血清基質金屬蛋白酶-13聯合血小板因子-4與miR-29檢測在多發性骨髓瘤中的臨床價值*

孔繁林，吳建偉，侯學伶，路 博，劉振騰，米盼盼，朱 軍，樊國峰△

河北中石油中心醫院：1.骨科；2.檢驗科，河北廊坊 065000

多發性骨髓瘤(MM)為惡性漿細胞病，其腫瘤的細胞來自于骨髓中內的漿細胞。MM的特點是骨髓漿細胞發生異常增生并伴隨著輕鏈或單克隆的免疫球蛋白過量的產生。然而，因早期MM患者的癥狀并不典型，而腎病、風濕或淋巴瘤等疾病又可造成反應性漿細胞的增加，干擾了臨床診斷[1-2]；其次，目前診斷MM主要依靠骨髓細胞學相關的檢查，但病灶呈局灶性分布，單部位骨髓穿刺常常不能明確診斷，另外，骨髓穿刺操作的有創性導致部分患者并不太愿意接受檢查而錯過了早期的臨床診斷。因此，臨床上急需找尋一類特異度、靈敏度更高的診斷標志物，以提高MM患者的診療質量。基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)是將細胞外基質水解的一類蛋白水解酶，用于調節腫瘤細胞的生長及轉移過程。血小板第4因子(PF4)是由血小板α顆粒合成的一種特異性蛋白質。近年發現，PF4通過抑制人血管內皮祖細胞的生長和遷移，進而在MM發病過程中起到抑制血管新生作用，對MM起抑制作用[3]。微小RNA(miRNA)是一類長度約為22核苷酸的非編碼RNA，通過調控表觀遺傳參與人體的各類生理病理，并關系到腫瘤發展及轉移等。近年來研究發現miR-29與MM的發生、發展密切相關[4]。本研究旨在探討血清MMP-13、PF4和miR-29在MM鑒別診斷和療效評估中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年2月至2020年1月于本院確診并治療的MM患者80例納入研究作為病例組，所有患者的診斷均符合《中國多發性骨髓瘤診治指南(2017年修訂)》[5]。患者治療方法：地塞米松+硼替佐米+環磷酰胺治療，28 d為1個治療周期，每例患者經4個治療周期，患者每隔1周到血液內科門診進行隨訪。根據歐洲血液和骨髓移植組對患者的療效評價[6]，分為完全緩解(cCR)、接近完全緩解(nCR)、部分緩解(PR)、微小緩解(MR)、無變化(NC)、病情進展(PD)等幾個等級，并根據患者治療后的具體療效，將療效并未達到PR等級的患者納入難治組(32例)，療效到達了PR或者以上的患者納入緩解組(48例)。同期選取本院體檢健康者80例作為對照組。納入者均意識清楚，能夠正常的實施語言表達，可以和調查人員實施正常的溝通交流。排除標準：(1)入院前在其他的醫院實施免疫治療或者放化療者；(2)急慢性感染、甲狀腺疾病、其他臟器腫瘤者。本研究的開展經醫院倫理委員會批準。納入研究者均自愿參加本研究。

1.2方法

1.2.1臨床資料與標本的采集 由研究人員將患者的性別、年齡、體質量指數(BMI)等基本信息進行記錄，BMI=體重/身高2(kg/m2)。采用促凝血管將禁食10 h以上的MM患者治療前、4個治療周期結束后和入院體檢健康者的靜脈血標本5 mL收集起來。收集的標本在1 h內于4 ℃、3 500×g離心10 min，收集上層血清，并放在-80 ℃冰箱中保存待測。

1.2.2血清MMP-13與PF4水平的檢測 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清MMP-13和PF4水平，試劑盒購自南京基蛋生物科技有限公司，嚴格按試劑盒內說明書中的步驟進行操作。血清MMP-13和PF4檢測的批內和批間變異系數均小于5%，提示此次實驗操作具有很好的精確度和重復性。

1.2.3血清miR-29表達水平的檢測 血清總RNA的提取依據血液RNA提起試劑盒(購自Bioteke公司)內的說明書步驟實施。取上述方式提取的RNA，使用反轉錄試劑盒(購自Takara公司)將其反轉錄成cDNA，之后采用實時熒光定量PCR(qPCR)，依據SYBR GREEN試劑盒中的說明書進行操作。反應條件：95 ℃條件下進行5 min變性；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環45次。各組均設置檢測復孔3個。內參基因采用GAPDH。引物序列如下，miR-29，F：5′-AATCCTTTATGTGACCAGAA-3′，R：5′-CTCCTTTGTTGAATCCAT-3′；GAPDH,F：5′-AGA AGG CTGGGGCTCATTTG-3′，R：5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。采用2-ΔΔCt法對miR-29的相對表達水平進行計算。

2 結 果

2.1兩組臨床基本信息及血清MMP-13、PF4和miR-29水平比較 病例組血清MMP-13和miR-29水平高于對照組，而病例組血清PF4水平低于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組臨床基本信息及血清MMP-13、PF4和miR-29水平比較或n(%)]

2.2MM患者化療前后血清MMP-13、PF4和miR-29水平比較 與治療前相比，治療后患者PF4水平增高，MMP-13和miR-29水平降低(P<0.05)。治療前，緩解組患者血清MMP-13和miR-29水平均低于難治組，緩解組患者血清PF4水平高于難治組，差異均有統計學意義(P<0.05)；緩解組治療后血清MMP-13和miR-29水平較治療前均降低，緩解組治療后血清PF4水平較治療前增高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 80例MM患者化療前后血清MMP-13、PF4、miR-29水平比較

2.3血清MMP-13、PF4和miR-29在MM鑒別診斷和療效評估的ROC分析 ROC曲線分析顯示：血清miR-29區分MM患者與健康者的AUC為0.913(95%CI：0.855～0.971，P<0.001)，診斷界值為12.4，靈敏度為84.1%，特異度為90.8%；血清MMP-13區分MM患者與健康者的AUC為0.802(95%CI：0.742～0.863，P<0.001)，診斷界值為46.6 pg/mL，靈敏度為81.2%，特異度為62.2%。血清PF4區分MM患者與健康者的AUC為0.602(95%CI：0.542～0.663，P=0.005)，診斷界值為22.6 μg/L，靈敏度為61.2%，特異度為52.2%。血清MMP-13、PF4和miR-29聯合檢測用于區分MM患者與健康者的AUC為0.924(95%CI：0.868～0.979，P<0.001)，靈敏度為82.5%，特異度為94.6%。見圖1。

注：A為MMP-13、PF4和miR-29單項用于診斷MM的ROC曲線；B為MMP-13、PF4和miR-29聯合檢測用于診斷MM的ROC曲線；C為MMP-13、PF4和miR-29單項用于區分緩解組與難治組的ROC曲線；D為聯合檢測MMP-13、PF4和miR-29用于區分緩解組與難治組的ROC曲線。

血清miR-29區分緩解組與難治組的AUC為0.874(95%CI：0.773～0.965，P<0.001)，診斷界值為16.2，靈敏度為78.3%，特異度為81.7%；血清MMP-13區分緩解組與難治組的AUC為0.824(95%CI：0.781～0.866，P<0.001)，診斷界值為60.6 pg/mL，靈敏度為83.8%，特異度為60.3%；血清PF4區分緩解組與難治組的AUC為0.534(95%CI：0.481～0.606，P=0.012)，診斷界值為18.6 μg/L，靈敏度為63.8%，特異度為50.3%；聯合檢測血清MMP-13、PF4和miR-29用于區分緩解組與難治組的AUC為0.889(95%CI：0.822～0.971，P<0.001)，靈敏度90.7%，特異度77.4%。見圖1。

3 討 論

JIIAN等[7]通過對淋巴瘤細胞系中MMP-13基因的檢測，發現與正常淋巴細胞株相比MMP-13基因顯著上調，且與腫瘤調控因子--信號轉導和轉錄激活因子3的活性呈正相關。PF4是近年發現的重要的抑癌基因。LIANG等[8]指出，將過表達PF4基因的慢病毒轉染接受異種骨髓移植的骨髓瘤小鼠后，免疫染色顯示骨髓瘤細胞凋亡和血管生成受到抑制，該實驗在骨髓瘤小鼠模型中證實了PF4的腫瘤生長抑制作用。miR-29是一種新型的基因調控因子，能在轉錄后水平抑制靶基因的表達或蛋白質翻譯。KOLLINEROVA等[9]通過體外培養MM細胞株，觀察到上調miR-29可顯著降低MM細胞株的增殖能力與遷移能力。

本研究發現，MM患者血清MMP-13與miR-29水平均顯著高于對照組(P<0.05)，而PF4水平顯著低于對照組(P<0.05)，這一結果與前期有關MM的體內和機制研究相符合[3,8-9]，提示MM患者體內MMP-13、miR-29與PF4的異常表達可能參與MM疾病進程。在評估患者治療療效時，本研究結果顯示：治療前，緩解組患者血清MMP-13和miR-29水平均低于難治組(P<0.05)，緩解組患者血清PF4水平高于難治組(P<0.05)。出現這一結果表明血清MMP-13、miR-29與PF4這3個指標在MM病情更加兇險的患者中變化更為顯著，在提示患者預后更差方面具有較高的價值。緩解組治療后血清MMP-13和miR-29水平較治療前均降低，緩解組治療后血清PF4水平較治療前增高，這一結果提示血清MMP-13、miR-29與PF4水平在MM患者接受治療并取得良好療效時會有所好轉，提示患者預后較好。值得注意的是，難治組患者治療前與治療后血清MMP-13、PF4和miR-29水平的差異均無統計學意義(P>0.05)，出現這一結果的原因可能為難治組MM患者在經過4個周期化療后病情并為得到有效控制，這一結果也進一步提示血清MMP-13、PF4和miR-29在輔助評估患者療效中具有一定價值。ROC曲線分析顯示：血清MMP-13、PF4和miR-29聯合檢測用于區分MM患者及其療效的靈敏度、特異度均高于單項診斷，提示三者聯合診斷MM及用于療效評估的效果較好。然而，本研究仍存在下面的不足：(1)本研究所納入的患者全部為本院患者，這可能會使研究結果產生某些偏倚，今后需采用多中心的隊列研究進一步分析結果；(2)本研究納入80例MM患者，納入的病例數并不多，后期需要擴大樣本量來進一步證實血清MMP-13、PF4和miR-29檢測對MM患者的臨床價值。

綜上所述，血清MMP-13、PF4和miR-29對MM診斷及療效評估具有潛在的價值，有望為MM的診療提供新的途徑與思路。