多級結構羥基硝酸銅納米酶的制備及其對酚類污染物的降解

吳中杰，謝連科，王晶輝，黃仁亮

（1 國網山東省電力公司電力科學研究院，山東 濟南 250002；2 天津大學海洋科學與技術學院，天津 300072）

隨著酚類物質在木材防腐、農藥、消毒劑等領域的廣泛應用，酚類化合物已成為土壤和地下水中常見的有機污染物[1]。因其具有致癌、生殖毒性、神經毒性等特點，嚴重威脅人類健康及生態環境[2]。濕式過氧化氫催化氧化法是目前較為行之有效的酚類有機廢水處理方法[3?4]。其中，濕式過氧化氫氧化反應催化劑——羥基硝酸銅[Cu2(OH)3NO3]的主要合成方法有Cu(NO3)2與NaOH 溶液反應沉淀法[5]、Cu(NO3)2與尿素水解法[6]、Cu(NO3)2溶液與CuO 反應法[3]、Cu(NO3)2溶液水熱法[7]等。但是，過氧化氫等氧化劑的加入不僅提高了有機廢水處理成本，更對環境造成了不可控的影響。因此，開發以空氣為氧化劑的污染物降解催化劑是未來高級氧化工藝的重點研究方向。

漆酶作為一種多銅氧化酶，可以實現多胺、多酚類有機物的單電子氧化與氧氣的四電子還原[8?9]。因此，漆酶是一種可用于水處理及土壤修復領域的綠色催化劑[10]。然而，漆酶具有催化穩定性差、重復利用性低、成本高等缺點，限制了其環境催化應用。為提高漆酶的重復利用性，科研人員開發出多種漆酶固定化技術[11?13]。雖然酶固定化大大提高了漆酶的重復利用性，但是由于蛋白質在復雜環境下的穩定性較差，天然酶的催化穩定性仍是亟待解決的關鍵問題。

納米酶是一種具有酶催化活性的納米材料，因其具有多功能性、低成本、高穩定性等優點，近年來引起廣泛關注[14]?；诙喾N納米材料及其衍生物的納米酶被相繼研究報道，如貴金屬[15]、金屬氧化物[16]和碳基納米材料[17]等，并被用于病毒檢測[18]、重金屬離子檢測[19]、有機磷化學試劑降解[20]和滅菌[21]等領域。相比天然酶，納米酶體現出更好的催化穩定性和重復利用性。

本文以尿素水解過程中產生的異氰酸根離子為模板劑，與Cu(NO3)2溶液反應制備具有漆酶活性的多級結構羥基硝酸銅[H?Cu2(OH)3NO3]納米酶（圖1）。相比傳統Cu(NO3)2與尿素水解法制備的羥基硝酸銅，其比表面積更大，催化活性更高。通過TEM（透射電子顯微鏡）、SEM（掃描電子顯微鏡）、FTIR（傅里葉變換紅外光譜）、XPS（X 射線光電子能譜）和XRD（X射線衍射）等表征手段，對其表面結構及內部組成進行研究；通過漆酶特征反應，考察H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化活性、穩定性、重復利用性；并考察其氧化降解實際污染物（2,4?二氯苯酚和對苯二酚）的催化效率。此外，通過對照實驗與理論分析，研究H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化機理。

圖1 多級結構羥基硝酸銅[H?Cu2(OH)3NO3]納米酶的合成示意圖

1 材料與方法

1.1 實驗材料

尿素和Cu(NO3)2·3H2O，天津元立化工有限公司；2,4?二氯苯酚（2,4?DP）、4?氨基安替吡啉（4?AP）、2?嗎啉乙磺酸（MES）、對苯二酚，上海阿拉丁生化科技有限公司；漆酶（laccase），Sigma?Aldrich。上述試劑均為分析純，直接用于本實驗。

1.2 H-Cu2(OH)3NO3納米酶的合成方法

6g 尿素溶于50mL 水中，轉移至三頸瓶中，100℃油浴下劇烈攪拌6h。1.32g Cu(NO3)2·3H2O 溶于50mL 水中，逐滴加入尿素溶液中，攪拌10min后，將反應體系轉移至燒杯中，常溫下攪拌20min后，離心水洗，乙醇洗，60℃干燥。

1.3 表征方法

掃描電子顯微鏡圖像（SEM）由場發射掃描電鏡（FESEM，Regulus 8100，日立高科技公司）在4kV加速電壓下拍攝。在掃描電鏡觀察之前，所有樣品均使用E1045鉑涂層機（日立高科技公司）濺射鉑涂層。透射電子顯微鏡圖像（TEM）由場發射透射電子顯微鏡（JEM?2100F，日本電子） 在200kV加速電壓下拍攝。通過紫外可見分光光度計（Agilent Cary 3500，美國）測量紫外光譜數據。通過X 射線衍射儀（Bruker，德國）測量X 射線衍射（XRD）數據，以5°/min從10°掃描到80°。通過裝備了單色Al靶源（hν=1486.6eV）的XPS分光儀（Kratos Axis Supra）測量X射線光電子譜（XPS）。

1.4 H-Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶的催化活性

通過酚類物質與4?氨基安替吡啉（4?AP）發生的顯色反應，考察H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶的催化活性。具體而言，2,4?二氯苯酚（2,4?DP）的水溶液（1mg/mL,100μL）、4?氨基安替吡啉（4?AP）的水溶液（1mg/mL,100μL）和2?嗎啉乙磺酸（MES）緩沖溶液（30mmol/L，pH=6.8,700μL）混合，隨后向上述混合溶液中分別加入H?Cu2(OH)3NO3納米酶的水分散液和漆酶的水溶液（均為1mg/mL,100μL），在25℃下反應1h 后，將反應混合液離心（12000r/min, 3min）分離出納米酶催化劑，測試上清液在510nm下的吸光度。

1.5 H-Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶的催化動力學常數

不 同 濃 度（10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL 和100μg/mL）的2,4?二氯苯酚與0.15mg/mL的4?氨基安替吡啉（在所有測試中均保持過量）在0.1mg/mL H?Cu2(OH)3NO3納米酶或漆酶催化下反應，測定反應初始速率。采用米氏方程[式(1)]計算得到動力學常數（Km和vmax）。

式中，v為表觀初始反應速率；Km為米氏常數；vmax為初始最大反應速率；[S]為底物濃度。

1.6 H-Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶的催化穩定性和重復利用性

（1）酸堿穩定性測試方法 H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶分別在不同pH（3～13）的緩沖溶液中孵化7h，之后再考察其催化活性。相對活性是分別參照H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶在pH=7 時的催化活性。

（2）溫度穩定性測試方法 H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶的水分散液分別置于30～90℃、45min條件下分離出來測試催化活性。以H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶在30℃下的催化活性作為參照。

（3）時間穩定性測試方法 H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶在常溫下分散于水中，每三天測一次催化活性。

（4）鹽溶液穩定性測試方法 向上述2,4?二氯苯酚和4?氨基安替吡啉的催化反應體系中加入不同質量的NaCl，使NaCl 終濃度為0mmol/L、150mmol/L、300mmol/L 和500mmol/L，考察其反應1h后的上清液在510nm下的吸光度。

（5）有機溶劑穩定性測試方法 向上述2,4?二氯苯酚和4?氨基安替吡啉的催化反應體系中加入不同量的乙醇（體積分數分別為0、25%、50%、70% 和100%），考察其反應1h 后的上清液在510nm下的吸光度。

以上所有催化活性測試方法均采用2,4?二氯苯酚與4?氨基安替吡啉在室溫下反應1h 后，測試其上清液在510nm下的吸光度。

（6）H?Cu2(OH)3NO3納米酶重復利用性考察方法 2,4?二氯苯酚水溶液（1mg/mL, 100μL）、4?氨基安替吡啉水溶液（1mg/mL, 100μL）、MES緩沖溶液（30mmol/L, pH=6.8, 700μL）、H?Cu2(OH)3NO3納米酶分散液（1mg/mL, 100μL）在常溫下混合反應1h后，離心分離（12000r/min, 3min）水洗，進行下一次催化循環。

1.7 H-Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶催化降解酚類污染物

2,4?二氯苯酚（1mg/mL, 200μL）水溶液和對苯二酚水溶液（1mg/mL, 200μL）分別與MES 緩沖溶 液（30mmol/L, pH=6.8, 1400μL）、 去 離 子 水（200μL）、H?Cu2(OH)3NO3水分散液或漆酶溶液（1mg/mL, 200μL）混合。隨后以10mL/min 的速率向反應體系中通入氧氣，降解2,4?二氯苯酚與對苯二酚。每次取50μL 離心（12000r/min, 3min）后，采用高效液相色譜分析降解效率。

采用配備紫外檢測器（SPD?20A, Japan）的高效液相色譜（Shimadzu, Japan）檢測2,4?二氯苯酚和對苯二酚濃度。液相色譜檢測方法為C18色譜柱（Zorbax SB?C18, 250mm×4.6mm，i.d. 5μm, Agilent,USA），流動相為甲醇∶水（7∶3，體積比），流速為0.8mL/min，進樣量為20μL，檢測波長為226nm，柱溫箱為40℃，進樣前，樣品通過0.22μm 濾膜去除不溶物。

2 結果與討論

2.1 H-Cu2(OH)3NO3納米酶的結構表征

H?Cu2(OH)3NO3是一種長條狀納米片（一級結構）[圖2(a)]，這種長條狀結構可以組裝在一起形成納米團簇狀的宏觀結構（二級結構）[圖2(b)]。該多級結構未見文獻報道。

圖2 H?Cu2(OH)3NO3的TEM圖和SEM圖

為進一步研究H?Cu2(OH)3NO3中的化學鍵，H?Cu2(OH)3NO3的FTIR 紅 外 光 譜 如 圖3(a)所 示。H?Cu2(OH)3NO3在3532cm-1處的伸縮振動表明OH?的存在；在1415cm-1、1385cm-1、1342cm-1處的三重峰為Cu2(OH)3NO3的特征峰，且與相關文獻報道一致[6,22]；在2198cm-1處的峰表明存在異氰酸根，與傳統尿素法合成的Cu2(OH)3NO3材料[6]不同。因為尿素分解產生氨氣和異氰酸，異氰酸在酸性和中性條件下分解為CO2，在堿性條件下生成異氰酸根[6]。傳統尿素合成法將尿素與硝酸銅混合后加熱，制備片層狀的Cu2(OH)3NO3，因為硝酸銅的加入會使體系處于中性，所以異氰酸分解為CO2。而本文先使尿素在100℃下分解6h，產生的氨氣溶于水，體系為堿性，從而使異氰酸充分分解為異氰酸根，隨后逐滴加入硝酸銅制備多級結構的H?Cu2(OH)3NO3。綜上所述，推測異氰酸根的存在促進了多級結構的產生。證明尿素分解模板法與傳統尿素法的最大區別在于充分利用模板劑異氰酸根的結構調控作用。

H?Cu2(OH)3NO3的XRD 如 圖3(b)所 示，與Cu2(OH)3NO3的標準XRD 卡片完全對應，證明H?Cu2(OH)3NO3的成功合成。

XPS用于分析H?Cu2(OH)3NO3中Cu元素的價態及元素分布。精細XPS 能譜數據如圖3(c)所示，933.6eV 和953.4eV 的峰分別屬于Cu2+的Cu 2p3/2和Cu 2p1/2電子。結合能較低的931.7eV（2p3/2）和951.4eV（2p1/2）證明存在Cu+或Cu0。為進一步分析H?Cu2(OH)3NO3中Cu 元素價態，Cu LMM 俄歇譜如圖3(d)所示，574.6eV 的峰表明存在Cu+；569.2eV的峰表明存在Cu2+，且Cu+約占13.4%，Cu2+約占86.6%。

圖3 H?Cu2(OH)3NO3的結構表征

2.2 H-Cu2(OH)3NO3納米酶的催化活性

采用文獻[23]報道的酚類化合物與4?氨基安替吡啉（4?AP）發生顯色反應來考察H?Cu2(OH)3NO3和漆酶的催化活性。2,4?二氯苯酚（2,4?DP）在反應中被氧化，4?氨基安替吡啉與其氧化產物結合形成紅色的產物，相關物質的結構式如圖4(a)所示。H?Cu2(OH)3NO3在不同pH 下的催化活性，如圖4(b)所示。在pH=6 和6.8 時，H?Cu2(OH)3NO3具有較高的催化活性。因此，選擇在接近中性（pH=6.8）的條件下考察其催化活性。

為考察多級結構對Cu2(OH)3NO3催化性能的影響，在相同質量濃度下測定H?Cu2(OH)3NO3和傳統尿素法合成的Cu2(OH)3NO3催化2,4?二氯苯酚和4?氨基安替吡啉顯色反應的吸光度。結果表明，H?Cu2(OH)3NO3催化反應的吸光度是傳統Cu2(OH)3NO3催化反應吸光度的1.85倍[圖4(c)]，證明H?Cu2(OH)3NO3的多級結構增大了比表面積，暴露出更多的活性位點，從而顯著增強其催化活性。

圖4 H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化活性

通過調整底物濃度測定H?Cu2(OH)3NO3和漆酶的反應動力學參數，研究H?Cu2(OH)3NO3的催化動力學特性（圖5）。并通過米氏方程得到Km和vmax，如表1 所示。相比漆酶，H?Cu2(OH)3NO3具有更高的vmax值，說明其具有更高的反應速率。但是其Km值較大，說明H?Cu2(OH)3NO3的底物親和力低于漆酶。這可能與其剛性結構對底物的親和力弱于漆酶動態蛋白質結構對底物的誘導契合效應有關。

圖5 H?Cu2(OH)3NO3和漆酶室溫下催化2,4?二氯苯酚（2,4?DP）和4?氨基安替吡啉反應的Lineweaver?Burk圖

表1 常溫下H-Cu2(OH)3NO3和漆酶催化2,4-二氯苯酚和4-氨基安替吡啉反應的動力學常數

2.3 H-Cu2(OH)3NO3納米酶的催化穩定性和重復利用性

在酶催化劑的實際應用中，穩定性和重復利用性同樣至關重要。因此，研究H?Cu2(OH)3NO3納米酶在不同pH、溫度、儲存時間、離子強度、乙醇溶劑中催化2,4?二氯苯酚與4?氨基安替吡啉顯色反應的穩定性和重復利用性。

H?Cu2(OH)3NO3納米酶和漆酶分別在不同pH（3～13）的緩沖溶液中孵化7h 后，測試其在pH 為6.8的MES緩沖溶液中催化2,4?二氯苯酚和4?氨基安替吡啉反應的活性，數據如圖6(a)所示。酸性和堿性條件對漆酶的穩定性均有顯著影響，而H?Cu2(OH)3NO3在pH=5～10 的范圍內體現出良好的穩定性，當pH<5時，H?Cu2(OH)3NO3會溶解于酸性溶液中；當pH>10 時，會轉變為Cu(OH)2，從而造成催化活性的急劇降低。

H?Cu2(OH)3NO3納米酶的溫度穩定性如圖6(b)所示。在30～90℃的溫度下儲存45min 后，漆酶的催化活性從50℃開始逐漸降低，在80℃下完全失活。而H?Cu2(OH)3NO3納米酶也是從50℃開始逐漸降低，在90℃的極端條件下仍能保持50%以上的催化活性。說明相比漆酶，H?Cu2(OH)3NO3具有更好的溫度穩定性。

如圖6(c)所示，漆酶催化活性隨其在水中儲存時間的延長而逐漸降低，12d 后完全失活。但是，H?Cu2(OH)3NO3納米酶在水中常溫儲存18d 后仍保持65.2%的催化活性。表明H?Cu2(OH)3NO3納米酶在水中表現出較強的穩定性。

圖6 相同質量濃度下H?Cu2(OH)3NO3和漆酶在不同pH、溫度、儲存時間、NaCl濃度、乙醇等條件下的催化穩定性及H?Cu2(OH)3NO3的重復利用性

如圖6(d)所示，隨著NaCl濃度增大，漆酶的催化活性急劇降低；而H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化活性反而提高到原來的190%，可能是由于NaCl的存在促進了底物2,4?二氯苯酚在H?Cu2(OH)3NO3納米酶表面的吸附，從而極大地提高了催化活性。

為研究有機溶劑對催化活性的影響，將不同含量（0、25%、50%、70%和100%，體積分數）的乙醇與反應物溶液混合。如圖6(e)所示，隨著乙醇含量的增大，H?Cu2(OH)3NO3納米酶與漆酶的催化活性都在逐漸降低。當乙醇的體積分數為100%時，H?Cu2(OH)3NO3和漆酶均完全失活，向反應體系中通入氧氣，也未觀察到催化活性，表明乙醇溶液的存在會阻礙反應的進行。

為考察H?Cu2(OH)3NO3納米酶的重復利用性，將2,4?二氯苯酚和4?氨基安替吡啉與H?Cu2(OH)3NO3納米酶在MES 緩沖溶液中反應1h 后，離心分離，水洗后進入下一個反應循環。如圖6(f)所示，H?Cu2(OH)3NO3納米酶在經歷了12 次催化循環后，仍保持58%的催化活性。因此，H?Cu2(OH)3NO3納米酶在不同pH、溫度、儲存時間、離子強度、乙醇溶劑中均體現出優于漆酶的催化穩定性和良好的重復利用性。

2.4 H-Cu2(OH)3NO3納米酶催化降解酚類污染物

為了進一步研究H?Cu2(OH)3NO3納米酶對酚類污染物的降解能力，分別選擇2,4?二氯苯酚和對苯二酚作為氯酚和雙酚的模式底物。如圖7(a)所示，相比漆酶，H?Cu2(OH)3NO3納米酶對2,4?二氯苯酚體現更高的降解活性。如圖7(b)所示，H?Cu2(OH)3NO3納米酶降解對苯二酚的最終反應效率（42%）高于漆酶（31.5%）。但是，漆酶氧化對苯二酚的初始反應速率更快，這可能與漆酶具有更大的底物親和力有關。此外，H?Cu2(OH)3NO3納米酶對土壤與地下水中常見的2,6?二甲氧基苯酚和鄰氨基苯酚污染物的降解效率如圖8所示。在215min時，H?Cu2(OH)3NO3納米酶對2,6?二甲氧基苯酚污染物的降解效率為87.8%，高于漆酶的降解效率[58.5%，圖8(a)]。反應7.7h 后，H?Cu2(OH)3NO3納米酶對鄰氨基苯酚污染物的降解效率為69.6%，高于漆酶的降解效率[55.9%，圖8(b)]。因此，H?Cu2(OH)3NO3納米酶具有降解土壤與地下水中酚類污染物的能力，且其降解效率接近甚至優于漆酶。

圖7 H?Cu2(OH)3NO3與漆酶催化降解2,4?二氯苯酚和對苯二酚的反應轉化率

圖8 H?Cu2(OH)3NO3與漆酶催化降解2,6?二甲氧基苯酚和鄰氨基苯酚的反應轉化率

2.5 H-Cu2(OH)3NO3納米酶的催化機理

Solomon 等[24?25]深入研究了漆酶等多酚氧化酶的催化機理。具體而言，多酚氧化酶CuⅡ耦合的雙核活性中心先與酚類底物結合，氧化底物，生成醌類物質，CuⅡ得到電子轉變為CuⅠ耦合的雙核中心；隨后，氧氣分子與CuⅠ耦合的雙核中心結合，形成含氧配體的雙CuⅠ耦合結構；最后，氧氣得到CuⅠ的電子還原為水，CuⅠ被氧化為CuⅡ，實現酶催化循環。

受此催化機理的啟發，本文提出了H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化機理。如圖9所示，主要包括：① 酚類底物的結合；② 底物在雙CuⅡ耦合活性中心的氧化，伴隨CuⅡ被還原為CuⅠ；③ 氧氣分子與雙CuⅠ耦合中心結合，形成含氧配體的雙CuⅠ耦合結構；④ 氧氣得到CuⅠ的電子還原為水，伴隨CuⅠ被氧化為CuⅡ，實現H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化循環。為了使催化機理簡明易懂，H?Cu2(OH)3NO3納米酶的活性中心簡化為O?Cu配位結構。

圖9 H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化機理示意圖

3 結論

本文以尿素分解產生的異氰酸根為模板劑成功制備了具有漆酶催化活性的多級結構H?Cu2(OH)3NO3納米酶，并用于酚類污染物的氧化降解。主要結論如下。

（1）H?Cu2(OH)3NO3納米團簇（1～2μm）由長條狀納米片（500～900nm）構成，其多級結構主要與模板劑異氰酸根有關。

（2）H?Cu2(OH)3NO3納米酶的催化活性是傳統規整結構Cu2(OH)3NO3的1.85 倍，其最大反應速率是漆酶的1.27倍。在pH=5～10的體系中孵化7h后，仍能保持90%以上的催化活性。在90℃的條件下保存45min 或在水溶液中儲存18d 后仍能保持50%～66%的催化活性。重復利用12 次后，保持58%的催化活性。因此，H?Cu2(OH)3NO3納米酶具有良好的催化穩定性和重復利用性。

（3）H?Cu2(OH)3NO3納米酶具有降解土壤與地下水中常見的2,4?二氯苯酚、對苯二酚、2,6?二甲氧基苯酚和鄰氨基苯酚等酚類污染物的能力，且其降解效率接近甚至優于漆酶。