啟宮丸對多囊卵巢綜合征大鼠WNT/β-catenin信號通路的影響

李曉俊 楊斌 謝京紅

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是在遺傳、環境等多種復雜因素共同影響下引起的一種育齡期婦女常見內分泌及代謝紊亂疾病，主要臨床特征包括：月經紊亂或閉經、高雄激素血癥、多囊樣卵巢、胰島素抵抗等。越來越多的證據表明卵巢顆粒細胞(granulosa cell，GC)凋亡水平增加是PCOS的發生關鍵病理機制；其中Wnt信號通路是調節細胞增殖、凋亡的經典通路，在卵巢卵泡發育中至關重要[1-2]。目前促進PCOS卵巢GC增殖并抑制其凋亡是PCOS主要治療策略[3]。中醫學認為PCOS的發生與腎、脾、肝三臟功能失調，痰濁、瘀血阻滯密切相關。眾多醫家認為痰濕阻滯胞宮是PCOS發生的主要原因[4-5]。啟宮丸具有健脾化濕，行氣祛痰、啟宮助孕的作用，在臨床治療PCOS中療效顯著。本實驗通過觀察啟宮丸對PCOS大鼠性激素水平的表達、卵巢病理組織形態、凋亡狀況及Wnt/β-catenin信號通路的蛋白表達的影響，探究啟宮丸對PCOS模型大鼠的治療作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD雌性大鼠，40只，5～6周齡，體質量為180～220 g，購自北京市華阜康生物科技股份有限公司。動物生產許證號：SCXK(京)2017-0001，室溫(22±2)℃，相對濕度 55%～65%。

1.2 藥品與試劑

來曲唑片，規格：2.5 mg/片，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：22003153。

啟宮丸，藥物組成：半夏20 g、香附20 g、川芎20 g、白術20 g、神曲15 g、茯苓15 g、蒼術12 g、橘紅12 g、甘草6 g，藥物均由中國中醫科學院西苑醫院中藥房提供及質檢，統一采用中藥煎藥機煎制，制成濃縮藥液(含生藥量0.735 g/mL)。

炔雌醇環丙孕酮片，商品名：達英-35，德國拜耳醫藥保健有限公司，批號：KT09FJ52。

羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，美國Sigma公司，批號：1002375619。

1.3 主要儀器

3K18型離心機(美國Sigma)，Olympus BX53型顯微鏡，TP1020型全自動脫水機(德國Leica)，RM2235型組織切片機(德國Leica)，Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模 所有實驗大鼠均進行2天的適應性喂養，采用隨機數法在40只雌鼠中選取10只為正常組，正常組采用普通飼料喂養，余下30只大鼠灌注服來曲唑聯合高脂飼料喂養進行造模。造模組每日灌胃給藥來曲唑溶液1 mg/(kg·d)溶于0.5%(質量分數)。同時給與高脂飼料喂養(配方：普通飼料60%、蛋黃粉12%、豬油11%、全脂奶粉5%、蔗糖5%、花生5%、麻油1.5%、食鹽0.5%)，連續21天，進行造模處理，正常組灌服等體積溶劑。造模第7天起，每天進行陰道涂片，觀察2個周期，以陰道上皮細胞持續角化者為造模成功[6-7]。

1.4.2 分組與給藥方法 模型建立成功后，將30只成模大鼠隨機分為模型組，中藥啟宮丸組、陽性藥達英-35組，每組10只。中藥啟宮丸組和達英-35組統一按照女性60 kg體質量，采用人和大鼠體表面積換算法計算用藥劑量，中藥組給予14.7g/(kg·d)，口服灌胃，每日一次。達英-35組給0.21 mg/(kg·d)口服灌胃，每日一次，正常組及模型組給予等量蒸餾水灌胃，干預周期為3周。實驗結束后無動物死亡情況。各組大鼠末次給藥結束后，當晚8：00后禁食，于次日測量各組大鼠體質量并記錄，以10%水合氯醛麻醉，抽取腹主動脈血約5 mL，靜置20分鐘后3000 r/min離心15分鐘，吸取上層血清置于離心管中。取血后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，統一取出子宮及卵巢。以4%的甲醛中固定。便于后續HE染色及免疫組化檢測。

1.5 檢測指標

1.5.1 ELISA法檢測血清激素水平 按照ELISA試劑盒說明書，測定各組大鼠血清睪酮(testosterone，T)、雌二醇(Estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormonel，FSH)的激素水平并計算LH/FSH比值。

1.5.2 HE染色觀察卵巢組織病理變化 卵巢組織10%中性福爾馬林切開固定24小時后，取材，梯度酒精脫水，將透明組織浸入60℃石蠟中包埋，制成石蠟塊。將石蠟塊進行4 μm連續切片，烤片，二甲苯脫蠟后下水，HE染色，脫水、封片后置于顯微鏡下觀察大鼠卵巢組織病理變化。

1.5.3 TUNEL染色觀察卵巢組織凋亡狀況 石蠟切片3 μm，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，20 μg/mL蛋白酶K工作液溶解蛋白酶。PBS沖洗，滴入TUNEL混合液50 μL，加蓋玻片，置于37℃暗黑盒中反應1小時，PBS沖洗，DAB顯色，發生凋亡的細胞核顯示淡黃色至深棕色。高倍鏡下拍攝3個連續不重復視野，統計每個視野中細胞總數和陽性凋亡細胞總數，計算凋亡率即TUNEL陽性率(%)=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.5.4 采用免疫組化法檢測Wnt、β-catenin蛋白在大鼠卵巢組織中的表達 石蠟切片3 μm，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，采用檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶10分鐘。PBS液沖洗，滴加一抗Wnt、β-catenin(濃度分別為1/100，1/200)，4℃孵育過夜，次日常溫下復溫0.5小時，滴加二抗孵育30分鐘，DAB顯色，鏡下觀察顯色程度，顯色后自來水沖洗終止反應，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。高倍鏡下拍攝3個連續不重復視野，采用Image-pro Plus6.0圖像分析軟件測定陽性信號的積分光密度(integral optical density，IOD)值。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠血清中E2、T、P表達的比較

與正常組比較，模型組血清T水平升高，E2及P水平明顯減低(P<0.01)；與模型組相比較，啟宮丸組及達英-35組中E2及P水平升高，T水平下降，差異有統計學意義(P<0.01)。如表1所示。

表1 各組大鼠血清T、E2及P表達水平比較

2.2 大鼠血清中FSH、LH及LH/FSH數值比較

與正常組比較，模型組LH及LH/FSH水平顯著升高、FSH水平下降，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，啟宮丸組和達英-35組LH水平及LH/FSH比值均顯著降低(P<0.01)，FSH水平均有不同程度升高，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。如表2所示。

表2 各組大鼠血清FSH、LH及LH/FSH表達比較

2.3 大鼠卵巢組織病理改變

鏡下可見：正常組表現為大鼠卵巢組織中隨處可見處于不同發育階段的各級卵泡。其中優勢卵泡中可見形態完整的多層GC(多為6～8層)，可見正常黃體。模型組表現為卵泡總體數量減少，閉鎖卵泡、囊狀卵泡增多，多數卵泡呈囊性改變，GC層數減少變薄(多為3～4層)，排列紊亂，黃體減少。啟宮丸組表現為卵泡總體數量無明顯減少，可見各級生長卵泡，閉鎖卵泡相對較少，少量卵泡呈囊性改變，GC層數明顯增加(多為4～6層)，排列規則，可見少量黃體、白體，GC數增多。達英-35組卵泡發育及閉鎖卵泡改善方面效果同啟宮丸組，但是GC層稀疏較少(多為3～4層)。如圖1所示。

注：A正常組; B模型組；C啟宮丸組; D達英-35組

2.4 大鼠卵巢組織凋亡狀況

TUNEL陽性表達在卵巢組織GC核內，呈淡黃色至深棕色染色。正常組大鼠卵巢組織僅有少量TUNEL陽性細胞散在分布。與正常組相比，模型組TUNEL陽性細胞率明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，啟宮丸組和達英-35組TUNEL陽性細胞率明顯下降(P<0.01)，其中啟功丸組和達英35組TUNEL陽性細胞率未見明顯差異(P>0.05)。如表3所示。

表3 各組大鼠卵巢組織凋亡狀況比較

2.5 大鼠卵巢組織Wnt、β-catenin蛋白表達

檢查指標Wnt和β-catenin表達在卵巢組織的GC胞膜及胞漿內，呈淡黃色至棕黃色，以胞膜為主，卵泡膜細胞偶有表達，本次實驗僅統計GC胞膜表達部分，正常組Wnt及β-catenin蛋白呈強陽性表達，表達范圍廣泛。與正常組相比，模型組Wnt及β-catenin蛋白表達水平均顯著下降(P<0.01)，表達率減少；與模型組相比，啟宮丸組和達英-35組Wnt及β-catenin表達水平均有不同程度上升(P<0.05或P<0.01)，表達范圍增加。如圖2～3、表4所示。

表4 各組大鼠卵巢組織Wnt、β-catenin蛋白表達比較

注：A正常組;B模型組；C啟宮丸組;D達英-35組

注：A正常組;B模型組；C啟宮丸組;D達英-35組

3 討論

PCOS是女性常見異質性生殖、代謝紊亂疾病，是導致育齡期女性不孕的主要原因，占無排卵性不孕的75%[8]。遠期可引起腫瘤、心腦血管疾病、血脂血糖異常等多種內分泌代謝系統并發癥[9-10]，嚴重危害患者身心健康及家庭，現代流行病學調查顯示：該病在育齡期女性的發病率為6%～21%[11]，是目前生殖醫學領域主要研究方向。臨床主要治療方式包括調整月經周期、促排卵、手術等，但副作用多，治療效果不理想。本病屬于中醫學中閉經、月經過少、不孕、癥瘕、崩漏等范疇，歷代醫家認為PCOS的主要病機為水濕內停，積聚成痰，阻滯胞宮。因此，根據“治病求本”的原則，臨床治療應以燥濕化痰為法。啟宮丸出自清代醫家汪昂《醫方集解》，組方以二陳為君藥加行氣活血藥而成，能治婦人體肥痰盛，脂膜閉塞子宮，不能孕育。臨床大量研究證明啟宮丸能夠降低PCOS患者體質量、調節HPO軸激素分泌、促進優勢卵泡形成及排卵，改善PCOS患者的臨床癥狀[12-13]，但其治療機制尚待不明確。

PCOS的關鍵病理改變是卵泡發育障礙，表現為卵泡發育程中激素分泌異常，卵泡募集亢進、閉鎖，GC凋亡異常增加，無優勢卵泡形成及排卵等。本實驗研究顯示，模型組大鼠卵巢組織中可見明顯多囊樣擴張卵泡，閉鎖卵泡增加，無成熟卵母細胞，黃體數目減少，GC排列紊亂，稀疏變薄退化。啟宮丸組大鼠卵巢組織鏡下可見各級卵泡形態正常，GC層數較模型組增多，可見少量黃體及白體，提示可能存在排卵。卵泡的發育受到激素的調控，與卵巢GC關系密切[14]。GC內包含FSH、E、T相關激素受體，對FSH和LH刺激作出反應，能增加P450arom(P450芳香酶)基因的轉錄，促進雄激素向雌激素轉化，刺激卵泡的生長和排卵[15]。同時GC還具備合成E2和P等類固醇的能力，增強LH排卵峰正反饋作用，從而誘導排卵。與模型組相比，經啟宮丸治療的大鼠FSH顯著升高，LH、LH/FSH明顯降低。T水平升高、E2、P水平降低。提示啟宮丸干預后能夠提升PCOS大鼠卵泡質量，增加GC層數，糾正激素失衡狀態。表明啟宮丸對PCOS具有較好的治療作用。

近些年，研究發現GC的異常增殖凋亡可能是PCOS發病的病理基礎[16-18]。卵泡經歷募集、選擇，形成優勢卵泡后，其余卵泡發生閉鎖，卵泡的閉鎖取決于卵巢GC的凋亡機制。GC增殖和凋亡信號通路之間的平衡決定卵泡的命運。本實驗通過TUNEL法對比各組大鼠卵巢組織凋亡狀況，結果證明模型組大鼠卵巢組織凋亡率明顯增加，而經過啟宮丸治療后PCOS大鼠凋亡率明顯降低。提示啟宮丸能抑制大鼠卵巢GC凋亡水平。Wnt/β-catenin信號通路在GC中表達，參與卵泡發育、排卵、增殖與凋亡過程，與 GC功能異常及PCOS 的發生密切相關。

Wnt/β-catenin通路通過調節下游分子核內原癌基因c-Myc及細胞周期蛋白cyclinD1的表達，來調控細胞的增殖、凋亡、分化及遷移功能[19]。β-catenin是Wnt通路中的核心分子，非活化狀態下定位于細胞胞漿，正常情況下胞漿內糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)復合體通過磷酸化、泛素化對β-catenin進行降解，使得其濃度水平較低，無法介導下游信號。當細胞被特定因素刺激時，Wnt與位于細胞膜表面的Frizzled受體結合，誘導GSK-3β復合體解離，解除了對β-catenin的抑制作用，激活下游靶基因。Wnt/β-catenin通路對卵巢發育的影響，一方面體現在Wnt/β-catenin與性激素受體通路存在多種方式的交互作用，是卵巢類固醇激素分泌重要的調控途徑；另一方面體現在決定細胞命運走向，調控細胞的存活、增殖、分化和凋亡活動，與GC的增殖、排卵、黃體化和卵泡閉鎖等重要的卵巢發育事件緊密相連[20]。既往研究表明Wnt通路可以促進卵泡GC雌激素的分泌，同時能夠調節FSH及LH激素分泌，對類固醇生成和及排卵有積極作用[21]。Wu等[22]發現PCOS患者β-catenin及其下游靶蛋白(Survivin、BMP4)的表達與凋亡因子Bax和Bcl-2的表達成反比，認為WNT/β-catenin通路參與調控卵巢細胞凋亡，是PCOS形成的重要機制。專家學者逐漸認識到Wnt/β-catenin或可成為PCOS新的治療靶點，但尚未有相關研究進行驗證。本實驗發現，模型組卵巢GC較正常組Wnt、β-catenin表達水平顯著降低，中藥啟宮丸組較模型組改善明顯。表明啟宮丸能提高wnt/β-catenin信號通路的表達，減少GC凋亡。

綜上所述，本研究表明啟宮丸可改善PCOS癥狀，促進卵泡發育可排卵，其機制可能與激活Wnt/β-catenin信號通路，減少GC凋亡反應，調節卵巢激素分泌，從而促進卵泡發育與排卵有關。本實驗樣本量較小，未來需要進行大量實驗及臨床研究進一步驗證。