亞急性瘤胃酸中毒耐受性不同的奶牛瘤胃上皮形態及功能差異研究

張濤，牟英玉，亓王盼，張繼友，毛勝勇

（南京農業大學消化道微生物研究室，反芻動物與營養飼料工程中心，動物科技學院，江蘇 南京 210095）

我國是一個優質牧草資源十分匱乏的國家，奶牛生產中，為提高奶牛產奶量，養殖者常給奶牛飼喂高谷物日糧以提高產奶量。然而，奶牛攝入過多的易發酵碳水化合物易導致瘤胃微生物發酵速率加快，產生大量揮發性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA），導致瘤胃內環境酸堿平衡被破壞，引起瘤胃pH急劇下降［1］，繼而誘發亞急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis，SARA）等瘤胃疾病［2］。研究發現，SARA可引起瘤胃代謝紊亂，誘發皺胃移位、瘤胃炎、乳房炎及蹄葉炎等［3-5］，給奶牛養殖造成了巨大的經濟損失。生產中發現，盡管通過營養配方調整、添加瘤胃緩沖劑或微生物制劑可降低SARA的發生率，但奶牛場中仍然存在一定程度SARA的發生率，這一現象顯示，SARA的發生除受日糧結構的影響外，還與其他因素有關。此外，近年來研究發現，即便在相同日糧條件下，奶牛發生SARA的嚴重程度也不一致［6-8］，造成營養配方調整方案實施困難，部分易感個體出現嚴重的酸中毒現象。這些結果說明，奶牛個體間對SARA的易感性存在差異，這種個體差異的存在可能是導致當前營養調控手段不能完全控制奶牛發生SARA的根本原因。因此，明確SARA耐受不同奶牛的瘤胃生理特征，有利于篩選SARA耐受性強的奶牛進行飼養，進而降低牛群患SARA的風險，減少蹄葉炎、真胃移位等營養代謝病的發生，從而推進奶牛分群飼養及健康養殖的發展。

眾所周知，SARA的發生主要與瘤胃pH過低有關，而瘤胃pH主要受瘤胃內VFA生成和移除速率的影響［9-10］。因此，瘤胃內VFA生成和移除速率差異極有可能是造成SARA耐受性不同的關鍵因素。在瘤胃中，VFA的移除主要通過瘤胃上皮對VFA吸收來實現，而瘤胃上皮對VFA的吸收主要與瘤胃上皮形態和功能有關。然而，目前關于不同SARA易感奶牛的瘤胃上皮形態及其與VFA吸收相關的功能基因表達差異的研究鮮有報道。由此，本研究擬在相同日糧條件下，以瘤胃pH為基準，篩選出對SARA耐受性不同的奶牛，結合伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）切片及實時定量PCR等技術手段，比較研究兩組奶牛瘤胃上皮組織形態及其功能基因表達差異，以揭示奶牛SARA耐受性與其瘤胃上皮形態與功能基因表達的潛在關系。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及動物飼養管理

本試驗于2019年2月在江蘇泰州天資牧業有限公司開展，選用12頭體重相近且裝有永久性瘤胃瘺管的泌乳中期荷斯坦奶牛［2～3胎，泌乳天數為（114±22）d］，栓系飼喂，自由采食和飲水。試驗期為35 d，前14 d為日糧適應期，后21 d為試驗期，奶牛試驗期提供精粗比為4∶6的混合飼糧，飼糧配方及營養水平在張濤等［11］的研究中已詳細描述。分別于每天8：00和19：00飼喂，剩料量控制在飼喂量的5%～10%，并于飼喂前擠奶。

1.2 樣品采集

在試驗期第20和21天晨飼后的0、2、4、6、8、12 h測定瘤胃pH，并于0、4、8、12 h測定瘤胃VFA濃度，隨后基于瘤胃pH變化，將奶牛進行分組。在第21天晨飼前，采集人員佩戴一次性滅菌長臂手套，通過瘤胃瘺管觸及瘤胃腹囊乳頭根部，用手指捏斷瘤胃乳頭根部，迅速放置培養皿中用冰磷酸鹽緩沖溶液（phospate buffered saline，PBS）清洗3次后，挑選完整上皮乳頭置于4%多聚甲醛溶液中，并置于4 °C保存，用于瘤胃上皮乳頭組織形態學分析；取剩余部分乳頭剪碎，于液氮中保存，用于RNA提取。

1.3 樣品測定

1.3.1 瘤胃上皮組織形態測定 每頭奶牛選取3個完整的瘤胃上皮乳頭進行脫水、漂洗，并包埋于石蠟中。每個蠟塊不連續切5塊厚6 μm的組織，進行HE染色，最后封片。在40倍物鏡下對瘤胃上皮的各層厚度進行測量，每張切片選取5個不同區域，每頭動物共有15個重復。瘤胃上皮各層厚度的測量具體步驟參照Steele等［12］的研究方法。

1.3.2 瘤胃上皮乳頭RNA提取及實時定量PCR分析 瘤胃上皮乳頭RNA提取采用TRIzo（lTakara生物，日本）方法，提取的RNA濃度使用NanoDrop 1000分光光度計（Nyxor Biotech，法國）測定。RNA吸光值在1.8～2.1，說明所提取的RNA純度合格，之后用1.4%的瓊脂糖甲醛凝膠電泳驗證RNA樣品的完整性。RNA經檢測合格后，將每個樣品的RNA濃度調整至500 ng·μL-1，并使用反轉錄試劑盒（Takara生物，日本）合成cDNA。根據GenBank上牛的核酸序列，應用Primer 5.0（Whitehead Institute，美國）軟件進行相應的定量引物設計。引物序列如表1所示，所有引物由上海擎科生物科技有限公司合成。使用ABI 7500定量PCR儀（Thermo，新加坡）對目的基因及內參基因進行定量。反應程序如下：95 °C 30 s預變性，95 °C 5 s，60 °C（目的基因）34 s，重復40個循環。使用20 μL反應體系，所有樣品設3個重復，目的基因相對表達量以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參進行校正，數據分析采用2-△△Ct方法［13］。

1.4 數據處理

采用Excel（2019）初步整理數據后，采用SPSS 26.0軟件中單因素重復測量模型分析瘤胃pH數據，時間點作為重復。瘤胃上皮乳頭組織形態學及其功能基因表達數據使用SPSS軟件中獨立樣本T檢驗分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

根據測得的瘤胃pH，本試驗將瘤胃pH平均值最高（pH=6.11，n=4）和最低（pH=5.76，n=4）的奶牛分為耐受組（tolerant，TOL）和易感組（susceptible，SUS），具體數據詳見Zhang等［14］的研究。

2.1 SARA易感與耐受奶牛瘤胃上皮形態比較

HE染色切片結果如圖1所示，測量結果顯示，與TOL組奶牛比較，SUS組奶牛的瘤胃上皮乳頭的棘突層和基底層厚度（P=0.001）及總厚度（P=0.001）顯著增厚，兩組瘤胃上皮乳頭的角質層（P=0.568）、顆粒層（P=0.360）厚度無顯著性差異（表2）。

表2 SUS和TOL組奶牛瘤胃上皮厚度變化Table 2 The changes in rumen epithelial thickness between the SUS（susceptible）and TOL（tolerant）groups（μm）

圖1 瘤胃上皮乳頭光學顯微鏡圖Fig.1 Light micrograph of rumen epithelial papillae

2.2 SARA易感與耐受奶牛瘤胃上皮細胞中與pH調節及氫離子轉運相關的基因表達量比較

為探究瘤胃上皮對VFA的吸收能力與SARA耐受性之間的潛在關系，本研究對SARA耐受性不同的奶牛瘤胃上皮細胞的VFA吸收相關基因表達量進行了定量分析。如圖2A所示，SUS組奶牛瘤胃上皮細胞中參與瘤胃pH調節的vH+ATPase和Na+/K+ATPase基因及Na+/H+交換蛋白NHE1、NHE2和NHE3表達量顯著高于TOL組（P＜0.01）。如圖2B所示，與TOL組比較，SUS組瘤胃上皮細胞與短鏈脂肪酸轉運相關的蛋白基因PAT1、MCT4和DRA的表達量顯著下降（P＜0.01）。

圖2 瘤胃上皮細胞參與離子交換及VFA吸收相關基因相對表達量Fig.2 The relative expression levels of ion exchange and VFA absorption-related gene in rumen epithelial cells

2.3 SARA易感與耐受奶牛瘤胃上皮細胞中與VFA轉運及代謝相關的基因表達量比較

瘤胃VFA經瘤胃上皮后，部分在瘤胃上皮細胞內代謝，為瘤胃上皮細胞提供能量。因此，本研究檢測了瘤胃上皮細胞有關VFA代謝的相關基因表達量。結果如圖3A顯示，SUS組丙酰基輔酶A羧化酶（Propionyl-CoA carboxylase）和丙酮酸脫氫酶1（PDHA1）的mRNA表達量顯著高于TOL組，而乳酸脫氫酶a（LDH a）的基因表達量顯著降低（P＜0.01）。瘤胃上皮細胞中調控膽固醇及酮體合成的基因定量結果顯示（圖3B），與TOL組比較，SUS組奶牛瘤胃上皮細胞中的SREBP1和SREBP2表達量顯著升高（P＜0.05），而HMGCL-2表達量顯著下降（P＜0.01）。

圖3 瘤胃上皮細胞參與VFA代謝相關基因的相對表達量Fig.3 The relative expression levels of VFA metabolism genes in rumen epithelial cells

2.4 SARA易感與耐受奶牛瘤胃上皮細胞中與增殖和凋亡相關的基因表達量比較

此前結果發現，兩組奶牛瘤胃上皮厚度差異顯著，暗示其瘤胃上皮細胞增殖和凋亡進程存在變化。因此，本研究對控制瘤胃上皮細胞增殖和凋亡的基因表達量進行定量，結果顯示，SUS組CDK2、CDK6和Cyclin D1表達量極顯著高于TOL組（P＜0.01，圖4A），且控制細胞凋亡的Bad（P＜0.05）和Caspase-9（P＜0.01）的表達量顯著升高（圖4B），該結果表明易感奶牛瘤胃上皮細胞的細胞周期進程更短。

圖4 調控瘤胃上皮細胞增殖和凋亡的基因相對表達量Fig.4 The relative expression levels of cell proliferation and apoptosis genes in rumen epithelial

2.5 瘤胃發酵參數與瘤胃上皮細胞功能基因表達量的關聯分析

為探究瘤胃發酵參數與瘤胃上皮細胞功能間的內在聯系，本試驗將瘤胃發酵參數［14］與參與調節瘤胃VFA吸收與代謝的相關差異基因進行關聯分析（基于Superman方法計算）。根據閾值|r|＞0.6，P＜0.05為篩選標準，以確定瘤胃發酵參數與上皮細胞差異表達基因的相關性。如圖5所示，瘤胃pH與鈉氫離子交換蛋白NHE1和NHE2表達量呈顯著負相關（P＜0.05），瘤胃丙酸、丁酸、戊酸及TVFA濃度與NHE1表達量顯著正相關；PAT1、MCT4和DRA表達量與丙酸濃度顯著負相關，而與瘤胃pH顯著正相關。

圖5 瘤胃發酵參數與瘤胃上皮功能基因相對表達量的相關性Fig.5 Correlation between rumen fermentation parameters and relative expression of epithelial functional genes

3 討論

長期飼喂高精料日糧可引起奶牛瘤胃內VFA濃度升高，使瘤胃pH長期處于較低水平，進而引發一系列營養代謝疾病如瘤胃炎等［15-16］。生產實踐中發現，在飼喂相同高精料日糧條件下，奶牛個體間發生SARA的嚴重程度不一致［8-17］。本試驗采用相同日糧飼喂，發現12頭奶牛的平均瘤胃pH出現明顯的差異，部分奶牛的瘤胃平均pH值明顯要低于另一些奶牛，且部分奶牛的瘤胃pH值已達到SARA的標準，該結果與以往有關SARA易感性的研究結果一致［18-19］，表明奶牛個體間SARA耐受程度不同的現象普遍存在。前期研究結果表明，SUS組奶牛的瘤胃TVFA、丙酸、丁酸及戊酸濃度顯著高于TOL組，并揭示了部分瘤胃微生物與SARA耐受性差異的潛在關聯［14］，但瘤胃內VFA的積累不僅取決于微生物的發酵速率，同時與瘤胃上皮對VFA的吸收代謝息息相關。因此在該研究中，對兩組奶牛瘤胃上皮形態及其對VFA的吸收代謝進行了深入研究。

瘤胃上皮乳頭棘突層和基底層含有豐富的細胞器，是VFA吸收和代謝的主要場所［20］。本研究中，SUS組奶牛瘤胃上皮棘突層和基底層的厚度明顯要比TOL組奶牛厚，該結果表明，兩組奶牛瘤胃上皮細胞對VFA的吸收代謝能力可能存在差異。由此，本試驗進而研究了兩組奶牛瘤胃上皮細胞調控VFA吸收與代謝相關基因的表達。眾所周知，瘤胃對VFA的吸收機制主要包括被動擴散、陰離子交換及質子耦合等，其中脂溶性VFA可直接通過瘤胃壁之間的間隙進入血液，而大部分游離的脂肪酸通過陰離子交換及質子耦合途徑吸收［21-22］。DRA與PAT1是主要的VFA-/H+交換載體，而MCT4是VFA-/H+共轉運載體，對瘤胃內VFA-吸收起關鍵作用［21-23］。SUS組奶牛瘤胃上皮細胞中參與揮發性脂肪酸酸根離子吸收的DRA、PAT1和MCT4的相對表達量明顯較低，表明其對瘤胃內游離脂肪酸酸根離子的吸收作用較弱。在瘤胃中，非游離態的VFA主要通過被動擴散進入瘤胃上皮細胞，并迅速解離成VFA-和H+，H+濃度的升高可引起細胞內pH值下降，從而激活細胞膜上的NHE家族基因，將H+運輸至細胞外以維持細胞內穩態［24-25］。SUS組瘤胃上皮細胞中NHE1、NHE2、NHE3和Na+/K+ATPase等基因表達量上調，表明其有利于胞內H+外排，進而導致瘤胃中pH下降。關聯分析結果也證實了這一推測，NHE家族基因表達量與瘤胃pH呈顯著負相關，而DRA、PAT1和MCT4基因則與瘤胃pH呈顯著正相關。由此，以上的結果表明，兩組奶牛的瘤胃上皮細胞對VFA的吸收模式存在差異，主要表現在SARA易感奶牛的瘤胃上皮對瘤胃中游離的脂肪酸酸根離子的吸收減緩，而對瘤胃內非游離VFA的吸收增加。

瘤胃內VFA被瘤胃上皮細胞吸收后，大部分VFA在瘤胃上皮細胞內被代謝，僅少部分直接進入血液，且VFA的代謝速率會影響其吸收速率。本試驗進一步探究了兩組奶牛瘤胃上皮細胞中調控VFA代謝的相關基因表達差異。研究表明，瘤胃中75%的丙酸和95%的丁酸經瘤胃上皮細胞代謝［26］，其中丁酸主要由瘤胃上皮細胞中的酰基輔酶A合成酶家族加入輔酶A酯生成乙酰輔酶A，最終合成酮體和膽固醇［27-28］。本研究發現，SUS組奶牛瘤胃上皮細胞中丙酸代謝途徑中的Propionyl-CoA carboxylase和PDHA1基因表達量明顯較高，證明SUS組奶牛瘤胃上皮丙酸代謝更為活躍，且SUS組瘤胃內丙酸和丁酸濃度升高亦可促進瘤胃上皮代謝。然而，SUS組的SREBP1和SREBP2表達量卻高于TOL組，說明SUS組中SREBP通路被激活，但激活該通路的主要因子仍不清楚，需進一步研究。此外，本研究發現，SUS組奶牛瘤胃上皮細胞中促進細胞增殖（CDK2，CDK6和Cyclin D1）和凋亡（Bad，Caspase-9）的基因表達量明顯較高，結果說明SUS組奶牛瘤胃上皮細胞周期進程加快，這也可能是導致這些奶牛瘤胃上皮層總厚度增加的原因之一。

4 結論

綜上所述，本研究表明，SUS組奶牛瘤胃上皮細胞調控游離脂肪酸吸收的DRA、PAT1和MCT4基因表達量下調，而調節非游離脂肪酸吸收的NHE家族基因表達量增加，結果導致奶牛瘤胃內游離脂肪酸的累積，瘤胃pH下降，這也是不同奶牛對SARA耐受性存在個體差異的根本原因之一。此外，SUS組奶牛瘤胃上皮細胞參與調控細胞增殖與凋亡的基因表達量顯著增高，說明SUS組奶牛的瘤胃上皮細胞周期進程加快，導致瘤胃上皮層總厚度增厚。