厭氧氨氧化工藝處理不同抗生素廢水的性能比較

趙培植 ZHAO Pei-zhi；馮丹 FENG Dan；萬家秀 WAN Jia-xiu

（蘭州資源環境職業技術大學，蘭州 730021）

0 引言

現階段，雖然我國已經有效遏制了有機污染物，但是在部分水體中仍然有水體富營養化現象存在。導致這種現象出現的原因主要是因為污水處理廠處理后的污水沒有滿足相關的總氮和氨氮標準。我國在處理污水方面，隨著國家不斷提升對于出水水質的要求，傳統污水處理技術存在的也越來越突出。在這種情況下，厭氧氨氧化工藝應運而生，得到了廣泛的應用。厭氧氨氧化工藝具有低成本、高脫氮效率、少污泥產量、無須曝氣等優勢[1]。在本文中，將以污水中存在較為廣泛的OTC和SMX為研究對象，分別考察其在各種暴露時間和濃度下影響厭氧氨氧化胞外聚合物分泌、生物膜活性以及各種微生物生長情況，與在各種環境中OTC和SMX所擁有的濃度相結合，在本次研究中將使用1-1000μg/L的濃度，并且明確這兩種抗生素能夠發揮的作用，希望能夠為相關人員開展工作提供一定支持。

1 實驗設計

1.1 實驗方法 選擇兩個一致的厭氧氨氧化濾柱，隨機完成1#和2#的標注。本次研究使用的是2L體積的濾柱，水是沿著從下向上的方向穿過濾柱，持續運行。在濾柱內部只有火山巖填料，填料為7mm左右粒徑，研究中所用的水為人工配置，需要在其中加入堿度、亞氮以及氨氮，加入劑量為前者1000mg/L，后兩者50mg/L，在配制時分別使用NaHCO3、NaNO2、（NH4）SO4，并且添加MgSO4、KH2PO4、CaCl2，以及微量元素1ml/L，進水后約擁有7.8的pH，4h的HRT。在1、10、100、1000μg/L實驗濃度的抗生素中放入兩個厭氧氨氧化濾柱生物膜分別完成短期（6h）和長期（22d）暴露，完成對其EPS、微生物活性的測量。

1.2 測量活性 在開展研究時需要先明確兩個生物濾柱原有的生物膜活性，從而在后續研究中將其作為對比對象。然后兩個生物濾柱需要分別長期和短期暴露于各種濃度的抗生素中，在每次完成暴露后都需要準確測量其活性。在本次研究中的流程為：在火山巖填料中取下生物膜10mg左右，將其放在10ml的離心管中，使用人工配水連續清洗三次，然后再添入適當的人工配水，保證水位位于10mL處，在恒溫震蕩床上完成離心管放置[2]。設置25℃的反應溫度，6h的反應時間，擁有8.0的pH，取出反應始末的水樣分別完成硝氮、亞氮、氨氮的測定，完成厭氧氨氧化活性計算。同時測定三個離心管，以平均值為最終結果。

1.3 測定溶解性微生物產物和EPS在這個環節中較為重要的內容就是EPS提取：首先對生物膜樣品5ml開展離心處理，處理規范為時間15min，每分鐘8000r，進行上清液提取，并完成溶解性微生物產物（SMP）保存；在磷酸緩沖溶液中離心沉淀和懸浮，持續進行3min的40kHz超聲處理；準備80℃的水將混合物放入其中，并連續完成30min加熱，每加熱10min需要搖勻；對懸浮液進行離心處理，處理規范同生物膜樣品離心處理，通過上清液完成EPS測定，剩余物質完成污泥質量測定。在500nm波長處使用Folin-phenol法完成提取液中蛋白質（PRO）的測定，在525nm波長處使用蒽酮法完成提取液中多糖（PS）的測定[3]。

2 結果與討論

2.1 短期和長期暴露中抗生素影響厭氧氨氧化活性的情況 在不同濃度的兩種抗生素中暴露6h和22d厭氧氨氧化生物膜后得出了如表1所示的結果。當OTC抗生素并未與1#生物膜接觸時，其擁有14.6mg/（h·g SS）的SAA，而在1μg/L的OTC中完成短期暴露后，測定其擁有14.5mg/（h·g SS）的SAA，與未暴露的SAA之間只存在較小的差異，證明厭氧氨氧化生物膜在1μg/L的OTC中短期內不會受到較大影響。當1#生物膜短期暴露于10、100、1000μg/L的OTC中后，在不斷增加OTC濃度的過程中SAA分別為12.2.12.0和11.6mg/（h·g SS），SAA呈現逐漸降低的趨勢。整個結果證明，當OTC濃度在10μg/L時會在短期內嚴重抑制厭氧氨氧化生物膜（p<0.05），以此為前提在抗生素擁有越來越高濃度的過程中，雖然一直都發揮著抑制作用，但是抑制作用的強度卻使用保持在相同的范圍。由此可知，10μg/L是OTC短期抑制厭氧氨氧化的閾值。1#厭氧氨氧化濾柱在1μg/L的OTC中進行22d的長期暴露后，測定其擁有14.5mg/（h·g SS）的SAA，與短期暴露相比擁有相同的SAA值，證明在OTC濃度為1μg/L時，其對厭氧氨氧化生物膜擁有相同的長期作用和短期作用，都只會在較小程度上影響微生物活性。而在長期暴露于10μg/L的OTC中后，也能夠對厭氧氨氧化生物膜起到抑制效果，測定其擁有13.3mg/（h·g SS）的SAA。需要注意的是，與短期作用相比，該SAA值更高，可以確定在暴露時間較長時，厭氧氨氧化生物膜適應OTC的能力也在不斷提升，導致OTC在生物活性方面所發揮的作用變得越來越不明顯。而在100μg/L的OTC長期暴露后中，不僅對SAA沒有起到抑制效果，而且起到了相反效果使其達到15.1mg/（h·g SS）[4]。與短期暴露相比存在完全相反的結果，說明隨著厭氧氨氧化生物膜在OTC中暴露的時間越來越長會不斷增強其適應性。然后在1000μg/L的OTC中，長期暴露后會在很大程度上降低SAA，最終得到了11.1mg/（h·g SS）的測定值，有統計學意義。說明OTC此時已經發揮了最大的抑制作用，明確了其長期抑制閾值為1000μg/L。2#厭氧氨氧化濾柱生物膜在SMX中短期暴露前，擁有14.5mg/（h·g SS）的SAA，而在短期暴露于1μg/L的SMX中后，會在較小程度上降低SAA，測定值為14.3mg/（h·g SS），之后在短期暴露于10、100、1000μg/L的SMX中后，將分別降低SAA至13.8、13.7.13.1mg/（h·g SS），在實驗濃度范圍內，雖然在不斷增加SMX濃度時會逐漸降低SAA，但是存在不夠顯著的整體降低情況，這證明厭氧氨氧化生物膜對SMX擁有較強的抵抗性。在長期暴露于SMX中后，所得的SAA值分別為1μg/L時為14.8、10μg/L時為14.3、100μg/L時為14.1、1000μg/L時為13.6，單位為mg/（h·g SS）。當SMX濃度為1μg/L時會輕微增加SAA，因為短期抑制作用并不明顯，所以沒有從抑制轉變為適應的過程。相關的研究結果證明，當有機物的濃度較低時對高效穩定地運行厭氧氨氧化有利。所以，產生這種現象的原因可能是厭氧氨氧化生物膜擁有較高的SMX抗性，另一方面由于SMX對反硝化起到了誘導作用使脫氮性能得到了提升。在SMX濃度不斷提升的過程中，在長期暴露后厭氧氨氧化生物膜均存在輕微降低的表現，在不同濃度下與短期暴露相比擁有相近的SAA降低程度。這個結果證明在長期作用和短期作用下，在SMX的實驗濃度中只會在較小程度上影響厭氧氨氧化，其抑制作用并不明顯[5]。

表1 短期和長期暴露中抗生素影響厭氧氨氧化活性的情況 （mg/（h·g SS））

2.2 抗生素影響胞外聚合物的情況EPS與微生物細胞擁有非常相似的主要成分，其主要分為兩大類，分別為PS和PRO，其能夠在細胞完成營養吸收的過程中發揮重要作用，同時能夠使細胞在一定程度上免受有毒物質和殺菌劑的危害。

如表2所示，在1μg/L的OTC中長期暴露1#反應器的生物膜后，擁有較慢的微生物響應速度，只會有較少的EPS分泌，并且會顯著降低多糖和蛋白質，證明在這種環境下微生物能夠正常生長，其生長情況較為穩定。而在使用10μg/L的OTC時，會在很大程度上增加EPS，特別是在蛋白質方面，會完成從32.6至85.49mg/g SS的迅速提升，證明微生物受到了毒性抑制。當處于擁有抗生素的環境中，正常情況下微生物的EPS分泌量會增大。之后隨著OTC濃度越來越高，將會再次顯著增加EPS的量，證明借助大量EPS的分泌微生物對OTC逐漸適應，也在漸漸地恢復活性。當使用1000μg/L的OTC時，將會嚴重抑制微生物，導致微生物大量死亡，也會逐漸降低其分泌的EPS。但是需要注意的是，在不斷增加OTC濃度的過程中，也會不斷提升SMP的含量，證明生物膜中進入了一些死亡微生物的產物，使微生物擁有反硝化的條件，反而能夠使微生物擁有更高的活性。另外，也會逐漸降低PS/PRO的值，證明隨著分泌越來越多的PS，是微生物針對毒性的應對措施。

表2 抗生素影響胞外聚合物的情況 （mg/g SS）

微生物在2#反應器中快速反應，在SMX為1μg/L時EPS輕微增加，隨著SMX擁有越來越高的濃度能夠非?？焖俚卦黾覧PS，這證明SMX能夠得到厭氧氨氧化生物膜的快速反應，即使SMX的濃度較低也能夠對EPS產生刺激，使EPS分泌量增加，能夠使有毒物質對微生物的抑制情況得到降低[6]。所以在作用持續時間較長的情況下，SMX對SAA的影響顯著程度不足。但是需要注意的是，在持續降低SMP中PRO/PS值的過程中，這可能是厭氧氨氧化均對于SMX的一種應對措施，通過提升溶解性多糖分泌，來為細胞提供保護，與OTC相比擁有相同結果。相關學者在研究過程中將1mg/L濃度的SMX放入兩個反應器中，在存在EPS保護的基礎上，在145h后微生物的OUR值降到了95mg/（L·H）；而當EPS保護不存在時，微生物降低到10mg/（L·H）以下的OUR值。這一研究結果也進一步證實了這一觀點，當微生物與SMX接觸后能夠完成EPS的快速分泌，能夠對毒性抑制起到抵抗作用。

2.3 脫氮功能微生物的豐度變化 通過有效對比Silva數據庫，得到存在水平差異的微生物分類。在門分類水平方面，在不同階段兩個濾柱的所有生物膜中Proteobacteria都擁有最大的相對豐度，1#濾柱和2#濾柱在0μg/L時分別為57.8%和31.5%，在1μg/L時分別為28.5%和52.3%，在10μg/L時分別為41.3%和55.9%，在100μg/L時分別為31.6%和51.4%，在1000μg/L時分別為41.1%和51.1%。雖然在剛接觸OTC時1#生物膜大幅度減少了29.3%的Proteobacteria豐度，但是隨后豐度漸漸提升，并且始終處于較高的水平。而在與SMX接觸后，2#生物膜不但沒有降低Proteobacteria豐度，反而提升情況較為明顯，并且能夠在濃度不同的情況下處于穩定狀態，這種情況證明了在與SMX接觸后2#生物膜的穩定性。其次，擁有較高相對豐度的門為Planctomycetes，1#濾柱和2#濾柱在0μg/L時分別為19.0%和15.0%，在1μg/L時分別為25.7%和23.5%，在10μg/L時分別為12.3%和17.2%，在100μg/L時分別為41.5%和16.4%，在1000μg/L時分別為20.7%和12.6%。與相關的研究相結合可知，在自養脫氮系統中廣泛存在這兩個門的微生物。生物膜在與SMX接觸后，在增加Proteobacteria的過程中可能會使其抗生素耐藥性不斷提升。在抵抗抗生素的機理方面主要是誘導失活的酶或者可以編碼的抗生素改性以及對細菌細胞中抗生素靶點的突變進行誘導等。由于在OTC中厭氧氨氧化能夠實現自我適應，所以泵出機制可能是厭氧氨氧化能夠抵抗OTC作用的主要原因，而降解作用是抵抗SMX的主要原因。

通過分析屬水平的微生物分類結果可知，在種類不同濃度不同的抗生素中長期暴露后，會在很大程度上改變厭氧氨氧化微生物生物膜的組成。在厭氧氨氧化中AAOB屬于功能微生物，在1#生物膜中AAOB功能菌中的Candidatus Kuenenia屬于優勢微生物，在OTC濃度不同時期相對豐度的變化幅度較大，在與OTC剛接觸時AAOB擁有刺激強化作用，AAOB相對豐度實現了從16.4%到23.4%的提升，當OTC到達10μg/L的濃度時抑制作用再次出現，當OTC到達100μg/L的濃度時進一步增強，在OTC到達1000μg/L的濃度抑制作用再次出現。而當生物膜暴露在濃度不同的SMX中時，分別擁有13.85%、20.19%、14.31%、14.15%和9.43%的相對豐度，出現先提升后降低的情況，這證明在抗生素中AAOB均存在先增強后抑制的情況。在這個過程中需要注意的是，在與抗生素接觸后，都有反硝化菌Denitritisoma在兩個反應器中被誘導出來，并且在變化趨勢方面存在差異。1#濾柱中，反硝化菌只受到OTC較慢的誘導，只有在達到1000μg/L的OTC濃度時其增殖情況才變得非常明顯，在很大程度上提升了相對豐度，而在此時已經開始抑制AAOB，之所以會增加反硝化菌Denitritisoma可能是因為在分解微生物死亡殘體的過程中有有機質產生，從而對發生硝化反應起到了促進作用。與之相反，在SMX借助2#生物膜后反硝化菌立刻被誘導出，在不同階段反硝化菌Denitritisoma分別擁有0.01%、3.31%、15.02%、10.52%和14.03的相對豐度，相對來說擁有較高的比例。反硝化菌能夠實現對SMX的充分降解并且能夠對死亡微生物殘體進行利用，能夠使厭氧氨氧化生物膜在一定程度上免受SMX的毒性，所以2#濾柱始終為較輕的抑制水平。

3 結論

①在1000μg/L的SMX和OTC中厭氧氨氧化生物膜6h和22d暴露結果表明，厭氧氨氧化活性會在較大程度上受到OTC的影響，且對于100μg/L以下濃度的OTC厭氧氨氧化菌擁有一定的適應性，而厭氧氨氧化在SMX的短期和長期暴露中均不會受到顯著影響。

②與OTC相比，SMX能夠得到厭氧氨氧化生物膜更快的響應，能夠實現EPS分泌量快速增加。在分泌大量的EPS后能夠為厭氧氨氧化菌提供保護，使SMX的毒性抑制得到降低。

③在脫氮功能微生物的豐度變化方面，在加入SMX后會大量增殖反硝化菌，其與厭氧氨氧化菌的脫氮會共同完成并使SMX降解，所以SMX只會在較小程度上影響生物膜脫氮性。另外，在抗生素響應方面AAOB相對豐度會存在先增強后被抑制的情況。

所以，厭氧氨氧化能夠對擁有微量SMX的廢水進行有效處理，在開展含OTC廢水的處理工作時，需要與長期馴化相配合。