微生物共利用木糖和葡萄糖生產化學品研究進展

王川東，張君奇，劉丁源，馬媛媛，李鋒，宋浩

（1 天津大學化工學院，天津 300072；2 天津大學合成生物學前沿科學中心和系統生物工程教育部重點實驗室，天津 300072；3 天津大學（青島）海洋工程研究院有限公司，山東 青島 266237；4 天津大學海洋科學與技術學院，天津 300072）

木質纖維素生物質主要由纖維素、半纖維素和木質素構成，常見于農作物秸稈、雜草、木材廢料及其他固體廢棄物中，是儲量豐富、廉價易得的可再生資源[1?2]。植物光合作用產生的生物質大部分為木質纖維素類，其資源化開發有“不與人爭糧，不與糧爭地”的優勢，可用于工業生產醇類、微生物油脂和有機酸等化學品。與纖維素水解生成的葡萄糖相比，半纖維素水解產生的木糖更難被微生物利用，例如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）能很容易地利用纖維素水解生成的葡萄糖發酵產乙醇，但難以利用木糖[3?4]，這極大地限制了木質纖維素資源的利用。因此，構建木糖?葡萄糖共利用工程菌株是解決該問題的有效方法之一。相比原核生物，真核生物戊糖代謝途徑涉及復雜的氧化還原反應，需要更多的酶及輔因子參與，使得在酵母中構建高效戊糖代謝途徑難度較大[5]。因此，木糖及葡萄糖共利用宿主菌的開發有待進一步進行。目前，除酵母外，木糖?葡萄糖共利用菌株的開發已經在酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）、大腸桿菌（Escherichia coli）等多種微生物中被報道[6?8]。本文主要綜述了近年來木糖及葡萄糖共利用工程菌株的構建策略及在醇類、微生物油脂、γ?聚谷氨酸和有機酸合成領域的進展，總結了限制木糖?葡萄糖共利用效率的主要瓶頸及其解決方法，為提高木質纖維素生物質資源化利用和可再生能源化學品的產業化合成提供參考。

1 天然微生物木糖及葡萄糖共利用現狀

自研究發現細菌、酵母菌能發酵木糖生產乙醇以來，現已知有兩百多種微生物可以代謝木糖，包括酵母菌、新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）、假單孢桿菌（Pseudomonas）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）及大腸桿菌等。其中既能利用木糖又能利用葡萄糖的酵母菌是研究重點，主要包括樹干畢赤酵母（Schefersomyces stipites）、嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）、馬爾薩尼克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、休哈塔假絲酵母（Candida shehatae）、產朊假絲酵母（Candida utilis）及絲狀假絲酵母（Candida lusitaniae）等[9?12]。

天然微生物的底物偏好性會影響木糖?葡萄糖共利用發酵性能。Saravanan等[13]對比了漢遜達布氏酵母 （Dabaryomyces hansenii var hansenii）、吉利蒙假絲酵母（Candida guillermondii）和嗜鞣管囊酵母（P.tannophilus）以玉米芯、稻草和小麥秸稈為原料生產木糖醇的動力學過程。利用Logistic 細胞生長模型、底物利用動力學模型及Luedeking?Piret產物生成模型分析，發現P.tannophilus發酵玉米芯水解液時，木糖醇產量更高，說明木糖醇產量受底物利用效率影響。不同來源的木質纖維素水解液中糖含量的差異是影響底物利用效率的關鍵，湯斌等[14]發現C.shehataeTZ8?13 利用木糖及葡萄糖共發酵產乙醇時，葡萄糖被優先利用，且木糖和葡萄糖質量比為1∶1時乙醇產量較高。Agbogbo 等[15]發現樹干畢赤酵母（S.stipites）的葡萄糖利用也優先于木糖，并且葡萄糖大部分供給細胞生長，木糖則主要用于產物合成。該研究表明，水解液中混糖比例的不同會影響底物利用效率及乙醇產量，因此水解液的高效利用需要底物適應能力更強的菌株。

研究表明，S.stipites不僅可以代謝木糖和葡萄糖，還能代謝甘露糖、半乳糖、纖維二糖、甘露聚糖及木聚糖低聚物等[16?19]，工業應用價值較高。但是，S.stipites對乙醇、弱酸及糠醛等抑制劑耐受度低，限制了其發酵性能，采取適當的原料預處理和脫毒方法有助于促進水解液糖化和去除抑制劑[20?21]。例如，利用稀硫酸處理糖化后的玉米秸稈水解液，補加氫氧化銨中和水解液中的酸后，使得乙醇轉化率從0.32g/g 提高至0.44g/g（乙醇/木糖和葡萄糖）[22]。但是，能高效共利用木糖及葡萄糖發酵制備化學品的天然菌株較少，且普遍存在底物偏好性強、碳分解代謝物阻遏（carbon catabolite repression, CCR）、產量低等問題[14?15,18]，因此，構建底物譜更廣、混合糖利用率更高的木糖?葡萄糖共利用工程菌株是產業化應用的必然要求。

2 木糖及葡萄糖代謝途徑簡介

2.1 木糖代謝途徑

研究發現，具備木糖代謝能力的微生物體內一般有4種木糖代謝途徑，包括木糖氧化還原酶途徑（XR 途徑）、異構酶途徑（XI 途徑）、Weimberg 途徑（WBG途徑）和Dahms途徑[23?26]，見圖1。此外，近期在E. coli中建立了木糖?1?磷酸酯（X?1?P）及核糖?1?磷酸酯（R?1?P）途徑，實現了二碳化合物的合成。其中，原核和真核生物中木糖利用能力較強的菌株E.coli[27]和S.stipites[18]分別借助XI 和XR途徑代謝木糖。在XI途徑中，木糖首先被XylA基因編碼的木糖異構酶（xylose isomerase, XI）轉化為木酮糖，隨后被XylB編碼的木酮糖激酶（xylulokinase, XK）磷酸化，產生5?磷酸木酮糖進入磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway, PPP）[23]。

類似于XI 途徑，在XR 途徑中，木糖先被NAD(P)H 依賴的木糖還原酶（xylose reductase, XR,Xyl1基因編碼）轉化為木糖醇，進一步在木糖醇脫氫酶（xylose dehydrogenase, XDH,Xyl2 基因編碼）作用下轉化為木酮糖，后被XK（Xks1 基因編碼）催化生成5?磷酸木酮糖，進入PPP，見圖1。XR及XI 途徑是構建木糖利用工程菌株的常用途徑。例如，Sekar 等[28]利用定向進化激活了電活性微生物希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）的木糖代謝能力。Li 等[29]采用合成生物學策略，在希瓦氏菌（S.oneidensis）中異源過表達XR 及XI 途徑相關基因，獲得了能夠利用木糖為碳源生長產電的工程希瓦氏菌株，克服了S.oneidensis不能利用五碳糖的限制。

圖1 木糖及葡萄糖共利用代謝途徑與發酵產品

相比于前兩種代謝途徑，來自于新月柄桿菌（C.crescentus）的WBG途徑各反應步驟有較大的熱力學標準吉布斯自由能負向差值（表1），使得各步反應更容易自發進行；且終產物為α?酮戊二酸（AKG），可以繞過PPP 直接進入三羧酸循環（TCA），代謝流程相對較短；此外，該途徑不產生二氧化碳，沒有碳損失[30?32]。WBG 途徑中D?木糖經五步酶促反應被氧化成AKG（圖1），D?木糖首先在木糖脫氫酶（CcXylB基因編碼）的作用下被氧化成D?木糖?γ?內酯，然后在基因XylC編碼的D?木糖?γ?內酯酶（xylonolactonase, XLA）催化下轉化為中間體D?木糖酸鹽，進而在D?木糖酸脫水酶（D?xylonate dehydratase, XAD,XylD基因編碼）和2?酮?3?脫氧?D?木糖酸脫水酶（KDX dehydratase,KDXD,XylX基因編碼）參與下進行兩次脫水反應，產生2?酮?3?脫氧?D?木糖酸（2?keto?3?deoxy?D?xylonate, KDX），之后生成α?酮戊二酸半醛（α?ketoglutarate semialdehyde, KGSA）。最后，被α?酮戊二酸半醛脫氫酶（KGSA dehydrogenase, KGSADH,CcXylA基因編碼）以NAD(P)+依賴的方式氧化成AKG，進入TCA[25,30?32]。因此，碳流進入細胞中樞代謝的節點不同于XI 和XR 途徑。目前，在枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、E.coli、惡臭假單孢桿菌（Pseudomonas putida）和谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）等宿主菌中構建該途徑，獲得了D?1, 2, 4?丁三醇（BT）、γ?聚谷氨酸（γ?PGA）、綠膿菌素、鼠李糖脂、乙醇酸鹽、木糖酸鹽、AKG、L?鳥氨酸等產品[31?37]。

表1 Weimberg途徑標準吉布斯自由能變化[30]

發現于Pseudomonas的Dahms途徑與WBG途徑前半部分相同，不同的是反應進行到KDX 之后轉化為乙醇醛和丙酮酸，見圖1。

X?1?P 和R?1?P 途徑能在一定程度上繞過復雜的內源PPP，直接裂解木糖[38?39]，具有合成二碳化合物的天然優勢[40?41]。兩條途徑中木糖均先被異構化為木酮糖，X?1?P途徑中木酮糖被磷酸化為木酮糖?1?磷酸，之后經醛解生成乙醇醛和二羥丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate, DHAP）。不同的是R?1?P 途徑中木酮糖差向異構化形成核糖，再進行磷酸化和醛解轉化為乙醇醛和DHAP。

2.2 葡萄糖代謝途徑

葡萄糖作為大多數生物的主要碳源，在微生物體內的代謝途徑主要有EMP 途徑（Embden?Meyerhof?Parnas pathway, EMP, 又稱糖酵解）、HMP途徑（hexose monophophate pathway, HMP），ED 途徑（entner?doudoroff pathway, ED） 及PK 途 徑（phospholytic ketase pathway, PK）[42]，見圖1。其中EMP 途徑是微生物中普遍存在的代謝途徑。在無氧條件下葡萄糖被分解為丙酮酸，在此期間每分解1分子葡萄糖產生2分子丙酮酸及2分子ATP。

在微生物HMP 途徑中，葡萄糖經過幾步氧化反應產生核酮糖?5?磷酸和CO2，核酮糖?5?磷酸經同分異構化或差向異構化產生核糖?5?磷酸或木酮糖?5?磷酸，在無氧情況下發生碳架重排，產生己糖磷酸和丙糖磷酸。該途徑是許多微生物木糖代謝的必經之路。

ED 途徑是一種EMP 途徑的替代途徑，在研究Pseudomonas時發現，存在于一些缺乏完整EMP 途徑的微生物中。ED 途徑為微生物特有，海洋菌中較多[43]，在革蘭氏陰性菌中分布較廣，如嗜糖假單孢菌（Ps.saccharophila）、銅綠假單孢菌（Ps.aeruginosa）、林氏假單孢菌（Ps.lindneri）、熒光假單孢菌（Ps.fluorescens）、真養產堿菌（Alcaligenes eutrophus）、運動發酵單孢菌（Zymomonas mobilis）等。該途徑只需四步反應即可快速代謝葡萄糖，獲得由EMP 途徑經十步反應才能形成的丙酮酸，但產能水平較低，1 分子葡萄糖分解為2 分子丙酮酸時，只凈得1分子ATP和1分子NADH[42?43]。在葡萄糖促進因子（glf基因編碼）協助下葡萄糖被轉運至胞內，在葡萄糖激酶（glk基因編碼）催化下被氧化成葡萄糖?6?磷酸（G?6P），同時消耗1 分子ATP，然后在葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（Zwf基因編碼）作用下脫氫轉變為葡萄糖?1, 6?二磷酸（1G?6P），1G?6P 被磷酸葡萄糖酸脫水酶（edd基因編碼）催化脫水生成2?酮?3?脫氧?6 磷酸葡萄糖酸（KDPG），進而在KDPG醛縮酶（eda基因編碼）作用下轉化為甘油醛三磷酸和丙酮酸，在有氧條件進入TCA 或進行無氧乙醇發酵，見圖1。ED 途徑代謝流程較少，在微生物宿主中構建更容易，是木糖?葡萄糖共利用工程菌株發酵生產化學品的重要途徑。

磷酸解酮酶途徑是明串珠菌在異型乳酸發酵中分解已糖和戊糖的途徑。該途徑的特征酶是磷酸解酮酶，根據解酮酶的不同，具有磷酸戊糖解酮酶的稱為PK 途徑，具有磷酸己糖解酮酶的稱為HK途徑。

2.3 木糖及葡萄糖共利用代謝途徑

構建木糖及葡萄糖共利用工程菌株是提高木質纖維素原料資源化利用效率的重要方法，可用于醇、油脂和有機酸等多種化學品的生物合成，見圖1。EMP 或ED 途徑是基因工程菌株構建葡萄糖代謝模塊的常用途徑，而木糖XR、XI及WBG途徑則常被用來與葡萄糖代謝途徑組合，構建木糖?葡萄糖共利用工程菌株。野生型酵母可以利用葡萄糖，且具有抗逆性強、培養周期短、遺傳操作簡單等優點，可作為底盤菌，用于開發木糖?葡萄糖共利用工程菌株。但是，復雜的氧化還原反應和酶催化系統增加了在酵母中構建異源戊糖或己糖代謝途徑的難度。因此，研究者將木糖?葡萄糖共利用研究擴展至原核及其他真核底盤菌，如E.coli、C.tyrobutyricum、C.glutamicum、B.subtilis、Pseudomonas及少根根霉（Rhizopus arrhizus）等。目前在乙醇、BT、木糖醇及丁醇等醇類合成，乳酸、富馬酸[44]、酮酸[45]、三羥基丙酸（3?HP）[46]、丁酸、檸檬酸等有機酸及γ?PGA、微生物油脂生產中成功應用，見表2。

表2 微生物木糖及葡萄糖共利用生產化學品

續表2

3 木糖?葡萄糖共利用發酵產品合成

3.1 醇類

3.1.1 乙醇

第二代生物乙醇的制備是木質纖維素最具前景的應用領域。酵母菌因細胞壁厚、營養要求低、體積大，在乙醇發酵中更具有優勢[17]。S.cerevisiae和S.stipites因能利用多種碳水化合物發酵產生大量乙醇，且便于遺傳操作、乙醇耐受性強，使其成為極具潛力的乙醇發酵菌株。例如，S.stipites能夠利用多種木質纖維素生產乙醇[64]，S.cerevisiae可以代謝木質纖維素水解液中的多種糖[65]。但S.cerevisiae缺乏木糖利用能力，因此，將木糖代謝途徑引入S.cerevisiae是構建木糖?葡萄糖共利用工程菌的可行方法。Wahlbom 等[66]將來自S.stipitis的Xyl1 基因和里氏木霉（Trichoderma reesei）的Xyl2 基因轉入S.cerevisiae中，經甲基磺酸乙酯誘變篩選后，得到的重組菌可以利用木糖生產少量乙醇，但轉化率僅為0.25g/g（乙醇/木糖），且副產物木糖醇較多。Shi 等[67]將C.shehatae的Xyl1 和Xyl2 基 因 克 隆 到S.cerevisiae中，也存在木糖代謝能力差、副產物較多的問題。為了進一步疏通木糖代謝流、減少副產物，杜仁鵬等[10]選擇發酵性能優良的S.cerevisiaeW5和具有木糖代謝能力的C.shehatae為原始菌株，利用原生質融合和基因工程育種方法，克隆Xyl1基因，提高了葡萄糖及木糖共利用產乙醇的效率。

除了高效的糖代謝途徑外，宿主菌的抗逆性與底物適應性也是影響糖代謝效率的關鍵。K.marxianus因具有耐高溫和可代謝多種底物的優點，有較高的應用價值[68]。洪炯課題組[69?71]首次鑒定了K.marxianus木糖代謝途徑的3 個關鍵酶——木糖脫氫酶、XK 及XDH，推動了K.marxianus在木糖發酵領域的應用。韓錫銅等[72]對比了K.marxianus和S.cerevisiae6525利用不同碳源的情況，篩選出高效的戊糖發酵菌株K.marxianusDL1，相比S.cerevisiae6525，K.marxianusDL1 利用己糖（葡萄糖、甘露糖、半乳糖）和戊糖（木糖、阿拉伯糖）生長更快、乙醇產率更高，在20g/L 糖條件下，K.marxianusDL1 的細胞量及乙醇產量分別是S.cerevisiae6525 的 近2 倍 和1.70 倍。Chupaza 等[11]對 比 了K.marxianus、C.lusitaniae、S.stipitis及S.cerevisiae利用絲狀滿江紅產乙醇的過程。除S.cerevisiae外，其他三種酵母菌都能利用葡萄糖和木糖混合物，且K.marxianus產量及轉化率最高，分別為26.80g/L 和0.43g/g（乙醇產量/初始單糖）。其次是C.lusitaniae產量為23.20g/L，轉化率為0.37g/g。S.stipitis因抗逆性較差，產量及轉化率相對較低，分別為18.20g/L 和0.29g/g。S.cerevisiae只能利用混合物中的葡萄糖，而不能利用木糖，導致乙醇產量最低，僅為13.7g/L，轉化率為0.22g/g。這表明菌株的抗逆性和底物偏好影響著底物利用效率和乙醇產量。

3.1.2 D?1, 2, 4?丁三醇

D?1, 2, 4?丁三醇（BT）是一種具有三個親水羥基的四碳多元醇，是重要的非天然精細化學品，在醫藥、軍工、化妝品等領域應用廣泛[73?76]。相比傳統的化學合成法，生物法反應條件溫和、原料廉價易得、污染小，更符合綠色循環發展的要求。以木糖為底物的四步生化反應是目前最高效的BT 生物合成路線（圖2），研究較多的宿主菌為E.coli、K.pneumoniae、S.cerevisiae、Ps.fragi等。Cao 等[33]在E.coli中共表達來自C.crescentus的CcXylB、XylC基因，E.coli的木糖脫水酶基因YjhG、醛還原酶基因AdhP以及P.putida的2?酮酸脫羧酶基因MdlC，同時敲除XylA和XylB基因以減少木糖分解代謝分流，構建的工程菌株以20g/L 木糖為原料，補料分批發酵BT 產量為3.92g/L，摩爾轉化率為27.7%（BT/木糖）。

圖2 木糖及葡萄糖共利用合成D?1, 2, 4?丁三醇（BT）代謝途徑及其代謝旁路[74?77]

生物法合成BT 存在合成途徑活性較低、副產物多及忽略宿主生長對BT 合成的影響等問題。王金保[73]從合成途徑、輔因子和底物供給三個層面優化，在E.coliMG1655 中表達異源CcXylB和MdlC，敲除XylA和2?酮酸醛縮酶基因YjhH和YagE，適量過表達Zwf，敲除MtfA，失活轉氫酶基因PntAB使輔因子供應平衡，成功構建木糖及葡萄糖共利用工程菌BT?02，BT 產量達7.23g/L，摩爾轉化率為55%（BT/木糖），首次確定了PPP 是為BT 合成供給NADPH的主要途徑。

研究發現，敲除XylA、XylB、YagE及YjhH基因可以削弱木糖分支代謝和副產物途徑，有利于碳流向BT合成途徑[74]。孫雷等[75]篩選獲得了來自乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的2?酮酸脫羧酶（KivD基因編碼），大幅提高了3?脫氧?D?甘油?戊酮糖酸的脫羧反應速率。優化后BT 合成效率雖有提高，但游離質粒誘導表達成本較高，且CCR 使細胞無法同時利用木糖和葡萄糖高效積累目的產物。改造葡萄糖磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system,PTS）可有效緩解CCR 現象[76]。針對上述限制因素，諸葛斌課題組[47,77]以缺失YagE、YjhH的菌株為基礎，通過Red系統將外源基因KivD、CcXylB整合至E.coli基因組的XylA、XylB、ptsHI、ptsG、crr位點，利用廉價的乳糖替代IPTG 誘導表達，構建的工程菌E.coliW031 可利用木糖?葡萄糖混合糖（30g/L 木糖、10g/L 葡萄糖）發酵合成BT，產量為3.90g/L，轉化率為30%，減少了副產物分流和質粒表達成本，為后續規模化應用打下了基礎。

CCR 限制了以E.coli為宿主開發木糖?葡萄糖共利用工程菌合成BT 的研究。K.pneumoniae具有木糖及葡萄糖混合糖利用效果好、CCR 較弱、生長速度快等優點。因此，以K.pneumoniae為宿主構建合成BT 的工程菌，可提高混合糖利用能力。李玉石等[78]將來源于C.crescentus的CcXylB和L.lactis的KivD基因及E.coliW3110 的YjhG基因克隆至K.pneumoniaeZG25，并敲除了XylA減少碳分流，構建的工程菌發現增加葡萄糖能夠提高生物量、減少木糖酸積累，以30g/L 木糖和10g/L 葡萄糖為底物共發酵時，BT 產量達4.52g/L，摩爾轉化率為21%（BT/木糖）。

此外，Yukawa等[79]利用C.crescentus的CcXylB、XylD及L.lactis的KdcA和Adh基因編碼的異源四酶催化反應，由木糖合成BT，將KdcA基因的多個拷貝整合到酵母基因組，增強工程菌性狀穩定性。但是，異源BT合成途徑的引入會導致NADH/NADPH失衡或缺乏，因此過表達S.cerevisiae的Pos5 基因（編碼NADH 激酶）緩解了NADH/NADPH 不平衡問題，用低濃度的葡萄糖和木糖支持NADH 供應，工程菌以木糖為原料，BT 產量為6.60g/L，摩爾轉化率為57%（BT/木糖）。可見，在構建重組高效BT 合成路徑過程中，應重視宿主菌的自身生長和輔酶平衡問題。

3.1.3 木糖醇

木糖醇是一種五碳糖醇，常作為甜味劑，應用于食品、醫藥及化工等領域。生物轉化法能夠克服傳統方法的污染重、資源消耗大的缺點，且反應條件更易控制[48,80]。

CCR作用導致野生型E.coli不能同時利用木糖和葡萄糖[49]，限制了木糖醇產量，但E.coli能利用廉價培養基快速生長、遺傳操作簡單，依然具有研究價值[81]。Kim 等[8]將E.coliMG1655 經適應性進化獲得了缺失阿拉伯糖轉錄調節因子（araC）的突變菌株GX50，其中木糖轉錄激活因子基因XylR、木糖ABC 轉運體基因XylFGH及木糖XI 途徑基因XylA、XylB組成型表達。此外，還獲得了四個額外的突變，包括XylA和乳清酸磷酸核糖基轉移酶pyrE基因間突變、編碼阿拉伯糖和質子轉運體的araE和十一碳烯基?二磷酸酶活性的ybjG基因的錯義突變。最終，菌株GX50能夠利用空棕櫚果束纖維水解物中的木糖和葡萄糖生產木糖醇，轉化率為0.99g/g（木糖醇/木糖）。

相比而言，利用酵母發酵生產木糖醇產量更高，更適合規模化生產。Saravanan 等[13]以玉米芯、稻草和小麥秸稈為原料，對比了D.hansenii、P.tannophilus和C.guillermondii生產木糖醇，發現P.tannophilus利用玉米芯水解液發酵產量較高。為了提高木糖代謝效率和木糖醇產量，張佳[50]過表達來自脈孢霉和S.stipites的Xyl1基因，以及糖轉運相關基因KmFPS、CiGXF1、CiGXS1，同時敲除了K. marxianus自身的Xyl1 和Xyl2 基因，木糖和葡萄糖共利用發酵獲得了312.05g/L 木糖醇。為了進一步 克 服CCR，Zhang 等[51]過 表 達S.cerevisiae的GAL2N376F和粗鏈孢霉的Xyl1 基因，進一步敲除GPD1、KU70、PGI1和Xyl2基因，重構了葡萄糖代謝途徑，阻斷木糖醇下游分解代謝路徑，使得構建的工程菌株K.marxianusYZB194 可同時利用70g/L葡萄糖和140g/L 木糖，產生139.96g/L 木糖醇。當培養溫度調至42℃進行補料分批發酵時，產量進一步提高至203.57g/L，轉化率為0.99g/g（木糖醇/木糖）。該研究表明，采用適當的發酵方式，同時增強工程菌合成基因表達水平、阻斷產物分解代謝路徑，有利于提高木糖醇的產量。

3.2 微生物油脂

微生物油脂的主要成分為C16和C18系脂肪酸，是構成和維持生命活動的基本物質，在食品、能源領域應用廣泛，也被用來制備生物柴油[52,82]。常由酵母、霉菌、細菌和藻類等利用碳水化合物或碳氫化合物合成，產油微生物生成并儲存的油脂一般占其生物總量的20%以上[83?85]，微生物生產油脂的過程分為菌體增長和油脂積累兩個階段[54,86]。微生物生產油脂相比傳統油脂制備方法，具有細胞增殖速度快、生產周期短、原料豐富的優勢。此外，使用融合、誘變、定向進化及合成生物學等技術優選和調控，還可生產特定的功能性油脂[53,82]。在多種產油微生物中，產油酵母產油能力較強（20%～70%）且易于基因改造，比微藻可用碳源更豐富，比霉菌需氧量更少、重金屬離子耐受性更強，比細菌菌體更大、油脂易提取[53,87]。因此，是極具潛力的產油微生物。

產油酵母對木質纖維素水解產物中不同糖分的利用偏好不同，因此，促進各種糖類同時、快速、充分利用對木質纖維素向油脂的轉化至關重要[84]。張艷芬[53]采用兩段發酵模式研究了賴巴克絲孢酵母（Trichosporon laichii）、圓紅冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides）和斯達氏油脂酵母菌（Lipomyces starkeyi）在不同初始碳源濃度下的產油特性，發現在木糖、葡萄糖及混合糖中，經篩選獲得的菌株T. laichiiIEM?14 可利用葡萄糖、木糖及混合糖生產油脂，質量分數最高可達82.74%，比R. toruloides和L.starkeyi具有更好的產油能力，同時發現葡萄糖有助于菌株生長，木糖則更利于油脂積累。R.toruloides以葡萄糖和木糖為基質產油性能相似，均在初始糖濃度為0.40mol/L 時油脂得率最大，分別為21.62%和11.44%。與單糖相比，混合糖更適合R.toruloides生產油脂，在初始糖濃度為2mol/L 時油脂得率達到25.06%。L.starkeyi利用木糖產油效率最高，油脂得率為19.67%，而混合糖則更利于L.starkeyi菌體生長。

Ledesma?Amaro 等[52]利用“開源節流”的策略，將木糖代謝與脂質合成基因組合調控，在解脂椰氏酵母菌（Yarrowia lipolytica）中過表達外源XDH、XR 和內源XK 促進木糖代謝，過表達GPD1基因（編碼甘油三磷酸脫氫酶，參與甘油三酯前體甘油?3?磷酸的形成）和DGA2 基因（編碼酰基轉移酶，促進脂質合成），敲除POX1-6基因（編碼脂酰輔酶A 氧化酶，參與甘油三酯合成的最后一步）阻止過氧化物酶體中的β?氧化，敲除TGL4基因（編碼三酰基甘油脂酶）阻斷脂肪酸從脂質體中釋放，避免脂質降解或利用，進一步提高了木糖利用效率與油脂產量。最終得到的工程菌株能夠利用木糖唯一碳源積累高達細胞干重42%的油脂，是野生型菌株的3.40 倍。該菌株在5L 生物反應器中共利用375g/L 木糖和葡萄糖混合碳源，補料分批發酵生產22.50g/L 油脂，產率為0.06g/g（油脂/糖）。同時，產生67.20g/L 的檸檬酸，產率為0.18g/g（檸檬酸/糖）。此外，該研究還發現木糖與葡萄糖共利用更利于檸檬酸生產，而木糖與甘油共利用有助于提升油脂產量。

孔祥莉等[88]發現L.starkeyi在一定的混合糖比例下，具有同時轉化木糖和葡萄糖積累油脂的能力，以木糖?葡萄糖混合液（質量比1∶2）為碳源時，油脂得率超過50%。此外，Hu等[5]研究皮絲孢酵母AS 2.571（T.cutaneumAS 2.571）時，發現其可以同時代謝葡萄糖和木糖高效生產油脂，在3L攪拌槽生物反應器中，以木糖和葡萄糖混合糖（1∶2）發酵時，油脂含量高達59%，轉化率為0.17g/g（油脂/糖），且沒有二次生長現象和滯后期，在不同混糖比例的搖瓶培養中可以同時完全利用這兩種糖。進一步研究發現，葡萄糖為唯一碳源時，細胞油脂含量、總油脂產量和轉化率分別為52.40%、12g/L和0.20g/g；然而，木糖為唯一碳源時，則分別降低至46.50%、9.90g/L和0.16g/g；葡萄糖?木糖混合糖時，細胞油脂產量略低于葡萄糖，但高于木糖。并且增加底物中木糖的占比，會略微降低油脂的生成，相比而言，使用葡萄糖生產油脂明顯比單獨利用木糖或葡萄糖?木糖混合物作為碳源的轉化率更高。此外，T.cutaneumAS2.571 以玉米秸稈水解液為原料產油脂，質量分數達39.2%，也展現了其有較強的工業應用價值，該研究為混合糖碳源發酵產油脂的碳源配比及更高效的木糖?葡萄糖共利用提供了參考。

為了克服木質纖維素水解產生的抑制物的影響，Huang 等[54]將經稀硫酸水解后的玉米芯水解物經堿脫毒和活性炭吸附，發現L.starkeyi可以同時利用水解液中的木糖和葡萄糖生產8.10g/L的油脂。Sitepu 等[89]則利用合成水解液解決抑制問題，研究了酵母利用合成水解液（SynH）APEXTM（利用高溫、高壓和氨工藝預處理的技術）的發酵性能，發現APEXTM可促進部分纖維素脫結晶和半纖維素解聚，降低木質素抗逆性，增強菌株利用玉米秸稈水解液（ACSH）的產油能力。大多數酵母菌株能夠在SynH 中積累油脂，只有少數能夠在ACSH 培養基中生長和生產油脂，土生隱球菌（Cryptococcus humicola） 在ACSH 中生長時，能夠產生高達15.50g/L 的油脂，油脂含量達到細胞干重的40%，是目前報道的最高的利用真實水解液產油脂的酵母之一。此外，還發現在SynH 培養基中以木糖作為唯一碳源預培養，可使酵母菌在隨后的水解培養基中更高效地利用葡萄糖和木糖。

3.3 γ-聚谷氨酸

γ?聚谷氨酸（γ?PGA）是微生物發酵產生的水溶性多聚氨基酸，由D?谷氨酸和L?谷氨酸單體以γ-位上的酰胺鍵聚合而成，具有良好的吸附性和生物降解性，在生物修復及醫藥領域應用較多[31]。谷氨酸的兩個羧基導致γ?PGA 的化學合成非常復雜，因此其制備主要依靠細菌發酵。用于生產γ?PGA 的細菌主要為芽孢桿菌，如B.subtilis、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）、暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）、炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）等[90]。

發酵底物成本過高是制約γ?PGA 規模化生產的重要因素。研究表明，采用合成生物學策略，引入低能耗代謝途徑或合成基因[91?93]是增強底物利用效率的常用方法。例如，Feng 等[91]在B.amyloliquefaciensNK?1 中引入節能型NADPH 依賴型谷氨酸脫氫酶（NADPH?GDH）途徑后，菌株NK?1 以蔗糖為底物生產γ?PGA 的產量增加了9.10%。廉價的木質纖維是更為經濟的γ?PGA生產原料[94]，Halmschlag 等[31]改造B.subtilis的木糖XI 途徑，引入更為高效的異源木糖WBG 途徑，選擇木糖誘導和葡萄糖抑制的PX43 啟動子元件組合，使得細胞生長和γ?PGA 的產生解耦，有利于在生長階段從葡萄糖獲得更高的生物催化劑供應，并在葡萄糖耗盡后誘導γ?PGA 合成酶的表達，構建了能高效利用木糖的工程菌。在37℃、0.50L 攪拌槽生物反應器中，分批發酵γ?PGA 產量較野生型菌株提高了6倍。借助Cobra Toolbox 和Matlab 對菌株的代謝通量分析優化后，以D?木糖和D?葡萄糖混合物（木糖占80%）為底物，γ?PGA 產量為5g/L，C摩爾轉化率為0.26（γ?PGA中碳/糖中碳）。

為了驗證工程菌株的木質纖維素底物的利用能力，Fang 等[55]利用B.amyloliquefaciensJX?6 以玉米秸稈和豆粕為固體基質生產γ?PGA，將產量從10kg 提高到37.50kg，在50L 和150L 曝氣式連續攪拌固態生物反應器中γ?PGA 產量最高，分別為116.88g/kg 和102.48g/kg。但是，隨著發酵體系擴大，γ?PGA 產量下降，可能是反應器容量增大導致發酵參數和細菌群落的變化，影響了底物利用和產量。為了進一步簡化生產工藝流程，該課題組深入研究工程菌株的環境適應能力，發現B.amyloliquefaciensJX?6 對底物和發酵條件具有良好的適應性，在非滅菌條件也可實現γ?PGA 的高效生產。

3.4 有機酸

3.4.1 富馬酸

富馬酸（FA）是由丁烯衍生的羧酸，作為重要的聚合原料，應用于食品、醫療、飼料及化學合成中間體領域[6,44,56]。生物轉化法因原料儲量豐富、可再生的優點，成為工業生產FA 的更好選擇[57,95?96]。生物發酵制備FA常用的原料是葡萄糖和淀粉類，以木質纖維素原料為底物生產FA 可以實現廢物利用，進一步降低原料成本[6,44,96]。但是，以木糖為底物生產FA相比葡萄糖有待進一步提高。Kautola 等[97]利用R.arrhizus以木糖為碳源發酵僅得到16.40g/L的FA。Wen等[56]采用定向進化獲得一株優良的菌株R.arrhizusRH7?13，不同于之前的菌株通過呼吸作用利用木糖轉化為二氧化碳提高生物量和能量供應的方式，該菌株突變后，更傾向于利用木糖促進細胞生長的方式來增強FA 生產，可將發酵木糖制備FA 的產量提高至28.48g/L，木糖消耗量達到83%，轉化率達到46%（FA/木糖）。為了進一步提高FA 產量，該課題組[44]利用選擇培養基從R.arrhizusRH7?13 篩選得到R.arrhizusRH7?13?9#，能更高效地利用木糖生產45.31g/L FA，轉化率為73%。

木糖?葡萄糖共利用發酵比單糖發酵更利于纖維素原料的充分利用。但是，當前的研究多局限于葡萄糖或木糖單獨發酵生產FA，而對木糖?葡萄糖混糖共利用制備FA 的研究相對較少。為了減少發酵批次，實現木質纖維素水解物中木糖及葡萄糖混合物的同步利用，該課題組[6]以高濃度木糖分離篩選獲得的新菌株R.arrhizusRH7?13?9#，并研究了其混糖協同發酵過程，利用80g/L 葡萄糖發酵得到37.52g/L FA。進一步優化后，發現混合糖利用過程中葡萄糖仍然是首選糖，但葡萄糖的添加不僅加速了FA 的生成，還增加了副產物乙醇的產量；而木糖的加入不利于副產物乙醇的生產。因此，確定了最佳木糖/葡萄糖質量比為75/25，碳氮質量比為800/1，FA 產量可達46.78g/L。探究了混糖比例與FA 產量的關系，為高效利用纖維素原料規模化生產FA提供了參考。

3.4.2 乳酸

乳酸是廣泛應用于食品、醫藥、紡織印染等領域的多用途有機酸[58?59,98]。米根霉（Rhizopus oryzae）營養要求低、產物純度高，使其成為最有前途的乳酸生產菌種之一。潘麗軍等[58]經N+注入誘變篩選得到菌株R.oryzaeN50?7。隨后采用響應面法優化培養條件，確定最佳了混合糖比例為2∶1（木糖∶葡萄糖），搖瓶發酵72h，L?乳酸產量為119.22g/L，轉化率為79.48%。該實驗表明利用響應面法優化培養混合糖能夠協調木糖?葡萄糖代謝平衡，解除胞內代謝擾動，從而促進產物的轉化。

木質纖維素水解液直接用于發酵生產L?乳酸，能使成本更低，利于產業化。姜珊[59]以玉米芯殘渣為 底 物， 利 用 凝 結 芽 孢 桿 菌H?1 （Bacillus coagulansH?1）補料分批發酵，L?乳酸產量達68g/L，轉化率為0.85g/g（L?乳酸/玉米芯），實現了木質纖維素向可用化學品乳酸的轉化。成分復雜的水解液直接用于生產發酵時，其中的弱酸、酚類等多種物質會抑制菌株生長和產物得率。針對該問題，Zhang 等[60]分離得到一株嗜熱菌株B.coagulansIPE22，能夠發酵戊糖、己糖和纖維二糖，且對水解液中多種抑制物具有耐受性，結合這一特點，建立了以100g小麥秸稈為底物的高溫發酵集成工藝：小麥秸稈經稀酸預處理后，無需固液分離和脫毒步驟，直接同步糖化共發酵生產46.12g乳酸，減少了設備投入，降低了能耗和生產成本。此外，該課題組[61]首次報道了利用B.coagulans發酵非食用淀粉一步法生產乳酸，利用B.coagulansIPE22 以木薯和高粱粉等非食用淀粉為原料直接分批發酵生產乳酸時淀粉酶活性過低，補加中溫α?淀粉酶和糖化酶后，不滅菌，同步液化與糖化，發酵乳酸產量為68.72g/L，轉化率0.99g/g。

3.4.3 其他

除上述應用外，Chen等[46]在C.glutamicum中將葡萄糖代謝途徑與甘油合成途徑相結合，利用肌醇滲透酶（iolT1）和葡萄糖激酶（glk）取代PEP 依賴的PTS減少副產物生成，實現木糖和葡萄糖共利用高效生產3?HP，產量達38.60g/L，轉化率為0.46g/g（3?HP/葡萄糖）。在此基礎上，進一步整合戊糖轉運蛋白基因araE及木糖分解代謝基因XylA、XylB，實現了更高效的木糖?葡萄糖共利用。補料分批發酵，3?HP 產量提升至62.60g/L，轉化率為0.51g/g，表明模塊化構建功能性代謝路徑有利于平衡工程菌株生長和產物合成過程。

Fu 等[62]在Clostridium tyrobutyricum（C.tyrobu?tyricum）中過表達來自丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）的XylT、XylA和XylB基因，獲得的工程菌株Ct?pTBA 可以實現木糖?葡萄糖共利用，丁酸產量由19.40g/L 提升至37.80g/L，木糖利用率由13.80%提高至94.30%，丁酸轉化率達到0.32g/g（丁酸/木糖?葡萄糖混合物）。為了便于實際生產，該課題組研究了工程菌株Ct?pTBA 共利用大豆殼、玉米纖維、小麥秸稈、水稻秸稈和甘蔗渣水解物中的木糖和葡萄糖的過程，發現Ct?pTBA較野生型菌株表現出更高的木糖利用率，且沒有顯著的CCR，在pH為6.0的生物反應器中，水解物中的木糖和葡萄糖利用率接近100%，丁酸產量為42.60g/L，轉化率0.36g/g（丁酸/水解物），證明了Ct?pTBA 具有利用木質纖維素水解物生產丁酸的潛力。

上述木糖?葡萄糖共利用產品的應用實例展現了以木質纖維素生物質為底物生產高值化學品的巨大潛力，而木糖?葡萄糖共利用工程菌能否構建成功、混糖利用效率及產物產量除了代謝途徑的糖轉運蛋白效率、合成基因表達水平等關鍵因素外，還受底物預處理方法及分支代謝途徑制約[20?22,99?103]。

4 木糖及葡萄糖共利用發酵優化策略

4.1 木糖及葡萄糖共利用基因水平調控

4.1.1 木糖及葡萄糖轉運蛋白基因優化

木糖、葡萄糖被轉運到胞內是被微生物代謝利用的前提，糖轉運蛋白在微生物攝取糖的過程中扮演著重要角色，決定了代謝通量和糖利用效率。微生物單糖轉運蛋白可分為三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白（ATP?binding cassette, ABC）、易化超家族轉運蛋白（major facilitator superfamily, MFS）和磷酸烯醇式丙酮酸?糖磷酸轉移酶轉運蛋白（carbohydrate phosphotransferase system, PTS）三大類[104]，見圖3。其中MFS 型轉運蛋白分為借助糖濃度梯度、不消耗能量的單向異化擴散型（facilitator/uniporter）被動運輸和偶聯質子或鈉離子濃度消耗ATP 能量、不依賴糖濃度梯度的質子或鈉離子同向協同型（H+?linked symporter，Na+?linked symporter） 主 動運輸[104?105]。相關研究證明，S.cerevisiae內源非特異性戊糖轉運蛋白屬于不消耗能量的單向異化擴散型[9,105]。ABC 轉運蛋白因其較高的底物親和力和清晰的結構研究而成為細菌戊糖轉運基因改造的優先選擇。

圖3 轉運蛋白分類示意圖

木糖?葡萄糖共利用菌株構建面臨的首要問題是葡萄糖的存在對木糖的分解代謝物阻遏作用（CCR），CCR突出表現在一些非特異性的木糖轉運蛋白層面[106]。如S.cerevisiae的內源性己糖轉運蛋白Hxt7p 和Gal2p[105,107?108]，雖可以非特異性地轉運木糖，但對木糖的親和力遠低于葡萄糖，且易受到葡萄糖的強烈抑制。在木糖?葡萄糖共利用過程中，利用專一性強的木糖轉運蛋白增強轉運蛋白對木糖的親和力，使木糖及葡萄糖轉運蛋白“各司其職”是緩解CCR 的有效策略[7,9,108?110]。例如，Shin 等[111]在缺乏Hxt1?7和GAL2基因的菌株中表達S.cerevisiae的隱性糖轉運蛋白Hxt11，實現了有氧和無氧條件下木糖及葡萄糖共利用；Hxt11的誘變產生的轉運蛋白與D?葡萄糖相比對D?木糖有更好的親和力，并保持高轉運率。而此前沒有發現Hxt11 與D?木糖轉運相關，表明內源性轉運蛋白篩選優化是解決CCR的可行方法。

4.1.2 敲除抑制基因及分支代謝基因

敲除抑制基因或阻斷分支代謝途徑是提高產物產量和目標代謝途徑碳通量的重要策略。敲除關鍵抑制基因可以有效調控木糖?葡萄糖共利用。蔡艷青等[112]敲除了S.cerevisiae中CCR 系統的兩個關鍵調控因子Mig1 和Snf1，激活了氮分解代謝阻遏基因表達，增強了S.cerevisiae的混糖利用能力，使木糖消耗速率提高到初始菌株的1.23倍。Gao等[113]敲除了葡萄糖代謝途徑中間產物的分支代謝基因fadR、lysC、aspB、pckA以及下游的谷氨酸分解代謝基因proAB、rocG和gudB，獲得的菌株NK?A6的γ?PGA產量為4.84g/L，比初始菌株提高了31.50%。此外，啟動子的類型會影響基因表達水平，且限速步驟的酶催化反應大多需要能量及輔因子參與[83]。因此，啟動子的選擇、胞內還原力水平調控對于增強代謝流、提高產量至關重要。該課題組進一步在異檸檬酸脫氫酶基因icd上游插入強啟動子PC2up，調控NADPH 相關基因pgi和gndA表達，增加胞內還原力水平，最終γ?PGA產量提高至7.53g/L。

4.1.3 過表達產物合成基因

合成基因編碼的關鍵酶的活性決定了反應速率，是整個代謝網絡的限速步驟。過表達代謝途徑合成基因是提高代謝通量、克服CCR、提高混糖共利用效率的有效方法。如姜珊[59]通過表達異源葡聚糖內切酶基因Bscel5，使B.licheniformisBN11 可以利用無定形纖維素生產D?乳酸。Fu 等[7]表達異源木糖分解代謝基因XylT、XylA和XylB，消除了C.tyrobutylicum中的CCR。構建的工程菌株可以共利用木質纖維素水解物中的木糖和葡萄糖，利用率接近100%。此外，張佳[50]過表達粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）的Xyl1 基因、S.stipitis的Xyl2基因和白色假絲酵母（Candida albicans）的Xyl2基因，改善了輔酶不平衡問題，提高了利用木糖生產乙醇的能力。同時，敲除3?磷酸甘油脫氫酶基因GPD1降低甘油和乙酸等副產物積累，42℃條件下，實現103.97g/L 木糖和40.96g/L 葡萄糖共利用乙醇產量達到51.43g/L。

4.2 木糖及葡萄糖共利用發酵技術優化

4.2.1 細胞固定化

根據培養基的形態不同，發酵方式可分為固態發酵和液態發酵。細胞固定化發酵是指用物理或化學的方法將細胞固定于一定的結構域內，將整個固定化體系放置于液態培養基中發酵，可以結合兩種方式產物密度高、可控性強的優勢，具有抗逆性強、穩定性好、可重復利用等優點[114?116]。根據固定化原理和細胞表面特性不同，常用的固定化方法有包埋法、吸附法、共價法和交聯法等。常見的天然有機高分子載體材料有海藻酸鈉、果膠和殼聚糖等，因無毒性、傳質性能優和生物相容性好，已被廣泛應用于生物發酵系統[116]。

此外，根據包埋物的不同，固定化又分為單種細胞固定化、細胞?酶固定化、細胞?細胞固定化、酶固定化等形式。Xu 等[117]將海藻酸鈉用于固定熱纖維梭菌（Clostridium thermocellum）和熱解糖梭菌（Clostridium thermolacticum）的共培養系統，與游離細胞相比，固定化細胞發酵木質纖維素底物的乙醇產量提高了60%以上。纖維素原料預處理過程中產生的有毒物質及極端pH 條件會抑制細胞生長和代謝，降低乙醇產量。海藻酸鈉可包埋細胞形成微球，將菌體包埋于微球核心中，以空間隔離的方式使細胞免受發酵體系中有毒物質的傷害，同時可提高細胞對pH 變化的適應能力。此外，Evrim günes 等[118]將葡萄糖苷酶和Z.Mobilis共固定化，利用淀粉生產乙醇，發現98%的底物轉化為乙醇。多種細胞共固定化利用微生物種間協調共生的特點，細胞與酶共固定化利用了微生物與酶的協同作用。

4.2.2 混菌發酵技術

混菌發酵是指利用兩種或兩種以上的微生物混合共培養的發酵技術，屬于微生物生態工程范疇。混菌培養包括直接共培養、間接共培養和共固定化混菌培養等[119]。混菌發酵能夠利用共培養微生物種間的協同代謝、誘導作用、基因轉移及種間群體感應等[119?125]，使發酵系統持續穩定地運行。

混菌發酵能夠結合不同菌株的優勢，利用種間相互作用克服一些微生物不能利用木糖或葡萄糖的限制。江楓等[121]采用包埋法固定化C.shehatae和S.cerevisiae混菌發酵（菌體比例4∶1）生產乙醇，可以快速利用葡萄糖，解除葡萄糖對木糖代謝的抑制，縮短發酵時間，產量達14.89g/L，較單菌發酵提高了12.12%。Ferreira 等[122]利用Z.mobilis和P.tannophilus混菌發酵，將Z.mobilis先于P.tannophilus接種到經稀硫酸處理后的香蕉皮水解產物中，有利于加速葡萄糖利用，解除CCR。針對S.oneidensis不能利用木糖及葡萄糖作為碳源的局限，Li 等[123?124]構 建 了K.pneumoniae和S.oneidensisMR?1的混菌產電系統，借助K.pneumoniae以葡萄糖、木糖或甘油作為底物高產乳酸，生成的乳酸作為產電菌S.oneidensisMR?1生長的碳源，形成了種間協同作用；Lin 等[125]將S.cerevisiae和S.oneidensisMR?1 混合共培養，提高了S.cerevisiae以葡萄糖為底物生產乳酸的能力，產生的乳酸作為碳源供給S.oneidensisMR?1產電。此外，混合培養還增強了S.oneidensisMR?1細胞膜通透性和導電性，使得產電功率得到較大提高。Valdez?Vazquez 等[119]在直接共培養中，將木質纖維素發酵轉化為氫氣，水解菌（Clostridium cellulovorans） 和發酵菌（Clostridium acetobutylicum）的接種比例為5∶3 時，建立了協同關系，利用小麥秸稈產氫氣量達128mL/L，比單培養提高了2～3倍。然而，這種協同關系并非廣泛適用于多種發酵底物，如：在天然麥草微生物群落的生物強化過程中，兩種菌之間的協同關系消失，對甘蔗渣的發酵產氫率也沒有提高。

針對混菌發酵導致副產物較多的問題，Zhang等[126]利用CCR 較弱的短乳桿菌（Lactobacillus brevis）同時利用葡萄糖和木糖生產乳酸，但乳酸轉化率僅為0.52g/g，還伴隨著副產物乙酸和乙醇的產生。但將Lactobacillus brevis（L.brevis）與Lactobacillus plantarum（L.plantarum） 共 培 養 后減少了副產物乙醇，顯著提高了乳酸產量，L.plantarum在葡萄糖消耗上優于L.brevis，L.brevis主要將木糖轉化為乳酸，由于發酵系統中產生的NADH 較少，導致副產物乙醇減少。該體系L.brevis和L.plantarum連續共發酵楊樹水解液生產乳酸的轉化率高達0.80g/g，堿處理玉米秸稈的乳酸轉化率提高到0.78g/g，可見合理組合利用微生物之間的代謝關系，不僅可以避免多種微生物共同代謝產生較多的副產物，還能進一步提高產量。

將功能性代謝途徑整合到不同的宿主菌中，利用混菌技術共利用木糖和葡萄糖可以避開復雜的微生物代謝調控過程。Saini等[127]在梭狀芽孢菌輔酶A依賴的正丁醇合成途徑中，敲除adhE、frdA、ldhA、poxB和pta基因以保存NADH和減少碳浪費，將CCR 不敏感的菌株轉化為葡萄糖和木糖利用菌株，其中不含XylA基因的菌株BuT?8?Glu 選擇性代謝葡萄糖，而缺乏glk基因的菌株BuT?8?Xyl 選擇性利用木糖，將正丁醇合成途徑分配到兩個菌株中，建立了由兩種菌組成的共培養體系，兩種糖（木糖/葡萄糖質量比2∶1）共利用發酵獲得5.20g/L正丁醇。Wen等[128]敲除Clostridium celllovorans（C.celllovorans）的醋酸激酶基因Clocel-1892 和乳酸脫氫酶基因Clocel-1533，過表達丁酸激酶基因Clocel-3674，將碳流量拉向丁酸生成。與此同時，為了提高乙醇產量，使用CRISPR 干擾下調了氫化酶基因Clocel-2243 的表達， 并在Clostridium beijerinckii（C.beijerinckii）中導入了有機酸再同化基因（ctfAB，cbei）和戊糖利用基因XylR和XylT。最終，改造后的C.celllovorans和C.beijerinckii組成的雙梭狀芽孢菌系統可分解83.20g/L經堿處理的玉米芯生產11.50g/L 丁醇，同時產生4.25g/L 丙酮和6.37g/L 乙醇，為發酵木質纖維素提供了有效的平臺。

此外，混菌技術有助于減弱水解物的毒性。Theiri 等[129]以預處理后的半纖維為底物將Ureibacillus thermosphaericus和Cupriavidus taiwanensis共培養解毒，再與Paenibacillus campinasensis共培養水解，發現絮凝后酚類化合物被還原。但這種解毒作用相對有限，還需采取針對性的措施才能提高脫毒效果。

4.2.3 發酵液副產物脫毒處理技術

底物預處理過程中一般會產生一些副產物，導致發酵液成分、pH 等關鍵條件改變，降低產量或增加產物分離純化難度，如酚類、糠醛、呋喃類衍生物、弱酸、堿或固形物等。研究表明，在甘蔗水解過程中會釋放乙酸和糠醛，木聚糖主鏈上的乙酰側鏈水解時，容易釋放乙酸[130]。這些副產物對微生物發酵具有較強的抑制作用，乙酸會使發酵液酸性增強而影響微生物細胞的生理狀態，糠醛及高濃度的呋喃類衍生物會抑制菌株生長、干擾大分子合成和糖酵解酶等[16]，從而導致微生物細胞活力下降，使產量降低。

產物合成過程產生的高濃度副產物也是生物發酵規模化應用的一個重要制約。如發酵過程產生的弱酸會使發酵液的pH 降低，而混糖發酵時，木糖代謝比葡萄糖代謝對培養液酸度更敏感，低pH 更容易抑制木糖發酵[103]。Wu 等[103]在研究C.acetobutylicum的木糖?葡萄糖共利用過程時，發現當初始總糖濃度為120g/L 時，兩種糖的利用率均隨其濃度或比例的增加而增加，在pH 為6.0 時，總糖利用率基本不變，降低pH至5.0顯著降低了糖的利用率和丁酸產量，對木糖代謝比葡萄糖的影響更明顯。添加紫精促進乙酸的再吸收，丁酸產量則提高至46.40g/L、轉化率為0.43g/g。張影等[131]發現混糖發酵時，葡萄糖的代謝產物乙酸、乙醇與甲酸，三者共存時對木糖發酵表現出強烈的協同抑制，而單獨存在時抑制作用大大降低。因此，采取適當的底物預處理及水解液脫毒方法[22]、基因工程改造或發酵工藝改進措施等對解除產物和代謝中間體的抑制作用是必要的。

4.2.4 補料方式

根據料液添加時間和方式的不同，發酵方式通常分為分批發酵（BF）、連續發酵（CF）、補料分批發酵（FBF）等。FBF 因底物利用率及轉化率高、便于自動化控制、能解除產物反饋抑制和分解代謝物阻遏作用等優勢而得到廣泛應用[63,132?133]。

以木質纖維素水解液為底物混糖發酵面臨的最大的挑戰是CCR，FBF 是解除CCR 的有效方式。Jin 等[132]在水稻秸稈補料分批半同步糖化發酵中，將酶補料（E 補料）、底物補料（SR 補料）、酶和底物組合補料（E?SR 補料）三種方式與BF 比較。結果表明：SR補料和E?SR補料乙醇產量較高，分別獲得116.80g/L 和118.90g/L 的乙醇，該方法有效提高了混糖利用率。Abdel?Rahman 等[63]利用木質纖維素來源的糖借助FBF工藝得到129g/L乳酸，發現木糖濃度大于10g/L 時，可實現均質乳酸發酵、減少副產物生成，更關鍵的是葡萄糖濃度低于25g/L可避免CCR。經基因工程改造、系統重構代謝路徑獲得的工程菌采用FBF的方式生產時，能發揮二者優勢，最大程度地削弱CCR[88]。此外，結合兩段式發酵策略利用稀酸預處理后的玉米芯漿液生產木糖醇和乙醇的過程同樣消除了CCR，第一階段木糖在微曝氣條件下生產木糖醇，第二階段同步糖化發酵葡萄糖生產乙醇[134]。

5 結語

目前，以木質纖維素水解液中的木糖及葡萄糖共利用發酵生產醇類和有機酸等化學品已經取得許多突破性進展。但是，現階段的研究存在一些亟待改進的問題，例如：①菌株誘變或定向進化篩選效率較低；②能夠同時高效利用木糖和葡萄糖共發酵的菌株較少，分支代謝及副產物較多，基因改造及代謝調控缺乏系統性和全局性，未能完全解除CCR，代謝通量有待提高；③底物預處理方法復雜、易產生毒性物質且脫毒困難；④產物分離純化成本較高、產量低；⑤發酵工藝適用范圍窄、反應條件控制成本較高。

針對上述問題的優化方向主要有：①開發高效的、選擇性好的高通量、定向菌株篩選方法；②借助合成生物學策略，利用基因工程、代謝工程、組學分析及系統工程等對菌株進行理性改造與設計，重構代謝途徑，獲得發酵性能優異的工程菌株；③使用物理、化學或生物等多種方法組合聯用的方式設計改進底物和代謝產物的預處理及脫毒方法；④利用材料科學與生物學交叉學科優勢開發性能優異的細胞固定化載體材料和固定化方法，借助菌群分析、代謝組學等科學的設計混菌生態系統；⑤針對不同宿主菌或產物分離需要個性化設計發酵工藝條件的同時兼顧工藝功能區模塊化、組合化，降低工藝設計成本。

相信通過系統化、全局化、科學化的設計與針對性的工程化探索，未來儲量豐富的木質纖維生物質會成為更加實用的可再生資源，而不是當作廢物造成環境污染和資源浪費，以其為底物必然能夠給社會經濟發展創造更多有價值的產品，催生更多的綠色環保產業，產生深遠的經濟社會效益。