基于動物實驗和網絡藥理學研究艾納香對急性肝損傷保護作用機制

關寧寧，黃涌澤，陳玥，白宏羽，宋彬彬，黃火強

（中央民族大學藥學院，民族醫藥教育部重點實驗室，北京 100081）

肝臟是人類重要的代謝和解毒器官，急性肝損傷（ALI）以患者的功能性肝細胞迅速損害為特征，藥物中毒、病毒感染、免疫反應和代謝紊亂等多種因素均可引發肝臟的病變[1]，但是目前臨床治療手段和干預效果較差，病死率較高[2]。近年來中藥在治療ALI方面取得一定成果，其主要作用機制包括抑制體內氧化應激和炎癥反應及肝細胞纖維化和肝細胞凋亡[3]。

艾納香[Blumea balsamifera（L）DC．]是菊科艾納香屬多年生草本植物，歸肝、脾經，具有清熱解毒、祛風除濕、活血消腫、消炎鎮痛等功效，是中國常用中藥和民族藥，在少數民族地區有著悠久的入藥歷史。彝族人民常用其治療頭風頭痛、風濕痹病；藏族稱其治一切熱病；基諾族用其根葉治療肝炎。現代研究表明艾納香具有抗腫瘤、鎮痛、消炎等多種藥理活性[4]，能夠抑制脂質過氧化、清除自由基，有明顯的抗氧化作用，對于肝損傷具有保護作用[5-6]，但是其作用機制不清楚、藥效物質基礎不明確，有待深入研究。

網絡藥理學作為藥理學的分支學科，其通過建立藥物與病證的關聯機制，為中醫藥的研究提供了系統性的思路和方法。研究基于動物實驗和網絡藥理學驗證艾納香對ALI的保護作用，探討艾納香對于ALI的保護機制和藥效關鍵成分，以期為艾納香治療ALI的進一步研究提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 昆明小鼠，SPF級，雄性，8周齡，體質量（22±2）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。通過中央民族大學實驗動物倫理委員會批準，飼養于中央民族大學藥學院實驗動物中心。每日12 h照明，環境溫度為（25±2）℃。實驗前適應性喂養5 d，自由飲食水。

1.2 藥品、試劑與儀器 艾納香藥材購買自河北安國藥材市場，陽性藥水飛薊賓（批號D0916A）購自大連美侖生物技術有限公司；谷丙轉氨酶（ALT，批號 20211223），谷草轉氨酶（AST，批號 20211222）試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；四氯化碳（CCl4分析純，批號20211120）購自利安隆博華（天津）醫藥化學有限公司，使用時用花生油配制成0.2%的花生油溶液。Epoch Biotek全波長酶標儀（美國Biotek公司），ST 16R高速離心機（美國Thermo Fisher公司）。

1.3 數據庫及軟件 網絡藥理學以及分子對接涉及的主要數據庫及軟件有 TCMSP（https：//www.tcmsp-e.com/）、Uniport數據庫（https：//www.uniprot.org/）、PubChem 數 據 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、SwissADME平臺（http：//www.swissadme.ch/）、GeneCards（http：//www.genecards.org/）、OMMI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）、String 數據庫（https：//www.string-db.org/）、PDB 數 據 庫（http：//www.rcsb.org/）和 Metascape 平臺（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）、Cytoscape3.8.2 軟件、Autodock4.2軟件、Pymol 2.5軟件。

2 方法

2.1 動物分組、給藥及造模 健康雄性小鼠隨機分為對照組、模型組、陽性藥組（100 mg/kg）、水提物組和醇物提組（生藥14.32 g/kg）。各組按照體質量灌胃給藥，連續12 d。第12次給藥2 h后，除對照組腹腔注射花生油外，其余各組腹腔注射0.2%CCl4花生油溶液（10 mL/kg）建立急性肝損傷模型，12 h禁食不禁水。24 h后稱量體質量，摘除眼球取血，頸椎脫臼處死，剝離肝臟用生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分后稱質量并計算肝臟指數。

2.2 指標檢測 血清室溫靜置1 h后，4 500 r/min離心10 min，離心半徑為6.75 cm，吸取上清液，按照生化試劑盒說明書分別對血清中ALT、AST水平進行檢測。

2.3 艾納香活性成分篩選和靶點預測 通過TCMSP、HERB數據庫和文獻檢索獲得艾納香的化學成分，通過PubChem化學結構數據庫（https：//pubchem.ncbi.nl-m.nih.gov/）確認檢索所得化合物相關信息。借助SwissADME平臺（http：//www.swissadme.ch/）進行篩選，選取胃腸吸收（Pharmacokinetics-GIabsorption）為“High”且成藥性（Druglikeness）至少滿足兩個“Yes”的成分作為潛在活性成分。利用潛在活性成分的SMILES號在SwissTargetPrediction 平臺（http：//swisstargetprediction.ch/）進行檢索，獲得活性成分相關基因靶點。

2.4 ALI相關靶點的篩選 以“acute liver injury”、“acute liver damage”“acute hepatotoxicity”為關鍵詞在GeneCards（http：//www.genecards.org/）、OMIM 數據庫（http：//www.omim.org）數據庫進行檢索，獲得疾病相關基因，對所獲得的靶點信息進行合并去重，獲得ALI相關靶點。

2.5 艾納香治療ALI潛在靶點預測 將活性成分靶點和疾病靶點導入 Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中進行可視化處理，得到交集靶點即為艾納香治療ALI的潛在靶點。

2.6 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建 將所得的交集靶點導入 String數據庫（https：//string-db.org/），隱藏其中的游離節點，獲得蛋白互作網絡圖，借助Cytoscape3.9.1軟件進行PPI網絡的可視化處理。使用Cytoscape3.9.1軟件中的CytoHubba插件對數據進行拓撲分析獲得hub基因，即核心靶點基因。

2.7 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡構建 將艾納香活性成分和疾病靶點導入Cytoscape軟件中構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡。網絡中活性成分和靶點用節點表示，節點之間的相互作用用邊表示。結合所得核心基因根據網絡度值分析篩選艾納香發揮治療作用的關鍵成分。

2.8 GO和KEGG通路富集分析 借助Metascape平臺（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），對交集靶點進行基因本體（GO）分析，包括生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞組成（CC），以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。

2.9 分子對接 將篩選所得關鍵成分和核心靶點進行分子對接。通過RCSB數據庫（https：//www.rcsb.org/）和Pubchem數據庫檢索獲得核心靶點和關鍵成分的三維蛋白結構。借助AutoDock1.5.7軟件，進行分子對接，結果選取結合能最低且構象較好的結合方式，通過PyMOL軟件進行可視化。

2.10 統計學方法 采用Graph Pad Prism8軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組數據間的兩兩比較采用單因素方差分析和LSD方法，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0．05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 艾納香對ALI小鼠肝臟指數及血清ALT、AST活性的影響 與正常組相比，模型組小鼠肝臟指數和血清ALT、AST活性顯著升高，表明其肝臟組織發生病變；與模型組相比，艾納香水提物組和醇提物組均可降低肝臟指數及ALT、AST的水平，其中水提物組對于肝臟指數和ALT水平的影響較醇提物顯著。見圖1。

圖1 艾納香提取物對小鼠肝臟指數（A）、ALT（B）、AST（C）的影響Fig.1 Effect of Blumea balsamifera extract on liver index(A)，ALT(B)，AST(C)in mice

3.2 艾納香活性成分篩選 通過數據庫和文獻檢索共獲得85種化合物，經SwissADME篩選后獲得36種活性成分。見表1。

表1 艾納香活性成分Tab.1 Active compounds of Blumea balsamifera

3.3 艾納香治療ALI潛在靶點預測 活性成分于SwissTargetPrediction平臺進行靶點預測，獲得活性成分靶點445個，GeneCards、OMIM數據庫檢索得到疾病靶點1 761個。繪制韋恩圖，得到171個艾納香潛在治療靶點。見圖2。

圖2 艾納香治療ALI潛在靶點Fig.2 Potential targets of Blumea balsamifera in the treatment of ALI

3.4 PPI網絡分析 PPI圖中節點表示各個靶點，連線表示互相作用，涉及170個節點，2 773條邊，節點越大，顏色越深，度值越大，即該靶點的相互作用越強，在網絡中的作用越關鍵。以CytoHubba插件中的Degree值作為條件對PPI中的靶點進行篩選，選取排名前十的基因為絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT1）、血管內皮生長因子 A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體（ESR1）、半胱氨酸蛋白酶（CASP3）、白細胞介素-1β（IL-1β）、為熱休克蛋白90α家族A級成員1（HSP90AA1）、缺氧誘導因子 1（HIF1A）、絲裂原活化蛋白激酶 3（MAPK3）、原癌基因酪氨酸激酶（SRC）作為本次研究的核心基因。見圖3。

圖3 交集靶點PPI網絡Fig.3 PPI network of intersection targets

3.5 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡構建 將交集靶點導入Cytoscape軟件構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡圖。根據網絡屬性可知其中和核心靶點相關且度值排名前十的化合物為羥基芫花素（3-hydroxygenkwanin）、木犀草素（Luteolin）、山奈酚（Kaempferol）、芫花素（5，4'dihydroxy-7-methoxyflavone）、華良姜素（kumatakenin）、槲皮素-3，3＇-二甲醚 （Quercetin 3，3'-dimethyl etheh）、金圣草素（Chrysoeriol）、香葉木素（Diosmetin）、圣草酚（Eriodictyol）、5，3'-二羥基-7，4'-二甲氧基黃酮（Pilloin），表示此10種成分在治療ALI中發揮重要作用。見圖4。

圖4 藥物-活性成分-靶點-疾病網絡圖Fig.4 Drug-component-traget-disease network

3.6 GO和KEGG富集分析 借助Metascape平臺對作用靶點進行GO功能分析和KEGG通路富集。根據富集程度的P值由小到大選取排名前二十的條目分別進行分析。GO功能富集顯示靶點的催化主要涉及蛋白磷酸化、氮化合物的細胞反應、細胞遷移的正向調節、激酶活性的調節等生物過程。這些靶點主要影響膜筏、核周圍胞漿、受體復合物等細胞組分。并且影響蛋白激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、磷酸轉移酶活性等分子功能。KEGG富集氣泡圖顯示艾納香主要影響癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的微小RNA、脂質和動脈粥樣硬化、絲裂原活化蛋白激酶信號通路，表明艾納香治療ALI的信號通路主要與炎癥反應、免疫反應相關。見圖5、圖6。

圖5 艾納香治療ALI的GO功能分析Fig.5 GO function analysis of Blumea balsamifera in the treatment of ALI

圖6 KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway of Blumea balsamifera in the treatment of ALI

3.7 分子對接驗證 分子對接結果顯示，關鍵成分和核心靶點均能有效結合。其中核心靶點AKT1與其部分關鍵成分的對接結果，見圖7。

圖7 AKT1與關鍵成分分子對接模式圖Fig.7 Docking mode between traget AKT1 and key components

4 討論

CCl4誘導的ALI模型已廣泛用于肝保護藥物的研究中[7]，其主要是通過CCl4代謝產物產生的自由基引起氧化應激反應導致肝細胞膜被破壞。在肝損傷發生過程中，血清中ALT和AST的活性會升高，因此，血清ALT和AST活性被用作肝損傷的生化標志物[8]。研究中動物實驗結果表明，與模型組相比，艾納香提取物能夠降低小鼠血清中ALT、AST活性，差異具有統計學意義（P＜0．05），提示艾納香能夠有效保護肝細胞，治療CCl4引起的急性肝損傷。

“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡表明羥基芫花素、木犀草素、山奈酚、芫花素、華良姜素、槲皮素-3，3＇-二甲醚、金圣草素、香葉木素、圣草酚、5，3'-二羥基-7，4'-二甲氧基黃酮等10種化合物是艾納香治療ALI的關鍵成分。研究表明羥基芫花素、華良姜素、圣草酚可抑制肝癌細胞的增殖，誘導其凋亡[9-11]。木犀草素、山奈酚、槲皮素-3，3＇-二甲醚、金圣草素能夠提高抗氧化酶的活性，清除自由基，減輕脂質過氧化，對肝組織產生保護作用[12-15]；芫花素和5，3'-二羥基-7，4'-二甲氧基黃酮能顯著降低炎癥介質的水平[16]；香葉木素能夠抑制肝臟脂肪生成和炎癥反應[17]。

根據PPI網絡圖得到10個核心靶點AKT1、VEGFA、EGFR、ESR1、CASP3、IL1B、HSP90AA1、HIF1A、MAPK3、SRC。研究發現AKT1是肝癌發生的重要靶點，慢病毒介導Akt1 shRNA載體可抑制HepG2細胞增殖和侵襲，并促進其凋亡，可作為肝癌的潛在治療靶點[18]；VEGFA在肝細胞再生和酒精性肝損傷、肝炎的治療中發揮重要作用[19]；EGFR通過激活后的p-EGFR調控ERK/MAPK下游信號通路，進而調控人肝癌細胞的增殖[20]。ESR1通過下調mt的轉錄水平抑制人肝癌細胞的增殖和侵襲[21]；研究表明可通過對CASP3的抑制來減輕酒精性肝損傷[22]；IL1B是一種高效促炎細胞因子，可介導炎癥疾病的發生[23]，參與許多炎癥反應，如心肌梗塞、酒精性脂肪肝、類風濕性關節炎等；HSP90AA1具有抗肝纖維化作用和潛在的保肝作用[24]；HIF1A與肝組織中的氧化應激密切相關，且可通過激活PPAR-αangptl4信號通路參與非酒精性脂肪肝病中的脂質代謝調節[25]；MAPK3可促使炎癥因子IL-13表達，進而加劇炎癥反應，且相關研究表明可通過靶向MAPK信號通路抑制人肝癌細胞的轉移[26]；Src家族蛋白激酶在生長、增殖、免疫調節等多種細胞功能中發揮重要作用[27]。分子對接結果顯示，核心靶點與關鍵成分均可自發結合，其中AKT1與關鍵成分的關聯程度最高，提示AKT1在艾納香治療ALI過程中的作用尤為重要。

KEGG富集主要涉及的通路有癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的miRNA、脂質和動脈粥樣硬化、MAPK信號通路等。其中PI3K-Akt通路參與調節細胞周期、細胞增殖、凋亡、代謝和血管生成，研究表明PI3K-Akt信號通路在ALI的防治中具有重要意義，如張華等[28]研究發現AcO-BOA可以抑制AKT的磷酸化，抑制PI3K-Akt信號通路，降低LPS所引起的炎癥反應，對ALI起到防治作用。MAPKs信號通路是調節和控制細胞炎癥反應的關鍵途徑，誘導下游凋亡蛋白包括Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達，在肝臟損傷、應激、細胞凋亡等方面起著重要調節作用[29]。馬志梅等[30]發現AO-I可通過調控MAPK信號通路進而改善NF-κB p65介導的炎癥因子水平，從而減輕對乙酰氨基酚誘導的肝毒性。

綜上所述，本研究通過動物實驗初步探究艾納香對急性肝損傷小鼠的保護作用，并運用網絡藥理學方法系統討論了其作用機制，提示艾納香可能通過作用于AKT1、VEGFA、EGFR等多個靶點，參與調控癌癥、PI3K-Akt等多條通路發揮其對急性肝損傷的保護作用。網絡藥理學方法可以定性地預測藥物成分與作用靶點的匹配關系，但不能準確反映成分與靶點相互作用的量效關系、相互作用類型等信息，故本研究后續應該對網絡藥理學篩選出的潛在活性成分和作用靶點進行體內外實驗驗證，進一步確證和闡明中藥艾納香發揮急性肝損傷保護作用的有效成分和藥理作用機制。