藜蘆有效成分提取工藝優化*

張蒙蒙 ，魏淑婕 ，沈家圓 ，歐陽慧子 ，常艷旭 ，何俊

（1.天津中醫藥大學，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

藜蘆（Veratrum nigrum L.）又名山蔥、蔥葵、豐蘆等[1]，是中國傳統的中草藥，富含生物堿、黃酮、有機酸等天然活性成分，具有降血壓、抗腫瘤、抗氧化、抗炎鎮痛等作用[2-8]。甾體生物堿被認為是藜蘆的活性物質基礎，以芥芬胺、藜蘆胺為代表成分[9-11]。芥芬胺為介藜蘆型生物堿，藜蘆胺為藜蘆胺型生物堿，均具備 C-nor-D-homo-[14（13→12）-abeo]環系，A、B、D均為六元環，C為五元環，其相似的化學結構表征兩者可能具有相同的藥理活性[12-18]。近年來對藜蘆的提取分離、含量測定、配伍及藥理作用的研究較多[19-20]，提取工藝的討論較為少見。文章對藜蘆提取工藝進行優化研究，研究過程中引入了統計分析軟件（JMP）實驗設計模型，以驗證正交實驗數據的可行性與有效性。JMP軟件是一種交互式可視化統計發現軟件，其在醫藥行業中的用途有實驗設計和數據的統計分析。工藝優化需考察多種因素及水平對工藝參數的影響，因此科學合理地設計實驗、篩選關鍵影響因素對提供全面可靠的數據是十分重要的[21-23]。研究以藜蘆中芥芬胺和藜蘆胺的含量作為評價指標，采用單因素實驗、正交實驗及JMP軟件實驗設計模型考察乙醇體積分數、液料比、提取時間、提取次數4種因素對主要活性成分提取的影響，確定最佳提取工藝。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AX 205型十萬分之一（瑞士Mettler Toledo公司）天平；Milli-Q超純水制備儀（Millipore公司）；3K15型高速離心機（美國sigma公司）；XW-80A型渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠）。

1.2 試藥 甲醇、乙腈均為色譜純，購自美國Fisher公司；甲酸為色譜純，購自美國ROE公司；95%乙醇為分析純，購自天津市康科德科技有限公司；對照品芥芬胺（批號：DST190407-087，HPLC≥98%）、藜蘆胺（批號：DST190108-024，HPLC≥99%）由成都德思特生物技術有限公司提供；藜蘆購自安徽亳州藥材市場。

2 方法與結果

2.1 芥芬胺、藜蘆胺含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SBC18柱（4.6 mm×100 mm，1.6 μm）；流動相：A 相 0.1%甲酸水，B 相乙腈；梯度洗脫：0～20 min，15%～35%B；20～25 min，35%～37%B；25～28 min，37%～95%B。檢測波長：0～21.8 min，254 nm；21.8～28 min，205 nm。流速：0.5 mL/min，柱溫：30℃；進樣量：5 μL。結果見圖1。

圖1 對照品（A）與樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference substance(A)and sample(B)

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取芥芬胺和藜蘆胺對照品適量至5 mL的容量瓶中，分別以甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的對照品溶液，4℃冰箱儲存備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取藜蘆粗粉（過2號篩）10 g，加入80%乙醇150 mL，加熱回流提取2 h，回流提取2次，兩次藥液合并，4℃冰箱儲存備用。

2.1.4 線性關系考察 精確量取“2.1.2”項下對照品溶液適量，以甲醇稀釋至分別含有芥芬胺和藜蘆胺500μg/mL的混合對照溶液，將此溶液用甲醇依次稀釋 2、2.5、2、2、2.5、2、2、5 倍得 9 個不同濃度的溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，以待測物峰面積（Y）為縱坐標，待測物的濃度（X）為橫坐標，得芥芬胺峰、藜蘆胺面積與濃度的線性關系分別為Y=23.102X-15.653，r2=0.999 1，0.5～500 μg/mL；Y=70.769X+139.630，r2=0.9992，0.5～500μg/mL。表明各成分線性關系良好。

2.1.5 精密度實驗 精密吸取“2.1.4”項下混合對照品溶液適量，以甲醇稀釋5倍后按“2.1.1”項下色譜條件測定連續進樣測定6次，相對標準差（RSD）值分別為3.9%和2.2%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性實驗 精密吸取“2.1.3”項下供試品溶液適量，按“2.1.1”項下方法于 0、3、6、12、24 h 測定芥芬胺和藜蘆胺峰面積，24 h內RSD值分別為1.1%和1.0%，表明供試品溶液在24h內穩定性良好。

2.1.7 重復性實驗 精密稱取藜蘆粗粉6份，每份10 g，以“2.1.3”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.1.1”項下方法測定芥芬胺和藜蘆胺的含量，RSD值分別為2.8%和1.4%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率 精密稱取藜蘆粗粉6份，每份5 g，分別準確加入一定量的芥芬胺和藜蘆胺對照品溶液，再加入80%乙醇至150 mL，按“2.1.3”項下方法制備并測定，計算芥芬胺和藜蘆胺平均回收率分別為103.0%和98.8%，RSD為1.5%和2.7%。

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇體積分數 精密稱取藜蘆樣品10 g，共4份，分別加入體積分數為50%、60%、70%、80%的乙醇，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1.1”項下色譜條件測定芥芬胺和藜蘆胺含量。結果見圖2 A，乙醇體積分數為60%時，芥芬胺含量最高，體積分數為70%時，藜蘆胺含量最高，且芥芬胺含量未明顯下降，故確定乙醇體積分數為60%、70%、80%。

2.2.2 液料比 精密稱取藜蘆樣品10 g，共4份，分別加入提取溶液使得液料比為 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1.1”項下色譜條件測定芥芬胺和藜蘆胺含量。結果見圖2 B，液料比為20∶1時，藜蘆胺含量最高，芥芬胺含量較高，且兩者的含量總和最高，故確定液料比為10∶1、15∶1、20∶1。

2.2.3 提取時間 精密稱取藜蘆樣品10 g，共4份，提取時間分別為 1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1.1”項下色譜條件測定芥芬胺和藜蘆胺含量。結果見圖2 C，提取時間為1 h時芥芬胺與藜蘆胺的提取含量總和最高，故確定提取時間為 1 h、1.5 h、2 h。

2.2.4 提取次數 精密稱取藜蘆樣品10 g，共3份，提取次數分別為 1、2、3次，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定芥芬胺和藜蘆胺含量。結果見圖2D，提取次數為3次時，芥芬胺和藜蘆胺的提取效果最好，故確定提取次數為1、2、3次。

圖2 乙醇體積分數（A）、液料比（B）、提取時間（C）和提取次數（D）對提取效果的影響Fig.2 Effects of ethanol volume fraction(A)，liquid-to-solid ratio(B)，extraction time(C)and extraction times(D)on extraction effect

2.3 建立JMP實驗設計模型

2.3.1 模型設計 基于單因素實驗結果，采用JMP軟件4因素3水平的定制設計篩選藜蘆芥芬胺和藜蘆胺含量的影響因素，因素水平設置見表1。

表1 定制設計實驗因素水平值Tab.1 Values of different factors investigated with custom design experiment

2.3.2 預測結果 JMP軟件設計出具有數據分析意義的實驗列表，并對響應值進行模擬，模擬結果見表2。結果表明，該模型預測A1B3C3D3實驗條件下響應值最高，即乙醇體積分數60%，提取次數3次，提取時間2 h，液料比20∶1工藝條件下提取的芥芬胺與藜蘆胺總量最高。

表2 實驗條件表及模擬響應值Tab.2 Conditions in the experiments and values of simulated response

2.3.3 數據處理及模型擬合 應用JMP軟件對表2中的結果進行最小二乘法擬合分析，根據P值找出影響響應值的關鍵因素，P＜0．05為差異有統計學意義，結果見表3。由表3可知乙醇體積分數、提取次數、提取時間、液料比P值均大于0．05，表明4種因素均對提取工藝有影響，但并非影響提取含量的關鍵因素，模型預測結果需進一步驗證。驗設計模型所得結果一致。

表3 提取工藝篩選擬合分析效應匯總Tab.3 Summary of effects of fitting analysis in extraction process screening

極差 RB＞RC＞RA＞RD，即影響藜蘆提取物中芥芬胺和藜蘆胺含量的主次因素為提取次數＞提取時

2.4 正交實驗 根據單因素實驗結果，在乙醇體積分數、液料比、提取時間、提取次數4因素下分別設置3水平，以芥芬胺和藜蘆胺含量為考察指標進行L9（34）正交實驗，確定最佳提取工藝條件。因素水平設計見表1。按照表1進行4因素3水平正交實驗，實驗結果見表4。提取工藝最優參數與JMP軟件實間＞乙醇濃度＞液料比，其結果與方差分析結果一致，見表5。根據均值進行分析可得出藜蘆提取的最佳工藝條件為A2B3C3D2，即乙醇體積分數70%，提取次數 3次，提取時間 2 h，液料比15∶1。

表4 正交實驗結果Tab.4 Results of orthogonal experimental

表5 正交實驗結果方差分析Tab.5 Analysis of variance of orthogonal experiment results

2.5 驗證實驗 精密稱取藜蘆樣品3份，每份10 g，置入250mL圓底燒瓶中，按優化工藝進行驗證實驗，即加入70%乙醇150 mL，回流提取3次，每次2 h，合并濾液后放置室溫，補足失重，取上清液經0．45 μm有機微孔濾膜過濾后按“2．1．1”項下色譜條件測定，結果顯示芥芬胺和藜蘆胺含量的平均值分別為1．60、2．98 mg/g，RSD 分別為 1．0%、1．1%。結果表明該工藝穩定可行。

2.6 等高線圖分析 采用JMP軟件對正交實驗結果以標準最小二乘法回歸分析，分析結果見表6，參數估計值見表7，模型與正交實驗方差分析結果一致，表明正交實驗結果真實有效[23]。利用JMP軟件在完成回歸方程模型的基礎上，借助等高線圖直觀反映各因素變化對考察指標的影響情況。本研究4種因素兩兩交互作用對芥芬胺、藜蘆胺提取總含量的交互影響情況如圖3所示。等高線圖將變量描繪在二維圖表中，橫縱坐標分別代表各自變量，等高線顏色指示含量與該關系的符合程度。圖3中顯示本研究中各因素兩兩之間的相關性較弱，當其中1項變化時，另一項并不會隨之變化[24]，該結論提示正交實驗結果有效，所確定工藝為最優提取工藝。

圖3 各因素對芥芬胺、藜蘆胺提取總含量的交互影響Fig.3 Interaction effects of various factors on the total content of Jervine and Veratramine extracted

表6 模型方差分析結果Tab.6 Outcomes of model by analysis of variance

表7 模型參數估計值Tab.7 Estimated values of model parameters

3 討論

藜蘆是中國傳統中藥，其化學成分復雜，包括生物堿類、黃酮類、二萜類、茋類等，具有多種藥效[2-8]。芥芬胺與藜蘆胺為藜蘆中主要生物堿型化合物，具有阻斷聲波刺猬（Shh）信號通路[25]、信號轉導抑制作用，是藜蘆發揮藥效作用的物質基礎。

常用的生物堿提取方法有酸水提取法、親脂性有機溶劑提取法、醇類溶劑提取法、超聲提取法、酶提取法等。由于酸水提取法腐蝕性和成鹽損耗大、親脂性有機溶劑毒性高、超聲或酶提取法造價高等缺陷，尚未廣泛應用于大規模生產，乙醇提取法具有工藝簡單、經濟便捷、效率高等優點廣受廠家青睞，因此本實驗選用乙醇提取法。

為降低藥效成分在生產過程中的損耗、優化提取效率、增強藥效，實驗在單因素控制條件下，共考察了影響芥芬胺和藜蘆胺提取的4個因素：乙醇體積分數、提取時間、提取次數、液料比。同時分別設置了3水平，進行正交實驗。根據正交實驗結果得知，工藝為乙醇體積分數為70%，液料比為15∶1，提取3次，每次2 h，芥芬胺與藜蘆胺含量最高，可達1．60、2．98 mg/g。同樣可由表中數據得知，影響藜蘆提取物中含量的主次因素為提取次數＞提取時間＞乙醇濃度＞液料比。運用JMP軟件定制設計實驗模型，并對正交實驗結果以標準最小二乘法回歸分析，模型結果與正交實驗結果一致，表明正交實驗結果真實有效。同時在此基礎上，借助等高線圖直觀反映各因素變化對考察指標的影響情況，全面立體地篩選最佳提取工藝。實驗提取得到的芥芬胺與藜蘆胺含量較高，工藝穩定，可為藜蘆的進一步開發研究提供理論依據。