微生物挑戰實驗在食品安全控制方面的研究進展

張祁，韓琳琳，張紅雨，裴曉燕，黃小平，韓曉旭，尹睿杰，鄭艷琴

（1.內蒙古伊利實業集團股份有限公司,呼和浩特 010110；2.內蒙古乳業技術研究院有限責任公司，呼和浩特 010110）

0 引言

近年來，天然成分和清潔標簽的概念日益為消費者所熟知，并且清潔標簽連續登上Innova“全球食品飲料十大趨勢預測”。消費者對食品安全的要求越來越高，使得食品生產企業面臨更多新的挑戰，一方面要生產天然健康的產品，另一方面又要保證產品貨架期的安全性。目前的食品安全，特別是微生物往往過多地依賴于終產品檢測，實際上食品中微生物的控制在最初選料、制定配方、選擇工藝、設計關鍵控制點和設計衛生清潔方案的時候就應該開展[1]。

微生物挑戰實驗可以為食品企業提供產品安全和質量保證的有效信息，更多地了解產品中微生物的特性，包括工藝的殺菌效果、產品配方或者本身的特性對腐敗和致病微生物的抑制效果，企業的衛生和清潔方案是否達到預期的效果[2]。微生物挑戰實驗研究的設計、實施和評估是一項復雜的任務，取決于食品如何研發、生產、包裝、運輸、儲藏和消費，如果在實驗設計中沒有考慮到具體的食品和環境因素，可能導致有缺陷的結論。本文綜述了微生物挑戰實驗在食品安全控制方面的適用范圍，詳述了微生物挑戰實驗的步驟及核心要點，并對微生物挑戰試驗在食品安全評估、研發配方設計、生產工藝驗證等方面的最新研究動態和應用成果進行介紹，以期對食品行業微生物安全控制提供新思路。

1 定義及分類

1.1 定義

微生物挑戰實驗是通過接種相關微生物并在特定條件下儲藏，模擬食品在生產、加工、運輸和后續的再加工過程中受到微生物污染的情況，考察食品防腐體系的抑菌效果，從而保證貨架期內食品微生物指標的安全性[3]。該實驗能夠模擬食品的生產和使用過程中受到高強度微生物污染的潛在可能性和自然界中微生物生長的最適條件，使得測試結果更接近“殘酷的現實”，能經受“嚴峻的考驗”，從而保證食品避免由微生物污染造成的損失和保障消費者的健康[4]。

1.2 分類

按照微生物挑戰實驗的目的不同，可分為食品加工過程的安全性驗證、食品存儲條件和食品貨架期驗證[5]。其中食品加工過程的安全性驗證，可分為物料殺菌工藝挑戰測試（如UHT、巴氏殺菌等）、包材殺菌工藝挑戰測試、無菌灌裝環境挑戰測試；而貨架期挑戰實驗主要用于評估產品貨架期微生物安全性。

2 挑戰實驗的適用范圍

通常下列幾種情況可考慮開展微生物挑戰實驗[6]：（1）判斷食品是否能達到預期的貨架期，或者發現食品不能達到既定的貨架期，希望驗證新的包裝材料或者儲藏溫度是否能延長貨架期達到預定的時間范圍；（2）由于食品在銷售過程中比較容易受到微生物的再污染，可以通過微生物挑戰實驗研究食品配方（如酸堿度、水分活度、防腐劑和鹽分等）能否抑制微生物的生長和毒素的產生；（3）如果既往經驗表明某種特定的致病菌對食品存在潛在的危害，可以通過微生物挑戰實驗判斷生產工藝或者設定的CCP點能否殺滅特定的致病菌；（4）驗證所使用的清洗消毒措施是否達到了預期的微生物控制效果。

并非所有的食品都需要開展微生物挑戰實驗，以下幾種情況不推薦開展微生物挑戰實驗。（1）當食物的特性可以抑制微生物生長時，不需要進行微生物挑戰實驗研究。例如，沒有必要評估p H值為3.5的產品是否支持沙門氏菌的生長，因為沙門氏菌不會在p H如此低的情況下生長。表1列出了常見病原菌的生長p H和水分活度。（2）其他條件相同的情況下，選擇更適合微生物生長條件的挑戰實驗的數據即可，其他條件不需要重復開展測試。例如，對p H為5.8的食品配方中特定致病菌的微生物挑戰實驗研究的結果可以應用于pH為5.4的相似配方中，對于涉及相似組分、酸度和水分活度（Aw）的多種配方，只需測試最有利于微生物生長或存活的配方即可。

表1 常見病原菌的生長pH值及最低生長水分活度（Aw）[7]

3 挑戰實驗的步驟

結合美國、歐盟等權威機構發布的指南[6,8]、國內外相關研究[9]和企業應用實踐，總結微生物挑戰實驗的主要步驟。

3.1 目標微生物的選擇

目標微生物的選擇優先考慮相同配方產品中分離的菌株，如果既往經驗表明某種特定的微生物一直與食品的變質有關，那么這種微生物是最適合的接種物[10]。此外，可以選擇食品加工環境、原輔料等分離出來的菌株。若針對該類別產品未能分離得到菌株，則可以通過查閱食品安全數據庫（如歐盟食品及飼料快速警報系統、美國FDA通報等）或檢索已發表文獻，識別目標微生物。

當天然分離物無法獲得時，可選擇使用標準菌株（如ATCC、CMCC等）作為替代菌株。但是，與天然分離物相比，標準菌株的延遲期更短，生長速率也更快，這可能會影響微生物挑戰實驗的結果，可能發生達到特定數量微生物的時間與實際情況不完全一致。此外，當病原菌不能在加工廠使用時，可以使用其他種類的替代菌株，例如使用生孢梭菌（Clostridium sporogenes）替代肉毒桿菌（Clostridium botulinum）、英諾克李斯特氏菌（Listeria innocua）替代單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）替代沙門氏菌（Salmonella）[11]。

理想的致病菌替代菌株應具備以下特征：①沒有致病性；②具有穩定和一致的生長或生存特性，如暴露于相同的配方或處理因素(p H、溫度敏感性、耐氧性等)時，與目標病原體有很強的相似性；③失活特性和動力學與目標病原體相似；④具備易于培養、時間穩定、種群密度高，在混合環境中易于計數和區分；⑤基因穩定，可確保結果的可重復性，不受實驗室或實驗時間的影響；⑥應激和損傷敏感性與目標病原體相似[12]。

3.2 菌液制備

當菌株從冷凍或凍干狀態復蘇時，應在非選擇性生長培養基中連續轉接一到兩次。轉接次數應盡量減少，以避免影響菌株表型特性的遺傳變化。AOAC國際實驗室指南[13]指出，標準菌株的轉接次數不應超過5次，多次轉接容易丟失質粒或其他遺傳標記。

菌株的培養需要在每個菌株的最佳生長條件下進行。在大多數情況下，復蘇在菌株最佳生長條件下培養18～24 h；針對于某些菌株（例如某些酵母）也會使用48或72 h的培養。菌懸液的制備可以通過培養液和平板培養兩種方式獲得，相關研究結果表明通過平板上收集的菌體比在培養液中收集的菌體具有更強的生存潛力，可以代表微生物挑戰實驗中最壞的情況[14]。

3.3 接種方法

微生物挑戰實驗主要分為混合菌種接種法和單菌種接種法，通過在待測樣品中接種一種或多種微生物，放置微生物于最適宜的條件下培養，觀察待測樣品不同時間內微生物總數，評估待測食品防腐體系的抑菌效果[15]。由于混合接種法更能代表實際污染的條件和狀況，因此混合接種的方法更容易被生產企業所采用和接受[16]。在混合接種培養時，可能會存在一定程度的競爭生長，特別是在使用革蘭氏陰性菌株混合的情況下，導致其他混合菌的生長慢一些。為了盡量減少菌株競爭的影響，建議盡可能避免混合革蘭氏陰性菌株[6]。

接種體積也是影響實驗成功的關鍵參數。應盡可能減少所用菌液的體積，同時確保食品特性發生最小的變化。通常，接種體積不應超過食物體積的1%，甚至更少[14]。接種后需要確保接種物均勻分布在食品中，以最大限度地減少后續對挑戰生物體的取樣和計數的錯誤，同時最大限度地使微生物暴露在食品環境中。可通過無菌注射、浸漬、霧化等方式對樣品進行接種[17]。

3.4 接種量

食品每單位重量或體積的接種量必須符合實際，并與微生物挑戰實驗的目的直接相關。如果實驗的目的是評估一種食品在特定時期內的安全性和穩定性，初始接種量應在每克或每毫升食品100～1 000 CFU之間[6]。如果微生物腐敗菌經常導致產品變質或預計產品內腐敗菌數量并不多，則需要將接種量加倍或者降低，例如Uyttendaele等[18]在肉制品單增李斯特氏菌的研究中采用低接種量（1～10 CFU/g）。而在開展微生物殺菌驗證時，接種量可以達到每克或每毫升食品106～108CFU或者更多，以證明挑戰微生物的對數下降。例如，低酸性罐頭食品中肉毒梭菌12D的降低，即食冷凍食品中的單核增生李斯特菌6D的降低，巴氏殺菌乳中沙門氏菌10D的降低[19]。

3.5 持續時間

微生物挑戰實驗的持續時間取決于產品當前的或期望的貨架期，需要覆蓋以上所有的時間，并且還應包括此時間以外的安全裕度，以保證消費者存儲產品超過包裝建議使用貨架期的情況。根據食品的貨架期，微生物挑戰試驗持續時間建議比食品的預期貨架期長25%（例如，貨架期為3～6個月的食品）至50%（例如，貨架期為7～10 d的食品）[6]；也有研究直接按照1.3倍貨架期進行測試[9]。對于一些在預期貨架期結束時仍然具有可接受感官特性的食品，可以繼續研究直至發生明顯的腐敗，以對某些消費者可能會繼續消費食品直到其出現腐敗的情況進行安全評估。

3.6 采樣間隔

根據微生物挑戰實驗的持續時間，采樣需要覆蓋儲存期間所有具有代表性的時間點。如果食品的保質期較短，則需要每天抽樣；如果食品的保質期較長，則需要每周抽樣1至2次。在微生物挑戰實驗中，樣品至少需要5到7個采樣點才能準確地給出接種物在儲存期間的變化趨勢；如果食品的保質期長，可能需要至少7個以上的采樣點。當挑戰研究過程分析微生物的量已經達到每克或每毫升食品108CFU時，就沒有必要繼續取樣[6]。

可復制性是微生物挑戰實驗準確、有效的重要因素。理想情況下，應在每個采樣點進行二到三次平行測試，結合企業生產實踐對于關鍵的采樣點甚至可以提高到5次平行測試。在每個采點樣應分析未經接種處理的對照樣本，以確定貨架期內背景微生物的情況。

3.7 儲存條件

接種食品的存儲需要復制食品在正常存儲條件下可能暴露的條件。此外，還應考慮在運輸或零售過程中儲存條件發生改變的最壞可能性。儲存條件，特別是儲存溫度，會嚴重影響微生物挑戰實驗的持續時間。挑戰研究中使用的儲存溫度應代表食品在銷售和儲存期間暴露的預期溫度范圍。濕度也應被視為儲存條件的一個因素，對于含水率會隨環境濕度條件的變化而變化的食品，微生物挑戰實驗研究的條件應包含代表性的環境濕度變化。

微生物挑戰實驗研究還需要考慮其他儲存條件，包括包裝的類型和包裝內氣體的性質。理想情況下，測試樣品應保存在與售賣相同的包裝中。如果商業食品是真空包裝或氣調包裝（MAP），那么微生物挑戰研究的樣品應該使用相同的包裝或包裝膜。

3.8 結果分析

在微生物挑戰實驗開始之前，非常重要的是確定食品通過和失敗的標準。目前還沒有適用于所有結果分析的原則，需微生物專家結合食品安全標準、企業控制要求、配方組成和售賣條件等情況明確指導意見。一般來說，在整個食品預期的貨架期和重復實驗中，微生物的生長增加超過1～2個LOG，或者在連續兩個抽樣間隔的樣本中檢測到毒素，或者產品已嚴重腐敗，不再適宜食用，則可終止微生物挑戰實驗研究[20]。對于致病菌有更為嚴格的要求，國際食品法典委員會發布的指南（CAC/GL 61-2007），針對不支持單增李斯特氏菌生長的即食食品，要求至少在制造商標識的預期貨架期內，單增李斯特的增長水平不應超過0.5 log CFU/g[21]。

4 微生物挑戰實驗在食品工業的應用

4.1 食品安全評估

為了保障即食食品安全，歐盟、加拿大等政府分別制定了微生物挑戰實驗指南。歐盟發布了《即食食品中單核細胞增生李斯特菌的挑戰測試能力實驗室實施評估指南》，目的是制定統一的方法，評價進行微生物挑戰實驗的實驗室能力，以符合歐盟EC 2073/2005條例中規定的食品安全標準[22]。加拿大發布《即食食品的肉毒梭菌挑戰測試》，以確定肉毒梭菌是否能在即食食品中生長并產生毒素[23]。

國內外相關研究運用微生物挑戰實驗進行安全性評估。Gérard等[24]通過挑戰實驗測定不同類型奶酪中單核增生李斯特菌的生長潛力，采用3種菌株的混合菌對32個工廠生產的奶酪進行分析，評估半硬質乳酪的安全性。王鐵龍等[25]通過建立一套風險挑戰方法對釀造醬制品進行研究，根據食品的目標菌酵母菌和金黃色葡萄球菌，結合食品情況分析出最大污染程度進行接種，測定相關指標，得出釀造醬制品對酵母菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用。

4.2 研發配方設計

微生物挑戰實驗在研發確定食品配方微生物安全和穩定性方面提供關鍵信息，挑戰實驗可以幫助回答特定的食品配方是否有利于或抑制其生長；在更改選用原料和配方時，是否可以保障產品貨架期穩定。

李文茹等[4]在廣東某調味品廠醬油更換新的防腐劑配方后，對該醬油新的防腐體系的抑菌效果進行了微生物挑戰實驗研究，從添加防腐劑的成品醬油中進行了微生物的篩選和菌種鑒定，并對該醬油的防腐體系進行了微生物挑戰實驗和抗二次污染實驗研究，對該醬油的防腐體系的抑菌效能做出合理的評價。黃小青等[26]利用微生物挑戰實驗探究了傳統豆醬的防腐體系對不同微生物的抑制效果，在無菌條件下，分別向等量的傳統豆醬中接入產膜酵母、米曲霉菌和耐鹽性乳酸菌菌懸液，密封放置，觀察不同時期傳統豆醬微生物菌落總數變化情況。研究結果表明，傳統豆醬密封條件下，其防腐體系在28 d內可將產膜酵母、米曲霉以及耐鹽性乳酸菌的濃度從104CFU/g降低到小于10 CFU/g。與密封條件相比，敞口條件下其防腐體系對產膜酵母及耐鹽性乳酸菌具有相同的殺菌能力，然而米曲霉在28 d后仍有7.9×102CFU/g，表明傳統豆醬在封口條件下對霉菌、酵母和乳酸菌都有明顯抑制效果。

4.3 生產工藝驗證

微生物挑戰實驗可以用來驗證生產工藝和設定的關鍵控制點，對指導生產和衛生清潔方案改進有積極作用，通過數據支撐為生產工藝驗證提供保障；微生物挑戰實驗在驗證針對目標微生物或目標生物群體的致死率也起著重要的作用，特別是新的殺菌工藝的引入，往往通過挑戰試驗進行驗證。

食品企業在開展殺菌工藝驗證時，通常會接種陽性菌株以驗證設備的殺菌效率。呂曉英[27]等采用微生物挑戰試驗對獼猴桃汁射頻殺菌工藝進行研究，通過正交實驗得出射頻殺菌的最優條件為：極板間距105 mm、處理時間210 s、獼猴桃汁厚度為45 mm，該條件下射頻處理可使獼猴桃汁中的沙門氏菌下降8個以上數量級。Wei xinxiao等[28]利用微生物挑戰試驗研究了水活度對奶粉中沙門氏菌熱失活動力學的影響，將脂肪含量不同的兩種奶粉（分別為0.62%和29.46%wt/wt），脫脂奶粉和全脂奶粉，分別接種5株沙門氏菌混合物，并于3個水分活度（0.10、0.20、和0.30)，3種溫度梯度（75、80和85℃）進行殺菌處理，研究結果表明沙門氏菌的耐熱性隨著水分活度的降低而顯著增加，這表明在低水分活度下需要更高的溫度或更長的加工時間才能實現所需的沙門氏菌滅活。

4.4 包裝安全性評估

食品包裝是食品的外部保護，是食品免受微生物污染的重要屏障，隨著新型包裝材料和形式的推廣使用，食品的保質期得到了極大的延長，挑戰試驗可以驗證更換包裝后的微生物安全性。

近年來，食品用抗菌包裝的研究逐漸成為熱點，例如金屬氧化物納米顆粒（如銀、銅、鋅等）與微生物直接相互作用并表現出優異的抗菌效率，Jian等[29]開展的挑戰實驗表明，含有納米氧化鋅的包材對致病菌有很強的抑制作用，接種109CFU/mL大腸桿菌和金黃色葡萄球菌貨架期的抑菌率分別達到99.20%和84.70%，證明新包材的應用可有效延緩產品變質過程。鄧雯瑾等[30]對百里香精油抗菌涂層包裝的抑菌性進行了研究，將生菜懸浮于熒光假單胞菌懸浮液進行接種，常溫靜置15 min以去掉多余的水分，使初始接種量為104～105CFU/g，分別在4℃下保藏1～5 d，結果表明在貯藏第1天，抗菌薄膜包裝后樣品中熒光假單胞菌比PE保鮮膜組低4.25個對數值，顯著低于PE保鮮膜組(P＜0.05)，說明抗菌包裝能有效抑制鮮切生菜中熒光假單胞菌的生長。

4.5 貨架期安全性評估

如果食品被致病菌或腐敗微生物污染，可以利用微生物挑戰實驗判斷貨架期是否穩定。微生物挑戰實驗研究也有助于確定某些冷藏或常溫儲存食品的潛在保質期。

康奈爾大學Buehler等[31]采用微生物挑戰實驗的方法向希臘酸奶中接種酵母和霉菌混合物（包含5種酵母菌和1種霉菌），其接種濃度為101和103CFU/g，分別代表低水平和高水平的霉菌和酵母污染，以評估貨架期內添加菌種保護劑和不添加菌種保護劑對霉菌和酵母的抑制情況，結果表明所評估的2種市售菌種保護劑可控制霉菌的表面生長，但在7℃保藏超過76 d時，不能抑制酵母的生長。Varalakshmi等[32]通過微生物挑戰實驗確認食品在4℃條件下保質期內是否支持單核增生乳桿菌的生長，并評估食品工業通常使用的保存技術對控制食品中單核增生乳桿菌的生長是否有效。

5 結語

隨著產品口味的多樣化及加工過程的復雜化，隨之而來的微生物風險不斷增加，對產品微生物風險控制形成了巨大的挑戰。消費者對健康食品的偏好也增加了對新配方的安全性和穩定性的驗證要求。微生物挑戰實驗作為一種有效的工具，可以為生產企業評估產品配方、生產加工工藝、以及貨架期微生物安全性等關鍵問題，進而為配方設計、生產線上建立關鍵控制點提供強有力的數據支撐和有效指導[20]。

但微生物挑戰實驗也有其局限性，整個實驗過程長，且測試成本較高。此外，微生物挑戰實驗設計的難度在于沒有標準統一的方法，需要專業人員根據產品特點、工藝參數、運輸和儲存條件，以及可能污染的途徑等對不同的產品給出特定的方案和選擇適當的目標微生物。為了提升食品研發效率，大幅縮短貨架期研究時間，生產企業迫切需要微生物挑戰實驗的數據開發預測微生物模型，通過模型更加快速的評估研發、儲運和零售環節產品的安全性。