基于國家專利數據庫和網絡藥理學探討中藥復方治療潰瘍性結腸炎的配伍規律及作用機制研究*

徐喆，金昱彤，趙澤宇，王瑩，龔博煬，周會芳，邊育紅

（天津中醫藥大學中西醫結合學院，天津 301617）

潰瘍性結腸炎（UC）是一種病因復雜、難以治愈的慢性炎性腸病，以黏液膿血便、腹瀉、腹痛及里急后重為主要臨床表現，其復發率高、極易癌變被世界衛生組織列為難治病之一[1-3]。UC嚴重影響患者的代謝功能，降低患者的生活質量，并給社會帶來了沉重的衛生經濟負擔。當前UC的發病機制尚不明確，現有研究認為其發生主要與遺傳、腸道微環境、免疫反應、細胞凋亡及感染等因素有關；臨床上對UC的治療以氨基水楊酸類藥物、腎上腺皮質激素類藥物與免疫抑制劑3類藥物為主，但是存在毒副作用大、起效慢等問題[4-5]。

中醫藥在UC的防治中發揮了十分重要的作用，針對UC病因、病機、分期進行辨證論治，從而改善臨床癥狀、促進黏膜愈合、預防及治療并發癥，取得了良好的療效[6-8]。研究表明，多種中藥復方已被證實具有良好的治療UC效果，并獲得國家專利，如結腸復康顆粒、結腸炎奇效顆粒、腸清口服液等[9-10]。網絡藥理學是虛擬篩選潛在活性物質、作用靶點和通路，對藥物作用的機制和物質基礎進行預測的一種現代化研究手段[11-13]。研究通過挖掘國家專利數據庫中治療UC的中藥復方數據，分析其用藥規律和配伍特點，選取高頻核心藥物，運用網絡藥理學篩選治療UC的核心作用靶點，構建作用靶點蛋白互作關系、中藥-成分-治療靶點-疾病網絡，初步探索和闡述中藥復方專利核心藥物治療UC的藥理學機制，為臨床治療UC及中藥新藥研發提供理論參考，整體研究思路如圖1所示。

圖1 國家專利中藥復方高頻核心藥物治療UC的作用機制研究思路Fig.1 Research thinking of action mechanism of national patent Chinese medicinal compound high-frequency core drugs in the treatment of UC

1 材料與方法

1.1 復方數據來源 登錄“國家知識產權局-中國專利公布公告”網站（http：//epub.sipo.gov.cn/），進入“高級查詢”頁面，在高級查詢頁面中專利類型欄同時勾選“發明公布”與“發明授權”，將“潰瘍性結腸炎AND中藥”作為“名稱”項目進行檢索，對檢索結果進行合并、篩選后得到最終數據。檢索時間范圍為建庫至2021年12月10日。

1.2 復方納入與數據標準化 復方納入：納入國家專利數據庫中治療UC的全部中藥復方專利及含中藥提取物專利；中藥藥物組成相同但用量不同的專利可重復錄入，中藥藥物組成及用量相同的專利僅錄入1次。排除外用灌腸復方和非中醫藥醫療類（包括飲品、食品、保健品）專利。

數據規范及處理：依據2020年版《中國藥典》《中華本草》的藥物名稱進行對錄入的中藥名稱進行規范化處理；按照《中藥學》規范中藥復方的藥物功效類別。

1.3 數據關聯規則與聚類分析 利用IBM SPSS Modeler18.0軟件，基于Apriori算法對已納入的中藥復方進行關聯規則分析，設置同時滿足支持度≥5.0、置信度≥0.5和提升度≥2的藥對為治療UC的核心藥物。利用IBM SPSS Statistics 24軟件中的組間聯接聚類算法，對高頻藥物進行聚類分析。

1.4 中藥復方專利高頻核心藥物化學成分與作用靶點挖掘 通過中藥系統藥理學分析平臺數據庫[14]（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）挖掘高頻核心藥物的化學成分，設置化合物生物口服利用度（OB）≥30%、類藥性指數（BL）≥0.18，篩選高頻核心藥物的活性成分和蛋白靶點。此外，通過查閱文獻整理已報道的高頻核心藥物的化學成分，通過PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss ADME數據庫[15]（http：//www.swissadme.ch/）和Swiss Target Prediction數據庫[16]（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預測各主要化合物作用的靶點蛋白，收集probability＞10%的靶點。使用Uniport數據庫[17]（https：//www.uniprot.org/）對蛋白進行名稱規范轉化操作，去重后即得高頻核心藥物的對應靶點基因。

1.5 潰瘍性結腸炎潛在靶點獲取 以“ulcerative colitis”為關鍵詞分別在GeneCards數據庫[18]（https：//www.Genecards.org/）、人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，http：//www.omim.org/）和Drugbank數據庫[19]（https：//go.drugbank.com/）進行檢索，獲取UC相關靶點。

1.6 蛋白質相互作用網絡的構建及核心靶點篩選 將高頻核心藥物作用靶點和UC潛在靶點進行比對，篩選重復靶點，得到中藥復方專利高頻核心藥物治療UC的作用靶點，并導入StringVersion11.5平臺[20]（https：//string-db.org/），選擇物種為“Homosapiens”，構建蛋白相互作用（PPI）網絡。選取分值＞0.7分的高置信度區間，并根據自由度值≥2倍中位數的靶點構建PPI網絡，篩選核心靶點。

1.7 高頻核心藥物-成分-治療靶點-疾病網絡構建 將高頻核心藥物、化合物成分、治療靶點信息、疾病導入Cytoscape 3.8.0軟件[21]繪制中藥-成分-成分-治療靶點-疾病網絡圖。

1.8 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路和基因本體（GO）功能富集分析 為進一步研究中藥復方專利高頻核心藥物治療UC的作用情況，分別使用KOBAS 3.0在線基因富集網站[22]（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）和Metascape平臺[23]（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）對核心靶點進行KEGG信號通路和GO功能富集分析，結果以P值升序排列。

2 結果

2.1 專利檢索統計與分析 通過檢索國家專利數據庫，共獲得專利項目220項，納入符合標準的共175項。175項專利涉及藥物576味，納入中藥復方中最多藥味數為40，最少的藥味數為3，用藥頻次總計2 174次。其中使用頻率≥10次的藥物共49味，占總使用頻次的52.94%，見表1。使用頻次及頻率排在前10位的藥物為甘草、黃連、白術、黃芪、白及、白芍、黨參、白頭翁、地榆、木香。對頻次≥10次的藥物進行功效類別分析，發現各中藥類別使用頻率排名前3位的為：補虛藥、清熱藥和止血藥，見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。療效上多可補氣健脾、清熱解毒、止血、理氣，該用藥特點與中醫理論對“久痢”的基本病機“脾氣虛弱、濕熱蘊腸”相符。

表1 175項治療潰瘍性結腸炎中藥復方專利高頻藥物（≥10次）Tab.1 The 175 traditional Chinese medicine compound patent high-frequency drugs for the treatment of ulcerative colitis(≥10 times)

2.2 關聯規則與聚類分析 將49味高頻藥物導入IBM SPSS Modeler 18.0軟件中，基于Apriori算法對高頻藥物進行關聯規則分析，設定最低條件支持度百分比≥7，最小規則置信度百分比≥70，提升度＞1，得出中藥專利復方治療UC在組方配伍時同時出現且頻率較高的藥對、藥組。關聯規則結果以“后項→前項”展示，按支持度由高到低排序。

1）設定最大前項數為1，進行中藥專利復方治療UC藥物關聯二階分析，詳見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。結果顯示二階關聯規則中支持度最高的為甘草-陳皮。2）設定最大前項數為2，進行中藥專利復方治療UC藥物關聯三階分析，詳見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。結果顯示三階關聯規則中支持度最高的為黃連-木香-甘草。3）根據數據挖掘結果，繪制高頻藥物關聯規則web可視化布局圖。通過線條粗細來表示藥物配伍關系的強弱，線條越粗，藥物之間的配伍關系越強，結果如圖2所示。4）運用IBM SPSS Statistics 24軟件中的組間聯接聚類算法，對上述49味高頻藥物進行聚類分析，結果見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。

圖2 高頻藥物關聯規則web可視化布局圖Fig.2 Web visual layout diagram of high-frequency drug association rules

2.3 高頻核心藥物作用化合物及靶點 根據表1，選取頻次排名前6位中藥（甘草、黃連、白術、黃芪、白及、白芍）為治療UC的高頻核心藥物，該核心藥物與“2.2關聯規則與聚類分析”中所得結果基本相同。綜合文獻報道以及各數據庫檢索篩選收集所得的結果，高頻核心藥物的作用化合物及對應靶點蛋白數目見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。其中甘草89種，黃連13種，白術4種，黃芪18種，白及8種，白芍8種，去除重復后總計獲得129個化合物，涉及相關作用靶點931個。

2.4 UC疾病潛在靶點 經GeneCards數據庫檢索，得到UC相關靶點4 837個，按相關性得分≥10選取后得到186個潛在靶點。在OMIM和Drugbank數據庫中分別找到UC相關靶點182和78個。三者相加即為UC潛在靶點，去除重復基因，共得到376個疾病靶點。

2.5 蛋白質相互作用網絡的構建及核心靶點篩選 將高頻核心藥物化學成分的931個靶點與UC潛在靶點取交集，查找治療靶點共111個，見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。將111個蛋白導入STRING平臺進行蛋白互作網絡可視化，見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。根據自由度篩選得到23個核心作用靶點，見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。

2.6 構建中藥復方專利高頻核心藥物-成分-治療靶點-疾病網絡 將中藥復方專利高頻核心藥物6個單味中藥、涉及的129個化合物成分、111個治療靶點和1個UC疾病信息導入Cytoscape 3.8.0軟件繪制中藥-成分、成分-疾病靶點網絡圖。如圖3所示，網絡圖共涉及241個節點和1 400條邊。網絡模型中節點的面積越大代表該節點在網絡中的連接度越高。其中八邊形節點表示單味高頻核心藥物，六邊形節點表示化合物成分，菱形節點表示核心靶點，三角形代表潰瘍性結腸炎疾病。

圖3 高頻核心藥物-成分-治療靶點-疾病網絡圖Fig.3 Network diagram of high-frequency core drugs-components-treatment targets-diseases

2.7 KEGG通路和GO富集分析 將23個核心作用靶點導入KOBAS 3.0網站，通過“KEGG通路富集分析”模塊，得到KEGG通路總計164條。排名靠前的通路主要有糖尿病并發癥中的晚期糖基化產物（AGE）-晚期糖基化終末產物受體（RAGE）信號通路、白介素（IL）-17信號通路、炎癥性腸病（IBD）信號通路、t細胞受體信號通路、輔助性T細胞17（Th17）細胞分化信號通路等，按P值對排名前20名的通路途徑進行展示，繪制富集分析氣泡圖，見圖4。將前20條關鍵通路和23個核心靶點信息導入Cytoscape軟件繪制關鍵通路-靶點信息網絡圖。如圖5所示，網絡圖共涉及42個節點和236條邊。網絡模型中節點的面積越大代表該節點在網絡中的連接度越高。其中正方形表示關鍵通路，圓形表示核心靶點。

圖4 高頻核心藥物主要靶標基因調控的相關通路富集分析氣泡圖Fig.4 Bubble diagram for enrichment analysis of relevant pathways for regulation of main target genes of high-frequency core drugs

圖5 高頻核心藥物治療UC關鍵通路-核心靶點網絡圖Fig.5 Network diagram of key pathways-core targets of high-frequency core drugs in the treatment of UC

同時將這23個核心作用靶點蛋白導入Metascape平臺進行GO生物過程、細胞組分以及分子功能富集分析，總計獲得716條生物過程條目，13條細胞組分條目，31條分子功能條目。根據P值進行排序，繪制富集分析氣泡圖，見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。

3 討論

根據UC的臨床表現和病變特點，歸屬于中醫“泄瀉”“久痢”“滯下”等范疇，發病基礎為素體脾氣虛弱，感受外邪、飲食不節（潔）、情志失調為發病誘因，辨證分型為：大腸濕熱、熱毒熾盛、脾虛濕蘊證等，治療總以清熱化濕、健脾益氣為主[3]。目前治療UC多采用分期治療，活動期主要以清熱化濕、調氣和血為主，臨床多運用黃連、黃柏、白及、白芍等藥物，緩解期主要以健脾益氣為主，臨床多運用黨參、黃芪、白術、甘草等藥物。

研究共納入175項國家專利數據庫中治療UC的中藥復方專利，包含576味藥物，通過藥物頻次分析可知治療UC的高頻藥物共有49味，其中使用頻率排在前6位的中藥分別是：甘草、黃連、白術、黃芪、白及、白芍。甘草具有補益脾氣、清熱解毒的功效，發揮抗菌、抗炎、抗潰瘍等多種藥理作用[24]。黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，發揮抗菌、抗病毒、抗潰瘍等多種藥理作用，現代研究表明：黃連素、黃連提取物小檗堿、黃連總生物堿、黃連水煎液等對UC具有較好的保護作用[25-30]。白術具有健脾益氣、燥濕利水的功效，發揮抗炎、調節消化系統等多種藥理作用[31]。黃芪具有補氣升陽、托毒排膿、斂瘡生肌的功效，發揮抗腫瘤、免疫調節、抗纖維化等多種藥理作用[32]。白及具有收斂止血、消腫生肌的功效，發揮抗菌、抗炎、促進創傷愈合等多種藥理作用[33]。白芍具有養血調經、斂陰止汗的功效，發揮抗炎、抗氧化等多種藥理作用[34]。6味高頻核心藥物與臨床治療UC藥物一致，黃連、白及、白芍以清熱化濕、調氣和血為主，黃芪、白術、甘草以健脾益氣為主。

根據高頻藥物類別分析，結果顯示占據前3類的是補虛藥、清熱藥和止血藥，這與高頻核心藥物前6位分布一致。在治療UC的專利復方中，常以補虛藥為主，清熱藥和止血藥為輔。根據高頻藥物聚類分析共得出7個聚類組合，聚3類：黃柏、秦皮、白頭翁、黃連、木香、黨參、白術、茯苓、白芍、陳皮、防風等，藥物組合以清熱解毒藥為主，補虛藥、理氣藥、止血藥為輔。從這類藥物組合來看，可視為白頭翁湯、痛瀉要方與參苓白術散化裁而來，其功擅清熱解毒、活血止痢、健脾益氣、化濕止瀉，適用于UC熱毒熾盛、肝郁脾虛和脾虛濕阻者。由此得出治療UC的專利復方尤注重健脾益氣、清熱解毒、化濕止瀉。

選取6味高頻核心藥物，通過在線數據庫共篩選出129個化合物，涉及相關作用靶點931個，挖掘出治療靶點111個、核心靶點23個，構建了治療靶點蛋白互作關系網絡及高頻核心藥物-成分-治療靶點-疾病網絡圖，將核心靶點導入KOBAS 3.0網站和Metascape平臺進行分析，得到KEGG通路共164條，GO生物過程716條，GO細胞組分13條，GO分子功能31條。

分析蛋白互作關系網絡可知，高頻核心藥物治療UC的核心靶點包括信號轉導和轉錄激活因子3（SATA3）、腫瘤壞死因子（TNF）、IL-6、IL-1β、絲氨酸/蘇氨酸激酶 1（AKT1）、JUN、腫瘤蛋白 P53（TP53）等。STAT3介導細胞對生長因子的反應的信號轉導和轉錄的激活，與IL-6、JAK2共同調控免疫與炎癥反應，研究表明：中藥調控IL-6/JAK2/STAT3信號通路，抑制炎癥介質與細胞因子的活化，防治UC具有良好療效[35-36]。TNF-α是炎癥性腸病病理進程中的關鍵細胞因子，可表達黏附分子、凝血因子，啟動細胞毒性和凋亡等過程，中藥可顯著降低TNF-α水平，緩解UC的發生發展[37-38]。IL-1β與TNF-α同為促炎因子，主要由單核-巨噬細胞所產生，可促進B細胞分化和分泌抗體，進一步刺激T細胞分化IL-2和干擾素γ的產生，調節機體免疫功能，多種中藥復方可顯著降低IL-1β水平，促進黏膜組織修復[39-40]。TP53是與腫瘤相關的一種抑癌基因，其編碼產生的p53蛋白與細胞周期的調控、細胞凋亡和衰老等相關，通過抑制細胞的生長，從而預防癌癥的發生發展[41-42]。這些核心蛋白靶點主要參與了免疫調節與炎癥反應等過程。

結合KEGG通路和GO功能富集分析結果表明，高頻核心藥物可能通過AGE-RAGE、IL-17、IBD、Th17細胞分化等信號通路發揮作用，核心靶點蛋白主要參與了細胞遷移的正向調節、細胞因子介導的信號通路、細胞間黏附的正向調節、細胞活化、炎癥反應、轉錄調節復合物、細胞因子受體結合等過程，從而影響UC的發生發展，起到治療UC的作用。IL-17是由Th17產生的炎癥因子，可促進T細胞的激活和刺激細胞間黏附分子1（ICAM-1），進而引發炎癥級聯反應[43]；調節性T細胞（Treg）屬CD4+T細亞群，分泌IL-10，誘導和維持機體的免疫耐受，在人體自身免疫平衡中扮演重要角色，調節兩者保持動態平衡，共同維持腸黏膜免疫穩態[44-45]。這與課題組的前期研究結果一致，黃連主要成分小檗堿通過調節結腸中的腸道微生物群來調節Treg/Th17平衡以治療UC[27]。

但本研究仍存在一定局限性，基于專利數據庫數據挖掘方法僅簡單地統計分析出用藥頻次，未能充分考慮中醫辨證論治的特點，且部分專利的藥物用量未知，醫家的用藥經驗不一。此外，獲得了可能的關鍵蛋白靶點及其作用的信號通路，未能進一步采用體內外實驗來驗證其預測的準確性，缺乏實驗研究數據支撐。因此，這些局限性仍需在今后的研究中進一步完善和補充。

4 小結

本研究通過數據挖掘的方法對國家專利數據庫中治療UC專利復方的用藥規律進行深入總結分析，分析其用藥特點和配伍規律，選取高頻核心藥物，借助網絡藥理學篩選主要活性成分和核心作用靶點，構建PPI網絡、中藥-成分-靶點-疾病網絡和信號通路的富集分析，初步闡明高頻核心藥物多組分、多靶點治療UC特點，為臨床醫師遣方用藥提供了一定理論依據，也為中藥治療UC的基礎研究提供了預測思路。