西昌某奶牛場乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗

楊克利，周美琪，張濤，鄒宏，何曉露，韋漢群，張文麗，郝桂英*

（1.西昌學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615013；2.涼山彝族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川 西昌 615000；3.西昌市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 西昌 615000）

0 引言

奶牛乳房炎（bovine mastitis）是奶牛乳腺組織受到物理、化學(xué)因素刺激或病原微生物感染后發(fā)生的炎癥反應(yīng)，是奶牛常見的一種多發(fā)性疾病。該病可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降，影響乳制品品質(zhì)，嚴(yán)重時可使奶牛泌乳機(jī)能喪失，最終使患牛淘汰，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。

引起奶牛乳房炎的病原菌達(dá)150余種，其中肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumonia）是腸桿菌科、克雷伯菌屬中常見的致奶牛乳房炎環(huán)境病原菌之一，其引發(fā)的乳房炎癥狀尤為嚴(yán)重，具有發(fā)病急、死淘率高、產(chǎn)奶量大幅下降、抗生素治療效果不佳等特點［2］。我國黑龍江、遼寧、山東、河南［3］、甘肅［4］、寧夏［5］、江蘇［6］、陜西［7］、上海［8］、廣東、安徽、山西、浙江［9］、河北［10］、內(nèi)蒙古［11］、四川［12］、湖北［13］、云南［14］和湖南［15］多地均有從奶牛乳房炎病例或生牛乳中分離到該菌的報道，并且其造成的全身性感染甚至可以導(dǎo)致奶牛的急性死亡［16］。因此，肺炎克雷伯菌引起的動物感染及其潛在的公共衛(wèi)生安全危害引起了科研人員越來越多的關(guān)注。

2023年4月，四川省涼山彝族自治州西昌市某奶牛場有3頭奶牛在產(chǎn)后7 d內(nèi)出現(xiàn)了以乳房炎為主要特征的癥狀，病牛精神沉郁、喜臥、體溫升高、食欲不佳、呼吸加快、流少量濃稠鼻涕、排淡黃色稀便。觸摸其乳房有硬塊，乳房或乳頭腫脹，乳汁呈水樣，部分乳中帶血。癥狀嚴(yán)重的1頭奶牛在發(fā)病第2 天死亡。對死亡奶牛進(jìn)行剖檢，可見肺臟、肋胸膜出血，肝臟、脾臟出血，真胃黏膜、腸黏膜出血，空腸有水樣黃色內(nèi)容物。為查明導(dǎo)致該病發(fā)生的主要致病菌，本研究對該奶牛場發(fā)病未死亡的2頭奶牛的乳樣進(jìn)行了細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定、藥敏試驗等，以期為該奶牛場科學(xué)防治奶牛乳房炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 乳樣

采集西昌某奶牛場經(jīng)臨床診斷為乳房炎的奶牛乳樣2份。清洗消毒病牛乳頭，棄去前3把奶，采集20~30 mL乳汁于滅菌離心管中，標(biāo)記好采樣日期、牛號后置于帶冰盒的采樣箱內(nèi)，迅速帶回實驗室4 ℃保存，24 h內(nèi)分別進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、革蘭氏染色試劑均購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌微量生化管、藥敏紙片（恩諾沙星、諾氟沙星、紅霉素、頭孢比肟、頭孢他啶、妥布霉素、氨芐西林、慶大霉素、阿莫西林和新霉素）均購自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；2×Easy Taq PCR Super Mix、Trans2K DNA Marker、GelStain核酸染料購自北京全式金生物科技有限公司。

主要儀器：超凈工作臺（SJ-CJ-2D型，蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（5810R，eppendorf）；PCR儀（Nexus GSX，eppendorf）；凝膠成像系統(tǒng)（Molecular Imager?Gel DocTMXR+，BIORAD）；核酸電泳儀（JY600E，北京君意電泳儀科技有限公司）；恒溫生化培養(yǎng)箱（LRH-250，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；顯微鏡（Motic BA200，麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司）。

1.3 實驗動物

體質(zhì)量15~20 g的小白鼠8只，供致病性試驗使用。

1.4 細(xì)菌的分離純化

將1.1采集的2份待檢乳樣在超凈工作臺中分別取1 000 μL到滅菌的EP管中，8 000 r/min離心3 min，棄去上層800 μL液體，將剩余的乳液混勻后，吸取上述混懸液分別接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況［7］。挑取疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)及染色特性；然后挑取疑似單菌落接種于營養(yǎng)肉湯中純化培養(yǎng)。

1.5 生化鑒定

將純化培養(yǎng)后的菌液分別接種于葡萄糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、硫化氫、尿素、枸櫞酸鹽、尿素酶生化管以及氧化酶試紙，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其生化反應(yīng)特性［13］。

1.6 分子生物學(xué)鑒定

1.6.1 細(xì)菌DNA的提取

無菌條件下吸取1.4中純化培養(yǎng)的菌液1 mL，10 000 r/min離心1 min，棄去上清液，參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA。

1.6.2 PCR檢測及送檢測序

先用khe基因特異性引物［5］進(jìn)行PCR檢測，再用細(xì)菌16S rRNA通用引物對有目的條帶的陽性菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

khe基因引物序列分別為khe-F：5'-ATG AAA CGA CCT GAT TGC ATT CGC-3'，khe-R：5'-TTA CTT TTC CGC GGC TTA CCG TC-3'。16S rRNA通用引物序列分別為：27F：5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'，1492R：5'- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。引物序列均由生工生物工程（成都）股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)條件：（1）khe基因：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性25 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。目的條帶約480 bp。（2）16S rRNA基因：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。目的片段約1 500 bp。ddH2O作陰性對照。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，待電泳結(jié)束后，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。將PCR陽性產(chǎn)物送生工生物工程（成都）股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.6.3 序列分析

通過BLAST軟件比對確定待測細(xì)菌，同時檢索GenBank收錄的肺炎克雷伯菌khe基因序列和肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌（Klebsiellaoxytoca）與大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）16S rRNA基因序列并下載，用DNAstar中的MegAlign程序進(jìn)行序列同源性分析。

1.7 藥敏試驗

采用K-B瓊脂平板擴(kuò)散法對分離純化的菌株進(jìn)行藥敏試驗。將純化培養(yǎng)的菌液加到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上并涂布均勻，在超凈工作臺內(nèi)晾2 min后，用鑷子無菌取藥敏紙片放置在涂布好細(xì)菌的培養(yǎng)基上，不同紙片相距15~20 mm。37 ℃培養(yǎng)24 h后用直尺測量抑菌圈的直徑，記錄數(shù)據(jù)。

依據(jù)馬越等［17］的報道結(jié)果判定分離菌對抗菌藥物的敏感性：抑制圈>15 mm為高度敏感（S）；抑制圈10~15 mm為中度敏感（I）；抑制圈<10 mm為耐藥（R）。

1.8 小鼠致病性試驗

將分離純化的菌株菌液濃度調(diào)節(jié)約為1×108CFU/mL，每株菌接種4只小白鼠，腹腔注射0.2 mL/只，對照組小白鼠接種營養(yǎng)肉湯0.2 mL/只。每天觀察小鼠的臨床癥狀，記錄死亡數(shù)，72 h后處死全部存活小鼠。無菌采集心臟、肝臟、脾臟用于分離細(xì)菌，對分離菌進(jìn)行染色、鏡檢、生化試驗，并使用肺炎克雷伯菌khe基因特異性引物進(jìn)行分子鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 肺炎克雷伯菌的菌落形態(tài)

從2份乳樣中分離到1株疑似肺炎克雷伯菌菌株，命名為XC1分離菌株。菌株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成粉紅色、圓形、光滑、邊緣整齊、濕潤、黏稠的菌落（圖1），用接種環(huán)挑取菌落有明顯的拉絲現(xiàn)象，與高興等［18］報道的肺炎克雷伯菌菌落形態(tài)相似。

圖1 麥康凱培養(yǎng)基上的菌落

2.2 肺炎克雷伯菌的菌體形態(tài)

鏡檢菌體為革蘭氏陰性的粗短桿菌，呈單個、成對或短鏈狀排列（圖2），與田維嘉［19］報道的肺炎克雷伯菌菌體形態(tài)相似。

圖2 革蘭氏染色的菌體（×1 000倍）

2.3 肺炎克雷伯菌的生化鑒定

分離菌株發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖和甘露醇，產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣；分解尿素；不產(chǎn)生硫化氫；枸櫞酸鹽、氧化酶陰性；尿素酶陽性。與劉冬霞［20］報道的肺炎克雷伯菌生化結(jié)果基本一致。

2.4 肺炎克雷伯菌的分子生物學(xué)鑒定

電泳結(jié)果顯示，XC1分離菌株可擴(kuò)增出khe基因目的條帶，與預(yù)期目的片段大小基本一致（圖3）。

圖3 肺炎克雷伯菌khe基因PCR電泳結(jié)果

XC1分離菌株及接種小白鼠心臟中分離的菌液（XC1-1菌液）、肝臟中分離的菌液（XC1-2菌液）、脾臟中分離的菌液（XC1-3菌液）的khe基因測序序列長度均為454 bp，核苷酸同源性為100%，與肺炎克雷伯菌參考序列同源性為99.6%~99.8%（圖4）；XC1分離菌株16S rRNA基因測序序列長度為1 411 bp，與肺炎克雷伯菌參考序列同源性為99.7%~100%，與產(chǎn)酸克雷伯菌（K.oxytoca）參考序列同源性為97.1%~98.1%，與大腸埃希氏菌（E.coli）參考序列同源性為96.5%（圖5）。因此，khe基因和16S rRNA基因均確定XC1分離菌株為肺炎克雷伯菌。

圖4 肺炎克雷伯菌khe基因序列同源性比對結(jié)果

圖5 肺炎克雷伯菌16S rRNA基因序列同源性比對結(jié)果

2.5 藥敏試驗結(jié)果

XC1分離菌株對恩諾沙星、諾氟沙星、頭孢比肟和頭孢他啶高度敏感；對妥布霉素、慶大霉素和新霉素中度敏感；對紅霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥（表1）。

表1 藥敏試驗結(jié)果

2.6 小鼠致病性試驗

XC1分離菌株組小白鼠在接種第1天出現(xiàn)精神沉郁、蜷縮一角；第2天出現(xiàn)腹瀉、排血便；第3天全部死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)死亡小白鼠胸腔有積液，肝臟出血，腸臌氣，直腸末端有血液。對照組小白鼠精神正常，全部存活。剖檢無明顯病變。

感染小鼠心臟、肝臟、脾臟等組織中分離的細(xì)菌為革蘭氏陰性、較粗短的直桿菌，生化試驗結(jié)果與XC1分離菌株一致，PCR檢測均在約480 bp處出現(xiàn)特異性條帶（圖3）。對照組未分離出細(xì)菌。小鼠致病性試驗表明XC1分離菌株具有較強(qiáng)的毒力。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

牛群品種、飼養(yǎng)管理、地域環(huán)境、季節(jié)氣候等的不同，會影響奶牛乳房炎的發(fā)生率以及病原菌種類。肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）作為我國常見的奶牛乳房炎環(huán)境性致病革蘭氏陰性菌之一，不同地方分離率有差異。Gao等［3］報道黑龍江、遼寧、河北、山東、河南、天津、北京等21省161個大型奶牛場（>500頭）K.pneumoniae平均分離率為13.0%；馮小慧等［8］報道上海和河北患病牛乳K.pneumoniae分離率分別為18%（18/100）和14%（14/100）；曹菲菲等［9］報道福建、江蘇、廣州、河北、安徽、山西、內(nèi)蒙古、浙江等地區(qū)的11個規(guī)模化牧場K.pneumoniae平均分離率為14.55%（119/818）；Gao等［21］報道我國13省123個奶牛場臨床型乳房炎奶樣K.pneumoniae平均分離率為51.5%（124/241）；He等［22］報道山東、黑龍江和河北3家規(guī)模化奶牛場臨床型乳房炎奶樣K.pneumoniae平均分離率為2.9%（183/6301）；石玉祥等［10］報道河北某大規(guī)模奶牛場K.pneumoniae分離率為18.4%（45/245）；Cheng等［23］報道中國南北部2個奶牛場K.pneumoniae平均分離率為27.0%（365/1 354）；Yang等［24］報道江蘇、山東生乳K.pneumoniae分離率分別為7.8%（65/830）和0.4%（1/233）；吳香云［13］報道湖北省5個奶牛場K.pneumoniae平均分離率為26.9%（239/887），臨床乳房炎和隱性乳房炎牛乳K.pneumoniae分離率分別為25.4%（35/138）和24.5%（12/49）；高興等［18］報道全國大型規(guī)模化牧場乳房炎奶樣K.pneumoniae分離率約11%（212/2 000），說明全國各地奶牛場的衛(wèi)生防護(hù)措施參差不齊。

奶源安全問題是食品安全問題的重中之重，受到人們的廣泛關(guān)注。乳汁微生物鑒定常被認(rèn)為是乳房炎診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但肺炎克雷伯菌與大腸埃希氏菌形態(tài)相似，難以區(qū)別。由于khe基因只在肺炎克雷伯菌中檢出，因此，khe基因可作鑒定該菌的特異性基因［5］。16S rRNA基因由于片段大小適中，能體現(xiàn)出不同種屬細(xì)菌間的差別，現(xiàn)常應(yīng)用于細(xì)菌分類鑒定。因此，本試驗通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、分子生物學(xué)鑒定、小鼠致病性試驗等對分離菌株進(jìn)行鑒定，確定該場奶牛乳房炎與肺炎克雷伯菌感染有關(guān)，這與張明國等［25］、周國燕等［12，26］的研究結(jié)果不完全一致，這些研究認(rèn)為葡萄球菌為涼山州奶牛乳房炎優(yōu)勢菌。藥敏試驗結(jié)果顯示，XC1分離菌株對頭孢比肟、恩諾沙星、諾氟沙星和頭孢他啶4種藥物敏感，對紅霉素、氨芐西林和阿莫西林3種藥物耐藥。近年來，各地區(qū)奶牛乳房炎源K.pneumoniae耐藥率和耐藥譜均存在差異，甚至出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象［27-28］。張穎欣等［2］報道國內(nèi)13省耐藥型K.pneumoniae流行率約為13.7%。曹菲菲等［9］報道分離自奶牛乳房炎的119株K.pneumoniae對氨芐西林的耐藥率達(dá)到了94.96%。He等［22］報道分離自奶牛乳房炎的183株K.pneumoniae對復(fù)方新諾明的耐藥率均在90.0%以上，顯著高于其他藥物的耐藥率（25.0%以下）；對多西環(huán)素中等耐藥（15.4%～25.0%）；對慶大霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、替加環(huán)素、阿莫西林/克拉維酸鉀和卡那霉素表現(xiàn)出較低水平耐藥（1.0%～7.7%），其中環(huán)丙沙星、替加環(huán)素、阿莫西林/克拉維酸鉀和卡那霉素維持在1.0%左右的低耐藥率，而對美羅培南和多黏菌素尚未耐藥。K.pneumoniae可產(chǎn)生水解頭孢菌素的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，且編碼基因可以通過質(zhì)粒分布在奶牛場的細(xì)菌中［29］，為臨床治療K.pneumoniae引起的奶牛乳房炎帶來困難。因此，在生產(chǎn)中應(yīng)積極開展肺炎克雷伯菌的分子流行病學(xué)調(diào)查，及時監(jiān)控該菌的流行趨勢。在臨床治療中，應(yīng)加強(qiáng)對該菌耐藥性的監(jiān)測，規(guī)范治療流程，減少抗生素的誤用和濫用，從而減少耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播，以免引起公共衛(wèi)生安全危害。

3.2 結(jié)論

本研究通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗、分子生物學(xué)方法對乳房炎乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，分離出1株肺炎克雷伯菌，命名為XC1分離菌株；小鼠致病性試驗表明XC1分離菌株具有較強(qiáng)的毒力，證明該場奶牛乳房炎與肺炎克雷伯菌感染有關(guān)。藥敏試驗結(jié)果表明XC1分離菌株對臨床常用的抗生素存在不同程度的耐藥性，其中對紅霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥。研究結(jié)果可為該奶牛場防治乳房炎提供參考。