基于廣泛靶向代謝組學的桃芽抗寒代謝物的篩選與鑒定

劉蘇寧　王力榮　方偉超　陳昌文　王新衛　李勇　吳金龍　曹珂

關鍵詞：桃芽；抗寒性；差異代謝物；代謝組

中圖分類號：S662.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）01-0001-12

桃（Prunus persicaL.），薔薇科、李屬植物，落葉小喬木，原產中國。桃的栽培歷史已有4000多年，品種多樣，在世界各地均有分布。溫度是影響桃樹生長發育以及決定其自然分布的主要環境因子，明確其響應低溫的生理生化機制對培育和篩選桃抗寒品種，應對生長季低溫及擴大栽培區域，具有重要的理論和實踐意義。

在前期研究中，關于植物抗寒的生理機制已有不少報道。研究發現，植物體內存在一套負責清除活性氧的抗氧化系統，該系統是細胞抗寒生理生化的重要基礎，當植物受到低溫脅迫后，細胞內積累大量活性氧、自由基，這些傷害信號會引起植物對逆境脅迫的響應，形成氧化脅迫。氧化脅迫會破壞細胞的結構和功能，使代謝酶活性降低，影響細胞正常生長，嚴重時還會造成細胞死亡。丙二醛（MDA）含量是常用的膜脂過氧化指標，通過測定MDA含量可衡量細胞膜系統的損傷程度。此外，脯氨酸也是植物的一種重要的抗逆相關物質，其含量在逆境條件下顯著上升。脯氨酸的大量積累有助于細胞保水，促進細胞恢復正常生長。因此，果樹在寒冷脅迫過程中脯氨酸含量，也是衡量植物抗寒性的重要指標。

代謝組學是20世紀90年代中期發展起來的新興學科，作為系統生物學的重要組成部分，代謝組學能夠揭示不同物種間、同一物種的不同組織之間以及同一物種的同一組織在不同逆境脅迫條件下的代謝物圖譜的差異，從而有助于解釋植物響應逆境的生理生化特征。目前，代謝組學已經廣泛應用于植物逆境脅迫研究中。Ding等通過對番茄添加色胺類物質后，分析寒冷脅迫對番茄的傷害程度，表明外源施加物能夠增強活性氧相關酶的活性，減少或者延緩寒冷脅迫對番茄的傷害。方彥等對黑油菜在低溫脅迫下根部代謝組進行分析，表明黑油菜在低溫條件下通過調節糖、氨基酸和磷脂類代謝水平以適應逆境。朱建峰等研究了鹽脅迫下白榆種子萌發期的代謝組成分變化，暗示油菜素內酯和精胺可能是白榆種子萌發期適應鹽脅迫的關鍵因子。牟丹等對高加索三葉草響應不同降溫模式的代謝組成分進行測定，發現y-氨基丁酸、亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、檸檬酸、矢車菊素和木犀草素含量均顯著上升，提出上述物質可能是高加索三葉草適應低溫脅迫的主要組分。

近年來，關于桃抗寒性形成的生理生化機制有了一定的研究，但大部分都集中在抗寒基因的發掘上。宋艷波等對桃PpCBF2基因進行了克隆，發現早紅霞和大久保的Pp CBF2基因受低溫誘導，且品種間的表達差異與品種抗寒性相關。申晴等克隆了桃PpMYB3基因，發現該基因主要在韌皮部表達，且抗寒性強的桃品種PpMYB3基因表達量隨溫度降低呈下降趨勢，而在抗寒性弱的品種中該基因的表達則隨溫度降低呈上升趨勢，暗示PpMYB3在桃抗寒性形成中起到負調控作用。左波等對桃PpRBD2基因進行克隆和表達分析，發現在不同時間的低溫脅迫下，PpRBD2基因在抗寒品種中的表達量比不抗寒品種更高，表明Pp RBD2基因的表達量與桃抗寒性呈正相關。

而在抗寒相關的代謝物研究方面，關于脯氨酸生物合成途徑已經比較清楚。谷氨酸途徑是高等植物合成脯氨酸的重要方式，首先，谷氨酸（Glu）在△¹-二氫吡咯-5-羧酸合成酶（P5C synthetase，P5CS）催化下生成谷氨酸半醛（GSA），GSA自動環化為△¹-二氫吡咯-5-羧酸（A1-pyrroline-5-carboxyl-ate，P5C），隨后P5C又在A¹-=氫吡咯-5-羧酸還原酶（P5Creductase，P5CR）的催化下生成L-脯氨酸。因此，P5CS和P5CR是谷氨酸途徑中的2個關鍵酶，分別催化脯氨酸生物合成的第一步和最后一步反應，其中第一步反應為限速反應。

為揭示在桃上是否存在除脯氨酸之外的低溫響應相關代謝物質，筆者在本研究中采用基于超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）的廣泛靶向代謝組學技術，通過聚類分析（hierarchical cluster anal-ysis，HCA）、差異倍數法（fold change，FC）等統計分析方法，鑒定低溫脅迫處理條件下桃芽中的顯著差異代謝物質，并驗證關鍵代謝物與桃芽抗寒性的關系。研究有利于闡明桃抗寒的生理生化基礎，為后續開發相應的調控措施提供理論支撐。

1材料和方法

1.1材料

用于抗寒處理以鑒定差異代謝物所用的桃品種為中農金輝，試驗材料取自中國農業科學院鄭州果樹研究所桃圃，樹齡6a（年），取樣時間為2021年7月，所選試材為樹冠外圍中上部的1年生幼嫩枝條。

驗證差異代謝物與抗寒性關系的材料為經筆者所在實驗室組培快繁的2年生桃抗砧1號盆栽桃苗。

1.2低溫脅迫處理方法

剪取樹冠外圍中上部幼嫩枝條，保鮮膜封住枝條以避免水分散失，將枝條帶回實驗室后剪成30 cm左右的枝段，保鮮膜包裹后放入冰箱開始脅迫處理，一次性放入試驗所需的所有枝條，依據前人研究確定脅迫溫度為-14℃，并記錄處理開始時間，分別在處理時間達到0、24、72h時取出部分枝段，在枝段未解凍狀態下去掉枝段上的葉子，選擇枝段上大小一致且未受機械損傷的桃芽，用鑷子與解剖針剝出后迅速放入液氮中，稱量剝出桃芽的總質量，達到代謝物測定所需要的質量后停止取樣，將所取桃芽平均分成2份，作為2個重復，用于代謝物測定。

1.3體外噴施藥劑對抗寒性的影響

首先，選擇氨基嘌呤、腺苷、黃嘌呤核苷以及DL-同型半胱氨酸標準品，用蒸餾水配制不同濃度的溶液，濃度參考前人研究，其中氨基嘌呤、腺苷和黃嘌呤核苷的質量濃度均為50mg·L^-1，D/-同型半胱氨酸質量濃度5mg·L^-1，標準品氨基嘌呤純度為98%，腺苷純度≥99%，黃嘌呤核苷純度≥99%，DL-同型半胱氨酸純度≥90%，均購自源葉生物科技有限公司（上海）。

取15株生長一致的中桃抗砧1號在光照培養箱中進行低溫處理，為保證桃苗處于存活狀態，選擇-4℃進行低溫處理，光照培養箱設定光照時間16 h，黑暗時間8h。然后，分別用配制的不同標準品溶液進行噴施，每株每次噴施用量大約15 mL，每24 h噴施處理1次。最后，測定處理后1、3、7d的葉片中脯氨酸含量，脯氨酸測定方法按照脯氨酸（Pro）含量檢測試劑盒（索萊寶生物科技有限公司，北京）說明書操作。

1.4代謝物提取流程

樣品放置于凍干機（Scientz-100F，新芝，寧波）中進行真空冷凍干燥，研磨儀（MM 400，Retsch，Germany）30 Hz研磨90 s成粉末。稱取100 mg，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中，每30 min渦旋1次，每次持續30 s，共渦旋6次，樣品置于4℃冰箱過夜。12000r·min^-1離心10 min后吸取上清液，用微孔濾膜（0.22μm）過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.5色譜和質譜采集條件

數據采集系統主要包括超高效液相色譜和串聯質譜。液相條件：①色譜柱：Agilent SB-C18 1.8μm，2.1 mm×100 mm;②流動相：A相為超純水（含0.1%的甲酸），B相為乙腈（含0.1%的甲酸）；③洗脫梯度：0.0 minB相比例為5%；9.0 min內B相比例線性增加到95%，并維持1min; 10.0～11.1 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min;流速0.35 mL·mi11^-1；柱溫40℃；進樣量4μL。質譜所用的系統為AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS，采用三重四極桿線性離子阱。ESI源操作參數如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550℃；離子噴霧電壓5500V（正離子模式）/-4500V（負離子模式）；離子源氣體Ⅰ、氣體Ⅱ和簾氣分別設置為50、60和25.0 psi，碰撞誘導電離參數設置為高。

1.6代謝物定性與定量

基于自建的MWDB （metware database）數據庫，根據二級譜信息進行物質定性，分析時去除了同位素、含K⁺離子、Na⁺離子、NH₄⁺離子的重復信號，以及本身是其他更大分子質量物質碎片離子的重復信號。

代謝物定量是利用三重四級桿質譜的多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）分析完成。MRM模式中，四級桿首先篩選目標物質的前體離子（母離子），排除掉其他分子質量物質對應的離子以初步排除干擾；前體離子經碰撞室誘導電離后斷裂形成很多碎片離子，碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子。獲得不同樣本的特征離子數據后，對所有物質質譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質譜出峰進行積分校正。

1.7關鍵基因的定量表達分析

提取用代謝物溶液噴施處理后的中桃抗砧1號葉片RNA，反轉錄后得到cDNA。選擇1個桃抗寒相關基因Pp CBF2以及1個脯氨酸合成關鍵基因PpP5CS，以cDNA為模板，以PpCBF2- F/R、PpP5CS-F/R為熒光定量引物，以β-actin-F/R為內參引物進行qPCR反應，根據2^-ΔΔCT法計算基因的相對表達量，試驗3次重復，引物序列詳見表1。RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司（北京），反轉錄與SYBR-Green試劑盒購自北京康潤誠業生物科技有限公司（北京），qPCR采用RocheLightCycle480Ⅱ實時熒光定量PCR系統，qPCR反應步驟為：95℃預變性5 min; 95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，40℃保持10 s，45個循環。

1.8數據分析

將原始數據導入代謝組學處理軟件Analyst1.6.3進行處理，包括基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化等。處理后的數據根據差異倍數值（fold change，FC）和顯著性p值進行差異性代謝物的篩選，以｜log：FC｜> 0.6，p-value< 0.05為篩選標準，log₂FC>0.6視為顯著上調代謝物，log₂FC<-0.6視為顯著下調代謝物，其余視為差異不顯著。

2結果與分析

2.1桃芽低溫處理后代謝組成分的類別分析

將桃芽低溫脅迫處理0、1、3d的樣本分別定義為T1、T2、T3，然后將通過UPLC-MS/MS檢測平臺檢出的信號與數據庫進行比對，發現在中農金輝桃芽的3個樣品中共檢測到172種有功能注釋的代謝物，可分為10類（表2），其中氨基酸及其衍生物占比最高，其次是酚酸類、黃酮、有機酸和脂質等。

2.2桃芽低溫處理后代謝組成分的含量分析

分析172種代謝物成分的含量，發現中農金輝桃芽中占比大于1%的主要代謝物有32種（表3），其中氨基酸類衍生物7種、黃酮5種、酚酸類4種、脂質4種、有機酸3種、生物堿2種、核苷酸及其衍生物2種、鞣質1種、其他類4種。水楊酸O-咖啡酸含量最高，達到5.58%，其次是L-天冬酰胺和2，5-二羥基苯甲酸-O-己糖苷含量等。

2.3低溫處理對桃芽代謝物的影響

為進一步分析低溫對桃芽代謝物成分和含量的影響，研究繪制了不同處理間代謝物相對含量的火山圖（圖1）。

在T1 vs T2與T1 vs T3中，共篩選到32種差異代謝物，其中8種下調和24種上調（表4）。

2.4差異代謝物聚類分析

采用聚類分析方法，進一步分析3個處理時間桃芽中代謝物的整體變化趨勢（圖2）。由圖2可以看出，差異代謝物在芽中的含量區分明顯，種類最多的為脂質，其次是氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、生物堿等。其中，長壽花糖苷與煙酸2種代謝物含量整體表現先下調再上調，但前期下調不顯著（長壽花糖苷p-value=0.8>0.05，煙酸p-value=0.73>0.05）；同樣的，L-精氨酸含量整體表現先下調再上調，但后期上調不顯著（p-value=0.13>0.05）：DL-同型半胱氨酸、苜蓿素這2種代謝物含量整體表現上調，但前期變化不顯著（DL-同型半胱氨酸p—value=0.19>0.05，苜蓿素p-value=0.07 >0.05）。

2.5噴施特定代謝物對桃抗寒性的影響

為證實差異代謝物的功能，從32種差異代謝物中，選擇經低溫處理1d與3d后，與對照組（0d）相比表現上調的4種代謝物，配制成標準品溶液并噴施桃幼苗，測定低溫處理后對照組與處理組葉片的脯氨酸含量，以探討特定代謝物對桃抗寒性的調控作用（圖3）。結果表明，低溫脅迫處理后，不同代謝物處理的脯氨酸含量均上升，處理后第3天出現峰值，在第7天則有所下降。噴施清水的對照組在脅迫前后脯氨酸含量上升幅度較小，第3天脯氨酸含量僅為Od的2倍；而噴施其他物質如黃嘌呤核苷的第3天脯氨酸含量為Od的6倍。

2.6噴施特定代謝物對桃抗寒相關基因表達量的影響

為進一步從轉錄水平驗證代謝物噴施對桃幼苗抗寒性的影響，筆者選擇了1個低溫響應相關基因PpCBF2以及1個脯氨酸合成關鍵基因PpP5CS，測定其在低溫處理后的相對表達量。

由圖4-A可見，噴施清水的對照組，PpCBF2表達量隨低溫脅迫時間延長逐漸上升，在第7天達到最高值，為Od的1246倍；經DL-同型半胱氨酸與黃嘌呤核苷處理后的幼苗，其葉片中PpCBF2的表達量同樣隨脅迫時間延長逐漸增加，但峰值出現在處理后第3天，隨后表達量有所下降，第3天表達量分別達到Od的13810與3650倍；經氨基嘌呤與腺苷處理后的幼苗，其葉片中PpCBF2的表達量峰值出現在第1天，分別為Od的1464與1169倍，自第3天開始逐漸下降。該結果表明，桃幼苗確實受到了低溫脅迫，但不同代謝物處理可能影響了桃幼苗的低溫響應能力。

由圖4-B可見，噴施清水、腺苷、DL-同型半胱氨酸與氨基嘌呤處理的樣品中PpP5CS表達量整體隨脅迫時間延長而上升，在第7天達到峰值，其峰值分別為0d的2、1.7、2.8與2.3倍。而經黃嘌呤核苷處理的幼苗，其葉片中PpP5CS表達量在第3天達到峰值，其峰值達到Od的4倍。噴施黃嘌呤核苷后，脯氨酸合成相關基因表達最為明顯，與該處理的葉片

3討論

筆者在本研究中利用廣泛靶向代謝組檢測方法，一共檢測到172種代謝物，其中占比大于1%的主要代謝物有32種，水楊酸O-咖啡酸的含量最高，達到5.58%，其次是L-天冬酰胺。

水楊酸作為一種廣泛存在于植物體內的酚類激素，除了參與植物生長發育的多個過程以外，還能夠提高植物非生物抗逆性，在植物對環境脅迫響應中發揮著重要作用。水楊酸可以通過調節活性氧及抗氧化酶活性來影響植物抗逆性，且水楊酸的作用具有雙重性，即低濃度的水楊酸能夠減輕幼苗所受氧化傷害的程度；高濃度則加重。此外，谷曉勇等和Wildermuth等認為植物體內水楊酸濃度的變化是水楊酸響應環境脅迫的重要途徑，在逆境條件下，水楊酸生物合成途徑中的基因被誘導表達，促進水楊酸積累進而增強植物抗逆性。結合前人研究結果，筆者推測當植物遭遇冷害時，體內的水楊酸信號通路被激活，從而誘導抗寒相關基因表達、改變植物體內水楊酸濃度，以及其他諸如抗氧化酶、蛋白質以及植物激素等滲透調節物質的變化，進而提高植物抗寒性。

植物在應對非生物脅迫和病菌侵害時，其體內的天冬酰胺合成酶基因表達量會提高，從而積累大量天冬酰胺以抵御逆境，天冬酰胺合成酶基因也因此被認為是潛在的抗逆基因。張曉磊在對小黑麥天冬酰胺合成酶基因克隆及功能驗證研究中發現，轉天冬酰胺合成酶基因的擬南芥和煙草植株，其耐逆性能得到提高，表明該基因具有增強植物耐逆性的功能。因此，天冬酰胺作為植物體內運輸新合成氮的重要載體，在植物體遭遇逆境脅迫時，其含量的積累有助于生物體抵御逆境。

在本實驗篩選到的4種差異代謝物中，黃嘌呤核苷、腺苷、氨基嘌呤均屬于核苷酸及其衍生物，生產上對該類物質的應用也有較長的歷史，研究表明，核苷酸類物質能夠促進糧食作物對磷肥、鉀肥的吸收，增加瓜果蔬菜的果實干質量、維生素C、總糖含量，改善果實外觀和品質等，增加菌類產品的氨基酸含量，提升菌類營養價值，增加產量和可溶性固形物含量。此外，核苷酸在農作物上也被發現可以作為一種植物生長調節劑，通過促進植物根系生長、提高根系吸收能力來增強植株抗逆性。DL-同型半胱氨酸屬于氨基酸及其衍生物，對于該類物質在農業生產中的應用也有研究，如高活性的酶解左旋游離氨基酸能夠提高植物抗逆性、改善光合作用等。本研究中鑒定出的DL-同型半胱氨酸與絲氨酸在胱硫鍵-β合成酶作用下合成半胱氨酸，而半胱氨酸作為一種天然的抗褐變劑，能夠維持細胞功能，增強抗氧化酶活性、減輕膜脂過氧化、保證細胞膜的完整性。

綜上，各類大量代謝物與差異代謝物，在植物體響應冷害過程中，參與不同的代謝途徑，或作為滲透調節物質改變細胞液濃度，降低細胞冰點，以抵御低溫傷害；或參與活性氧清除系統反應，清除代謝過程中產生的多余活性氧自由基，減少由于膜脂過氧化作用而對細胞造成的傷害。因此，了解各類代謝物的功能及其參與的生理生化反應，對提高植物應對逆境的能力具有重要作用。

4結論

筆者基于廣泛靶向代謝組學技術鑒定了桃芽響應低溫處理的相關代謝物，并選擇部分代謝物進行了體外噴施驗證。結果表明，低溫誘導了低溫響應基因PpCBF2的表達，證實了低溫處理的可靠性。與清水對照相比，外源噴施標準品溶液處理的桃苗葉片中脯氨酸含量顯著上升；同時，脯氨酸合成關鍵基因PpP5CS的表達與其表型變化具有相同趨勢，進一步表明黃嘌呤核苷、腺苷、DL-同型半胱氨酸以及氨基嘌呤可增強植株抗寒性。