細胞因子，具有抗炎癥、免疫抑制、抗衰老等生物學功能。研究表明，IL-10在口腔癌細胞中高表達抑制癌細胞免疫能力，同時，IL-10高表達促進癌細胞增殖、侵襲和轉移〔22〕。p65是天然的參與調控細胞免疫、炎癥反應的轉錄因子〔23〕。本研究結果提示，過表達SIRT1通過調節口腔癌細胞中細胞因子表達水平參與口腔癌細胞免疫反應。

氧化應激與癌癥發生發展密切相關，SOD是氧自由基清除酶，在氧化與抗氧化平衡過程中發揮重要調控作用。MDA和ROS是細胞線粒體損傷和氧自由基積累的主要產物，過量的MDA和ROS能損壞細胞正常功能，并誘導細胞凋亡或壞死。LDH含量水平常作為診斷惡性腫瘤轉移的重要指標〔24，25〕。本研究結果提示，過表達SIRT1通過誘導口腔癌細胞CAL27氧化應激反應，促使細胞凋亡。

綜上，過表達SIRT1抑制口腔癌細胞CAL27生長，調節細胞免疫反應，并促進細胞凋亡和氧化應激。后續實驗計劃通過移植瘤動物模型探討過表達SIRT1在體外的效果。