牛乳蛋白生物脫敏技術研究進展

劉一璇，魯丁強，劉丹陽，王新倩，劉玉姣，胡志和

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

0 引言

牛乳是人體優質蛋白的良好來源，但同時也是FAO及WHO認定的世界八大過敏食物之一[1-2]。約2%～7.5%的新生嬰兒存在牛乳過敏的問題，其中絕大多數在3～4歲時不再出現過敏癥狀，但有些個體的過敏反應會一直存在[3]。對于不同學者的研究，牛乳患病率存在較大差異，這可能是由于研究人群的年齡、地理差異及研究方法的不同造成的[4]。目前解決該問題只能避免攝入，醫學上采用口腔食物激發試驗(Oral food challenge，OFC)為牛乳過敏患者檢測，提供避免攝入的依據。相關研究認為該檢測有一定的作用，但準確性不能保證，存在牛乳過敏患者OFC呈陰性的情況[5]。通過不同加工工藝處理以降低甚至消除牛乳致敏能力，是有前景的研究方向。通常用于牛乳消敏（牛乳消敏）的加工工藝被分為物理法、化學法和生物法。其中生物法不僅可以改變牛乳蛋白的構象表位也可以改變其線性表位，是更有前景的降敏方法。本文將介紹生物酶法、發酵作用和轉基因技術3種生物降敏法的研究現狀，旨在為之后的相關研究提供參考。

1 牛乳蛋白致敏機理

食物過敏的患者主要通過胃腸道、口腔、呼吸道及皮膚接觸過敏原，從而引發過敏反應。人們普遍認為，大多數患者通過腸道使個體敏感，這是因為腸道內的菌群失衡可以影響免疫耐受[6]。牛乳在人體內的過敏反應主要分為IgE介導的Ⅰ型超敏反應（又稱速發型超敏反應）、非IgE介導的過敏反應及IgE和非IgE相結合的免疫反應。雖然目前尚不清楚總食物過敏人口中由IgE介導引起食物過敏的人口水平[7]，但其反應機制更明確，分為致敏階段、激發階段和過敏階段。

致敏階段是指過敏機體的相關作用被破壞從而使食物過敏源的信息傳遞到T淋巴細胞上，T淋巴細胞隨之分化為Th2細胞從而在體內引起細胞免疫，產生IgE抗體[8]。IgE抗體與過敏原結合形成的免疫復合物與消炎細胞結合使機體致敏。激發階段即同一抗原再次進入人體，消炎細胞表面的IgE抗體快速識別抗原并與之結合，使得消炎細胞脫顆粒。效應階段就是激發階段作用于各效應組織和器官，使得人體出現麻疹、濕疹、嘔吐、腹瀉等各種癥狀[9]。

圖1 IgE介導的Ⅰ型超敏反應機制

2 牛乳致敏蛋白及其表位

牛乳蛋白可以分為酪蛋白和乳清蛋白。酪蛋白占總蛋白質的80%,可分為αs1-酪蛋白（αs1-casein，αs1-CN）、αs2-酪蛋白（αs2-casein，αs2-CN）、β-酪蛋白（β-casein，β-CN）和κ-酪蛋白（κ-casein，κ-CN），前3種酪蛋白以較為穩定的半球形內核形狀存在，κ-酪蛋白在最外層形成“毛發層”進行包裹。乳清蛋白占總蛋白質的20%，包括α-乳白蛋白（α-Lactalbumin，α-LA）、β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，β-LG）、乳鐵蛋白、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和牛免疫球蛋白（Bovine immunoglobulin，LGS）[10]等。普遍認為α-LA、β-LG的致敏性更高。

2.1 酪蛋白

2.1.1 αs1-CN

αs1-CN由199個氨基酸殘基組成，占總酪蛋白含量的40%。它廣泛存在于哺乳動物乳汁中，但在人乳中不含有，是一種高度磷酸化蛋白。并具有2種常見的磷酸化狀態，其中大部分情況下含有8個磷酸基團（αs1-CN-8P），少部分含有9個磷酸基團（αs1-CN-9P）。這兩種不同的狀態是由其基因決定的。

αs1-CN致敏的線性表位，Spuergin等[11]早在1996年就通過纖維素衍生膜上合成法研究鑒別了3個IgG和IgE共同的表位，但未發現結合IgG和IgE的特異性表位。Chatchatee等[12]在2001年通過纖維素衍生膜上合成法研究鑒別了6個IgE主要表位、3個次要表位和5個IgG主要表位、1個次要表位，為1-10。其中表位69-78和173-194可以被大多數年齡組的患者識別過敏，考慮作為檢測個體是否患有牛乳過敏的識別表位。Cerecedo等[13]在2008年通過肽微陣列分析法研究鑒別了1個IgE線性表位。Cong等[14]在2012年通過丙氨酸掃描分析鑒定了4個IgE表位和3個IgG表位。范安妮[15]等在2016年通過IEDB數據庫預測了10個B細胞表位。表1中詳細列舉了這些表位及其檢測方法。

表1 牛奶蛋白的抗原表位

2.1.2 αs2-CN

αs2-CN由209個氨基酸殘基組成，占總酪蛋白含量的10%。人乳中不含有。與αs1-CN一樣具有高度磷酸化。牛乳中的αs2-CN有A、B、C、D 4種基因變異體，它們具有一致的氨基酸序列，不同的磷酸化程度，不同變異體的分子中分別含有10～13個磷酸基[16]。

αs2-CN致敏的線性表位，Busse等[17]在2002年鑒別了4個IgE主要表位和6個IgE次要表位。Jing Lin等[18]在2009年通過肽微陣列分析法研究鑒別了1個新的IgE線性表位，為69～77。此外，該研究鑒定的表位與前人通過SPOT膜技術鑒定的表位基本一致，確定了肽微陣列分析法鑒定蛋白質致敏表位的可靠性。

2.1.3 β-CN

β-CN由226個氨基酸殘基組成，在牛乳中占總酪蛋白含量的35%。三級結構是緊密排列的折疊結構，因其富含脯氨酸而限制了更高級的有序結構。牛乳中的β-CN有13種遺傳變異型，其中最常見的是A1型和A2型[19]。A2型在奶牛雜交中具有優勢[20]。目前認為A2型為牛乳β-CN的原始形態，A1型是由A2型的第67個氨基酸脯氨酸突變為組氨酸而產生的。A1型β-CN在人體內消化過程中會產生生物活性物質β-酪啡肽（BCM-7），該物質對人體健康的影響具有爭議性。有研究認為它會導致人體患動脈粥樣硬化[21]、心血管疾病和Ⅰ型糖尿病[22]等疾病的幾率增大。

β-CN致敏的線性表位，Chatchatee等[23]通過纖維素衍生膜上合成法研究鑒別了8個主要IgG表位和1個次要IgG表位。Cerecedo等[15]在2008年研究通過肽微陣列分析法鑒別了3個可能的線性表位。Jing Lin等[20]在2009年同樣通過肽微陣列分析法研究鑒別了1個新的線性表位，為16～39。劉法輝[24]在2011年利用同源建模、折疊識別法建模、從頭預測方法構建出β-CN構象模型并鑒別了4個IgG構象表位。

2.2 α-LA

α-LA由123個氨基酸殘基組成，在牛乳中約占乳清蛋白的25%，是牛乳清中第二豐富的蛋白質。牛乳中的α-LA有a和b兩種遺傳變異體，在西方奶牛中均以a型為主。α-LA可以用于制藥工業和功能性食品的制備。常常通過膜分離等技術從乳清蛋白中分離出來后，作為具有抗癌、抗菌、抗病毒等作用的良好生物活性肽使用[25]。

α-LA致敏的線性表位，Adams等[26]在1991年通過放射變應原吸附劑試驗(RAST)研究鑒別了1個IgE表位。Jrvinen等[27]在2001年通過纖維素衍生膜上合成法研究鑒別了4個IgE表位和3個IgG表位。叢艷君等在2017年通過酶聯免疫吸附分析法研究鑒別了5個IgE表位[28]并在2018年通過丙氨酸免疫表位掃描技術研究鑒別了4個IgG表位[29]。

2.3 β-LG

β-LG由162個氨基酸殘基組成，在牛乳清中占主要地位并且含量較高，約占乳清蛋白的50%。牛乳中的β-LG有A、B、C 3種遺傳變異體，主要存在的是A型和B型。天然的β-LG在胃中不易被消化。

β-LG致敏的線性表位，Tsuji等[30]早在1993年就研究鑒別了3個T細胞表位。Miller等[31]在1999年通過棕色挪威大鼠動物模型，鑒別了4個IgE表位和5個IgG表位。該實驗步驟為使批標準化（BN）大鼠模型在有角叉菜膠佐劑的情況下，通過腹膜內途徑暴露β-乳球蛋白，之后再使用乙酰膽堿酯酶底物直接進行酶免疫測定。該研究也證明了BN大鼠和人類的免疫系統對分子或肽水平上的牛乳蛋白抗原性表位具有相似的識別能力。Cerecedo等[15]在2008年研究鑒別了1個線性表位。Cong等[32]在2012年通過丙氨酸掃描分析鑒定了4個IgE表位和2個IgG表位。其中IgE結合表位的關鍵氨基酸是Thr20、Met23和Asp27，IgG結合表位的關鍵氨基酸是Leu26和Val31。武涌[33]在2012年通過生物信息學模擬出了3個構象性表位，分別是A：87-88、90-9l、108、l10，B：2、4、113、l15、144，C：18、20、44、45、47、55、157，其可信度由大到小依次為A、B、C。

3 生物法降低致敏性

3.1 生物酶法

自1833年世界上第一種酶被發現，其就作為商品進入了人類的視野。在全世界工業用酶中，食品用酶約占31%。酶制劑發展的早期，多數種類的酶是從動物或者植物原料中提取的，隨著食品酶學的發展，目前微生物發酵產生的酶在工業用酶中占據主要地位。在食品領域中，利用各種酶進行加工生產以制造所需產品仍然是目前重要的研究方向之一。在已有的研究中已證明使用酶處理可以不同程度的破壞牛乳致敏蛋白的構象表位和線性表位以達到牛乳脫敏的功效，但未能找到一種酶制劑可以完全達到脫敏效果以適用于牛乳過敏人群食用。因此，尋找合適的酶仍然為目前牛乳降敏的可行研究途徑。

3.1.1 酶法消敏原理

酶處理消敏的原理是破壞蛋白質致敏表位，一般有3種情況：第一種是酶水解特異性氨基酸位點，使蛋白質分子結構改變從而破壞構象表位；第二種是通過一些物理手段處理后，蛋白質三、四級結構被破壞，構象表位也隨之改變，同時線性表位暴露出來，此時酶處理可水解破壞蛋白質線性表位并降低分子量大小；第三種是酶的交聯作用，其可以改變蛋白質的構象表位并覆蓋其線性表位。交聯酶與牛乳蛋白中特定的氨基酸殘基作用，形成分子內或分子間共價鍵從而誘導蛋白質交聯，不同種交聯酶的作用位置和反應機制各不相同[34]。

Abd El-Salam等[35]將常見的酶法消敏按照所用酶形式的不同可以分為直接酶水解、直接酶交聯、固定化酶和酶膜反應器。其中直接酶水解和直接酶交聯實驗原理、過程最為簡單，即將水解酶或交聯酶直接與待測樣品混合，在其最佳反應條件下充分反應。直接酶水解在反應完全后，還可以通過加熱使酶失活而結束反應并通過超濾等手段分離樣品中未水解完全的大分子肽段以控制乳制品的低敏性。固定化酶即將目標酶固定在不溶性載體上（吸附法、包埋法、結合法、交聯法等），控制其自由流動后在最佳反應條件下加入待測樣品中攪拌一段時間，反應結束后通過過濾將酶與樣品分離；或者通過控制待測樣溶液的流速和溫度，使其流過固定化酶進行反應，該方法反應結束后不再需要將酶與樣品進行分離[5]。酶膜反應器的使用可以實現連續反應、分離混合物中產物、避免酶固定化的困難等優點，其中低分子量物質通過膜滲透，高分子量物質被阻截，但其也存在膜污染等缺點[36]。

3.1.2 酶法消敏研究

目前已有大量酶在牛乳消敏加工工藝中被研究認為可降低牛乳致敏性，部分酶已經可以達到工業化生產的要求。酶法降敏工藝的研究多采用單酶水解牛乳蛋白和多酶復合水解牛乳蛋白，所用的酶根據其來源可分為植物蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶)、動物蛋白酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶）和微生物蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）。表2列舉了酶法消敏的相關研究。

表2 酶法消敏的相關研究

相對于各種水解酶在該領域的研究，交聯酶的研究略少，但其更具有前景。其原理是蛋白質分子間或分子內共價交聯，既可能通過改變蛋白質結構而改變其構象表位，也可能是交聯后的表位被遮蓋而無法表現出抗原性。Karaki N[37]認為可以交聯消敏的4種主要酶為漆酶（Laccase，LAC）、酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）和谷氨酰胺轉氨酶（Glutamine transaminases，TG）[37]。TG酶是通過催化蛋白質分子間或分子內的酰基轉移而使蛋白質交聯的，是其中唯一可以應用于商業的食品級蛋白質酶[45]。可能是基于此原因，相關研究較為充分[46,50]。與TG酶相比，其余3種酶的相關研究較少[45]。LAC酶可以通過單電子去除機制催化蛋白質中酚類（常見于酪氨酸側鏈）的氧化反應[38]，其氧化產物苯醌可以發生聚合或與自由芳香基聚合，從而使蛋白質交聯。TYR酶可以將單酚羥基化為二酚，二酚可進一步氧化為具有高度反應性的二醌，而二醌可與自身或其它不同集團發生非酶反應，以此建立分子間或分子內交聯。由于都對催化酚類物質的氧化反應有作用，TYR酶與LAC酶也被合稱為多酚氧化酶[39]。POD酶可以與酪氨酸殘基反應，其反應物進一步與酚類、巰基等反應形成交聯物質。另外，酶的固定化是酶工程中重要的一項技術，但其對低敏乳制品的作用能力取決于被固定的酶在該方面的能力，因此相關研究的商業意義更大。

（續表2）

3.2 發酵作用

近些年來，益生菌的作用逐漸被人們重視。有研究表明，腸道內益生菌對于預防和治療人體口腔健康[51]、糖尿病[5]和直腸癌[52]等多種疾病具有一定的作用。作為一種益生菌，乳酸菌發酵處理是牛奶加工中一種常見且重要的加工工藝。在無氧條件下，牛奶中天然存在和人工添加的乳酸菌分解乳糖，產生大量乳酸，使體系p H值下降至酪蛋白等電點（p H 4.6）附近，酪蛋白聚集沉淀，牛奶變為固態酸奶產生。可用于酸奶發酵的乳酸菌種種類繁多，其中嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌是發酵的常規菌種[53]。

3.2.1 發酵消敏機制

不同菌株的作用特點不同，工業生產中往往使用多種菌株同時發酵，可以使酸奶具有單獨使用一種菌株所無法達到的品質。這一過程通常也伴隨著牛乳致敏性的降低，其可能機制分為乳酸菌調節Th1/Th2細胞平衡、乳酸菌發酵產生的蛋白酶水解牛乳致敏蛋白表位兩種。第一種機制是由Matsuzaki等[54]研究發現的，該研究表明益生菌可以通過增加丁酸鹽的產生和機體對IL-4、IL-10、IFN-γ、Treg、TGF-β等細胞因子的誘導耐受性，降低血清嗜酸性粒細胞水平和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達等方式從而增進Th1型免疫反應來調控因過敏而反應過度的Th2型免疫反應。也就是說乳酸菌本身可以調節人體腸道菌群平衡，從而降低機體對牛乳的敏感程度[9]。第二種機制的相關研究較為豐富。乳酸菌無法直接利用外源蛋白質為菌體提供營養，但具有復雜的蛋白水解系統，由胞膜蛋白酶（CEP）、肽酶和肽轉運系統組成[55]。該過程是CEP將外源蛋白質水解為多肽，肽轉運系統將多肽轉運到乳酸菌細胞內，胞內的肽酶隨之將其水解為可被自身利用的游離氨基酸[56]。CEP是大分子酶，存在于在細菌表面，具有水解αs1-酪蛋白、β-酪蛋白的能力，但目前對CEP編碼基因表達的調控知之甚少[57]。另外，益生菌也是腸道黏膜的重要組成部分，在腸道免疫中發揮作用。這也解釋了前面提到的牛乳過敏在嬰幼兒中的發病率高，而大部分的過敏癥狀在兒童時期消失[4]。嬰幼兒（尤其是早產兒和剖宮產新生兒）的腸道系統發育不足，腸道內有益菌的含量少，因此無法消化牛乳蛋白而導致免疫反應。

3.2.2 發酵消敏研究

發酵是目前認為在研發低敏乳制品時，一種對產品品質有益處的處理手段。盡管在理論上，發酵消敏時小肽段和游離氨基酸的產生會使產品呈苦味，但目前市售的酸奶滋味可以被消費者廣泛接受。這一現象的可能原因是，在人體內乳酸菌發酵產生的蛋白酶水解程度不高。伍恒[58]等也認為對于廣泛的乳酸菌菌株，其發酵后牛乳產品的抗原性普遍下降，但沒有被消除。另外，其在體內的抗原性降低程度不高。

李艾黎等[59]使用發酵乳桿菌處理牛乳后，通過酶聯免疫分析技術（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測食用樣品小鼠的細胞上清液中Th1型細胞因子（IL-12、IFN-γ）和Th2型細胞因子（IL-4）的水平，發現乳桿菌發酵可能通過增進Th1型免疫反應來改善小鼠β-LG的過敏情況。M.Pescuma等[60]使用保加利亞乳桿菌處理β-LG后進行小鼠實驗，發現該菌株處理后的牛乳喂養小鼠，其血清內IgE與β-LG的結合程度下降，Th1型細胞因子含量升高，認為該株菌株對降低乳制品致敏性，維持腸道Th1/Th2平衡有益。Ahmadova A等[61]使用瑞士乳桿菌作用于酪蛋白，之后通過ELISA檢測發現，發酵后樣品與IgE結合的能力降低。Lina Zhao[62]等采用ELISA和液相色譜質譜聯用法對helveticus KLDS 1.8701、plantarum KLDS 1.0386兩株乳酸菌聯合發酵脫脂乳蛋白的抗原性進行評價，結果發現聯合發酵過程可通過在α-酪蛋白上結合CEP和肽酶來降低牛奶蛋白的致敏性。隨著研究的深入，目前發現一些非乳酸菌處理也可以降低食物致敏性，如Meinlschmidt[63]等研究表明，液態發酵菌（枯草芽孢桿菌、米根瘤菌、釀酒酵母、海爾維酸乳桿菌）對大豆分離蛋白的免疫反應性、理化和感覺特性均產生影響。

3.3 轉基因技術

轉基因技術即改變奶牛基因以獲得低敏牛奶的技術，它被稱為“人類歷史上應用最為迅速的重大技術之一”并很快應用于畜產、食品領域，但大眾對于轉基因食品的消費仍持觀望態度[64]。或許基于這些原因，國內外的相關研究較少，但不可否認的是其目前仍然為一種可降低牛乳致敏性的研究方向。

牛乳蛋白脫敏可以通過改變致敏蛋白線性結構，即對蛋白線性表位的氨基酸進行突變、轉基因而達到目的。Totsuka等[65]通過將β-LG的一個免疫顯性決定簇（AA119-133）轉基因為TCR拮抗劑肽抑制了T細胞的增殖。Taheri-Kafrani等[66]利用轉基因技術，將β-LG位于86的丙氨基酸轉化為谷氨酰胺，結果突變后該表位與IgE結合較弱。其在另一研究中，將β-LG位于69的賴氨酸轉化為天冬酰胺，結果突變后與患者血清中IgE結合的親和力減弱了9倍，IgG的結合力與突變前相比沒有差異[67]。

除此以外，控制致敏蛋白的合成模板以降低其濃度也可以在一定程度上達到牛乳蛋白脫敏的目的。但是，Song等[68]研究發現羊乳中的αs1-CN與β-CN含量之間呈Pearson負相關，即隨著αs1-CN合成模板CSN 1S1豐度的降低，αs1-CN含量降低，但同時合成β-CN的mRNA豐度升高，β-CN含量升高。這一現象也符合Th細胞的剛性調節現象，即體內Th1細胞含量高于正常值時會抑制Th2細胞的含量，相反Th2細胞含量高于正常值時也會抑制Th1細胞的含量。

3.4 多種加工方式共同處理

通常情況下酶處理、物理手段與發酵，其中兩者或三者共同作用，對降低牛乳致敏性比單一手段處理作用更顯著。這可能是因為不同處理方式的作用原理不同。如超高壓的降敏原理是使蛋白質去折疊，破壞構象表位而同時暴露了之前被覆蓋的線性表位[69]，此時水解酶共同處理就能更好的水解其線性表位，不受蛋白質多級構象的干擾。Ambrosi V等[70]的實驗證明了這一點。在超高壓條件下，用胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶處理乳清蛋白濃縮物，結果表明共同處理效果顯著增加。Lozano-O等[71]研究也表明胃蛋白酶在400 MPa高壓下可以水解乳清蛋白為小分子肽鏈，這些肽鏈抗原性低并符合低敏乳制品的相關要求，即水解酶與高壓共同處理可有效降低乳清蛋白抗原性。另外，Quintieri等[72]研究證實了胃蛋白酶與超濾共同作用可減弱β-LG的抗原性。Abd El-Salam[73]等研究表明，水解酶和乳酸菌發酵兩種處理方式均可造成牛乳蛋白抗原性不同程度的降低，其共同作用也可以降低牛乳抗原性。Pi X[74]等在總結發酵緩解食物過敏的最新進展時提出：混合菌株發酵結合熱處理、脈沖光和超聲波等加工手段，可有效的降低各種食物的過敏性并保持其營養成分和獨特的味道，對過敏食品的加工具有意義。

4 過敏原檢測方法

4.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）

PAGE是一種用于分離蛋白質和寡核苷酸的實驗方法，根據凝膠中是否添加變性劑（Sodium dodecyl sulfate，SDS），可分類為非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Non denaturing polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）和變形聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。其不能檢測致敏性，但可以定性分離出特定蛋白，并通過條帶寬度半定量出各種蛋白的含量。由于牛乳蛋白在牛奶體系中以不同種形式存在，尤其是β-LG常與αs1-CN、αs2-CN形成聚合物，其自身也會形成二聚體。而這些聚合物都是由二硫鍵連接的，因此Native-PAGE與SDS-PAGE同時檢測時，可以評估該體系中二聚體的含量[75]。

4.2 生物傳感器

生物傳感器被認為是一種區別于食物過敏源傳統檢測方法（實時熒光定量PCR、免疫印跡、高效液相色譜等）的新興檢測手段。它具有分析快、成本低、準確度高、專一性強等優點。但生物傳感器電極的制備較繁瑣，抗體結合電極后易失活，因此當樣本制備不當時結果可能會出現假陽性或者假陰性[76]。當抗體失活，識別元件無法與待測物結合，即出現假陰結果；當待測物樣品受污染時，生物傳感器就可能出現假陽結果。光學生物傳感器與電化學生物傳感器常被用來檢測牛奶蛋白抗原性[77-78]。

圖2 生物傳感器工作原理

4.3 酶聯免疫分析技術（ELISA）

ELISA的原理是待測物（抗體或抗原）可以與抗原或抗體特異性反應，其結合形成的底物與標記酶產生顏色反應，根據產生顏色的吸光度，定量檢測底物。在常見的牛乳過敏原ELISA檢測中雙抗體夾心法和間接法使用較多，近年來商品化的ELISA試劑盒體系已經比較完整，因此目前ELISA實驗多通過試劑盒進行。Zhang[79]等使用商品化特異性ELISA試劑盒檢測了超聲-離子液體聯合預處理對乳清蛋白酶解產物致敏性的影響，發現超聲-離子液體聯合預處理可以有效降低酶解產物致敏性。Liang[80]等使用競爭性ELISA試劑盒檢測了水解酶對牛乳致敏性的降低程度。

4.4 圓二色光譜（Circular Dichroism，CD）

CD的檢測原理是根據多肽及蛋白質內光活性生色基團對左、右平面圓偏振光吸收的不同，以鑒定其存在于分子中的二級結構（螺旋、折疊、轉角）[81]。目前普遍認為CD對α-螺旋含量的檢測可靠性高，但對β-折疊含量的估計存在一定誤差[82]，因此Micsonai等[83]使用BeStSel方法修正CD的檢測誤差，該方法提供關于β-折疊的方向等額外信息，可以更準確的預測CD光譜。

圖3 ELISA工作原理

5 結論與展望

綜上所述，由于生物酶法、發酵作用和轉基因技術對于降低牛乳致敏性的機制及特性不同，且其各自作用時都顯示出了明顯的脫敏作用。另外，多種加工手段聯合使用也是一種具有前景的思路，本文列舉了相關研究，但生產出的低敏乳制品均達不到可供所有牛乳過敏患者食用的水平。現階段研究中，乳制品致敏蛋白基本確定、致敏表位研究更加完善、配方奶粉種類更加豐富，但是，牛乳致敏相關研究中仍存在一定困難和不足。如除IgE介導的Ⅰ型超敏反應外，其他牛乳致敏機理不明確；致敏蛋白種類多且不同加工處理對蛋白質的高級結構變化具有隨機性；患者過敏程度不同所需的低敏乳制品程度也不同等。這些問題的研究，也許可以為未來低敏乳制品的加工提供新的方向。