基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究紅花治療阿爾茨海默病的作用機(jī)制

譚冬嫻，陳棉海，郭晉言，黃一興，肖越，陳倩文，周玉其，張維炊，杜以寬，楊春?

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)東莞市干細(xì)胞與再生組織重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞 523808；2.東莞市人民醫(yī)院，廣東 東莞 523059）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）又稱老年癡呆癥，由腎精虧虛、氣血虧虛的本虛，與痰和瘀的標(biāo)實(shí)引起，屬虛實(shí)夾雜之癥，臨床上可通過服用補(bǔ)虛藥、活血化瘀藥等來促進(jìn)治療，如六味地黃丸、健脾養(yǎng)心益智湯等［1］。紅花（CF），別名紅藍(lán)花，入心、肝經(jīng)，屬菊科，紅花屬植物，有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效。藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有改善Aβ沉積、炎性損傷、氧化損傷與擴(kuò)張血管改善微循環(huán)等作用［2-3］。紅花為活血化瘀藥，臨床上常用于治療由微循環(huán)障礙引起的疾病，如腦梗死、冠心病、阿爾茨海默病等［4-6］。含有紅花的復(fù)方制劑如癲狂夢(mèng)醒湯、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯、二十五味珊瑚丸等在臨床治療AD中卓有成效，但由于其成分靶點(diǎn)眾多，很難確定其具體機(jī)制。單味藥使用的紅花注射液對(duì)腦部疾病也有一定療效，因此對(duì)紅花本身的潛在作用機(jī)制進(jìn)行研究，有助于更好地處理紅花臨床常用劑量、配伍及量效之間的關(guān)系［7-10］。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)紅花的有效成分及紅花與AD的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析，以期為臨床上應(yīng)用紅花治療AD提供研究基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 紅花活性成分的篩選

通過查閱文獻(xiàn)和TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）獲取紅花活性化學(xué)成分。基于藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)紅花的活性成分進(jìn)行篩選，以化合物的口服生物利用度（OB） ≥ 30%、化合物的類藥性（DL） ≥ 0.18作為篩選條件，并通過文獻(xiàn)收集補(bǔ)充紅花有效成分［11］。

1.2 紅花靶點(diǎn)的獲取

將收集到的活性成分導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中，以復(fù)合最佳匹配為條件搜索，收集化合物2D結(jié)構(gòu)。以SDF格式導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetpre diction.ch/）中，將數(shù)據(jù)下載到Excel表中，以Possibility ＞ 0為條件篩選并去除重復(fù)值，得到紅花的成分靶點(diǎn)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.Uniprot.org）中的Uniprot KB檢索功能對(duì)基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后歸納整理。

1.3 AD相應(yīng)靶點(diǎn)的獲取

在OMIM數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/）和GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中，以“Alzheimer's disease”為關(guān)鍵詞檢索AD相關(guān)的基因，分別從OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲取信息，合并數(shù)據(jù)。

1.4 “藥物－成分－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

紅花活性成分的分子式分別由CF1～CFn表示（CF為紅花的英文縮寫），將紅花成分和作用靶點(diǎn)運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物－成分－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中，活性成分與蛋白靶點(diǎn)由節(jié)點(diǎn)（node）表示，節(jié)點(diǎn)之間相連的為邊（edge）。根據(jù)介度（betweenness centrality，BC）、緊密度（closeness centrality，CC）以及連接度（Degree）的中位數(shù)分析紅花發(fā)揮治療AD作用的核心靶點(diǎn)。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在Jvenn網(wǎng)站（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）中導(dǎo)入紅花和AD的靶點(diǎn)基因，獲得交集基因并用韋恩圖展示。將交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//string－db.org/）中，以“HOMO SPAINS”為條件進(jìn)行搜索，選擇0.40和0.70分別作為紅花的中度相關(guān)閾值與高度相關(guān)閾值，將結(jié)果中的Node1、Node2導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，使用Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析計(jì)算，構(gòu)建“蛋白-蛋白相互作用”（Protein－protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)BC、CC以及Degree值的中位數(shù)來預(yù)測(cè)紅花治療AD的靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)核心。

1.6 紅花治療阿爾茨海默病的通路富集分析

基因本體論（GO）分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析可以提供靶點(diǎn)基因的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和系統(tǒng)可視化信息。本研究利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO分析和KEGG功能注釋和富集分析，在微生信工（http：//www.bioinformatics.com.cn/）中以“P≤ 0.05”的條件，并根據(jù)生物學(xué)信息篩選出顯著富集的生物學(xué)注釋，繪制GO分析圖與KEGG分析氣泡圖，用于預(yù)測(cè)紅花治療AD的通路。

1.7 紅花活性成分－靶點(diǎn)分子對(duì)接

利用LEDOCK分子對(duì)接軟件，將紅花中活性成分與位于網(wǎng)絡(luò)分析中的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，以探究活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合程度。

2 結(jié)果

2.1 紅花活性化學(xué)成分篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫共收集到189種成分。基于ADME參數(shù)（OB） ≥ 30%、（DL） ≥ 0.18條件初步篩選中藥成分，得到22個(gè)成分。經(jīng)PubChem數(shù)據(jù)庫檢驗(yàn)有20種活性成分入選，研究表明［11］，羥基紅花黃色素A（Hydroxysafflor yellow A，HSYA）是紅花的重要成分，TCMSP數(shù)據(jù)庫無羥基紅花黃色素A的數(shù)據(jù)，因此在PubChem數(shù)據(jù)庫搜索Hydroxysafflor yellow A，得到成分信息（其Molecule ID為Compound CID： 6443665），將其補(bǔ)充納入。對(duì)每一個(gè)化合物進(jìn)行編號(hào)，包括黃酮、生物堿、有機(jī)酸類、甾族類等成分，總計(jì)21種活性化學(xué)成分，見表1。其中Molecule ID是成分的身份信息，Molecule name是成分的化合物名稱，Component number代表成分用紅花的英文縮寫進(jìn)行排序的編碼。

表1 紅花的21個(gè)活性化學(xué)成分

2.2 紅花活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)

將篩選出的21個(gè)成分導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫，收集化合物的2D結(jié)構(gòu)。以SDF格式導(dǎo)入到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，獲取并篩選出紅花有效成分靶點(diǎn)839個(gè)，去除重復(fù)值得到391個(gè)靶點(diǎn)。

2.3 阿爾茨海默病相關(guān)靶點(diǎn)

以“Alzheimer's disease”為關(guān)鍵詞，在OMIM數(shù)據(jù)庫搜索，點(diǎn)擊options選擇OMIM，點(diǎn)擊*GENE WITH KNOWN SEQUENCE（*代表基因），再次搜索得到198個(gè)基因；在GeneCards數(shù)據(jù)庫中搜索并導(dǎo)出到Excel表提取Gene Symbol中Relevance Score ＞ 0的基因，得到535個(gè)基因，合并數(shù)據(jù)信息并剔除重合基因，最終得到608個(gè)與AD相關(guān)的靶點(diǎn)信息。

2.4 紅花有效成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物－成分－靶點(diǎn)”的PPI網(wǎng)絡(luò)。綠色方形代表紅花，藍(lán)色菱形代表紅花的活性化合物，青色八邊形代表靶點(diǎn)基因，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)共有419個(gè)節(jié)點(diǎn)（1個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)，21個(gè)有效成分節(jié)點(diǎn)和397個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和1 303條邊。經(jīng)Network Analyzer計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)（見表2），BC和CC中位數(shù)分別為0.000 092 57和0.300 935 93，Degree值中位數(shù)2倍為4。核心節(jié)點(diǎn)需要滿足以上參數(shù)的中位數(shù)卡值。分析發(fā)現(xiàn)木脂素（lignan）、Kinobeon A的值較大；其次是除蟲菊酯Ⅱ（Pyrethrin Ⅱ）、6－羥基柚皮素（6－Hydroxynaringenin）等，這些參數(shù)較高的關(guān)鍵有效分子提示可能在紅花治療AD的藥理功能發(fā)揮相對(duì)重要的作用。

表2 21個(gè)紅花化學(xué)成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲?/p>

圖1 紅花的“藥物－成分－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 紅花活性成分－靶點(diǎn)－阿爾茨海默病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將紅花成分靶點(diǎn)與AD的靶點(diǎn)導(dǎo)入Excel中，獲得交集靶點(diǎn)。進(jìn)一步通過在線可視化作圖網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制韋恩圖，分析紅花成分靶點(diǎn)與AD之間的靶點(diǎn)交集，見圖2。發(fā)現(xiàn)紅花成分靶點(diǎn)與AD之間有94個(gè)共同靶點(diǎn)，常見靶點(diǎn)為AKT1、CASP3、TNF、MAPK3、APP、SRC、MAPK8、EGFR、PTGS2和MTOR。

圖2 紅花成分靶點(diǎn)與阿爾茨海默病靶點(diǎn)的韋恩圖

將上述94個(gè)靶點(diǎn)上傳到STRING數(shù)據(jù)庫中，繪制紅花治療AD的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化分析。節(jié)點(diǎn)的大小和顏色與Degree值呈正相關(guān)，Degree值越大，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，表明靶點(diǎn)在此網(wǎng)絡(luò)關(guān)系越重要。以0.4為閾值的PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖3），通過Cytoscape 3.7.2軟件計(jì)算得到BC ≥ 0.003 295 94、CC ≥ 0.522 471 911及Degree ≥ 34（中位數(shù)2倍），篩選出核心靶點(diǎn)AKT、CASP3、MAPK3、TNF、APP、MTOR、MAPK8等，位于網(wǎng)絡(luò)中心且總體得分較高（見表3）。進(jìn)一步研究通過構(gòu)建以0.7為閾值的PPI網(wǎng)絡(luò)來計(jì)算共同靶點(diǎn)基因（見圖4），刪除未連接的節(jié)點(diǎn)得到BC ≥ 0.004 922 21、CC ≥ 0.394 559 855以及Degree ≥ 12（中位數(shù)2倍），該網(wǎng)絡(luò)顯示APP、AKT、MAPK3、MAPK8位于網(wǎng)絡(luò)的中心。在紅花治療AD的作用靶點(diǎn)位于中心位置的結(jié)果提示其可能在紅花的藥理作用中發(fā)揮重要作用。

圖3 0.4閾值下的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 0.7閾值下的PPI網(wǎng)絡(luò)

表3 核心靶點(diǎn)在蛋白－蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)渲?/p>

2.6 紅花有效成分靶點(diǎn)的功能通路注釋

本研究中共富集535個(gè)GO條目，選取P值最小的前15個(gè)GO條目作圖（其中P＜ 0.05），見圖5。Y軸代表GO條目，X軸和條形圖面積大小代表目標(biāo)基因集中屬于GO的基因數(shù)量。在生物過程（BP）中，共同靶點(diǎn)主要富集于對(duì)藥物的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、蛋白質(zhì)自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)控等。在細(xì)胞組分（CC）中，共同靶點(diǎn)主要富集于線粒體、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、受體復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜等。在分子功能（MF）方面，共同靶點(diǎn)主要與蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、酶結(jié)合、ATP結(jié)合及激酶活性等有關(guān)。

圖5 GO生物過程分析

KEGG通路富集共獲得43條富集通路，根據(jù)P值最小的前10個(gè)通路結(jié)合生物學(xué)注釋篩選繪制氣泡圖（見圖6）。Y軸代表Pathway名稱，X軸和氣泡面積大小代表目標(biāo)基因集中屬于該條信號(hào)通路的基因數(shù)量，氣泡顏色代表富集顯著性，即P值的大小。這些常見靶點(diǎn)在阿爾茨海默病、ErbB信號(hào)通路、5－羥色胺能突觸、癌癥中的蛋白多糖、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、百日咳、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路、癌癥的途徑、膀胱癌中富集。使用這一系列實(shí)際測(cè)試的分析，可以提供有價(jià)值的信息，解釋紅花治療AD可能的機(jī)制。

圖6 KEGG通路富集分析

2.7 紅花核心成分－靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

以蛋白質(zhì)相互作用中程度得分較高的10個(gè)核心靶點(diǎn)與紅花核心成分進(jìn)行分子對(duì)接，獲得對(duì)接得分Score，見表4。一般認(rèn)為Score值 ＜ -5 kJ/mol表示化合物與靶點(diǎn)之間有較好的結(jié)合活性。分子對(duì)接結(jié)果表明核心化合物木脂素（lignan）、Kinobeon A、除蟲菊酯Ⅱ（PyrethrinⅡ）和6－羥基柚皮素（6－Hydroxynaringenin）與APP、AKT、MAPK3、MAPK8的Score均 ＜ -5 kJ/mol，說明核心化合物與核心靶點(diǎn)之間有較好的結(jié)合活性。獲得分子對(duì)接模式見圖7。

圖7 成分－靶點(diǎn)對(duì)接相互作用模式圖

表4 分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

血管假說提出，血管危險(xiǎn)因素會(huì)破壞正常的腦血流動(dòng)力學(xué)，進(jìn)一步引起與神經(jīng)炎癥密切相關(guān)的氧化應(yīng)激，長(zhǎng)此以往導(dǎo)致β淀粉樣蛋白（Aβ）清除率下降，造成Aβ沉積，而這又進(jìn)一步促進(jìn)氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥，加劇AD進(jìn)程［12］。研究認(rèn)為，動(dòng)脈狹窄、動(dòng)脈硬化以及微血管功能障礙等血液循環(huán)系統(tǒng)疾病能促使Aβ生成增加，因此與AD的發(fā)展密切相關(guān)［13］。《血證論》中指出：“凡心有瘀血，亦令健忘血在上則濁蔽而不明矣。凡失血家猝得健忘者，每有瘀血”。這些提示了治療AD可以采用活血化瘀藥物，而紅花是典型的活血化瘀、改善微循環(huán)的良藥，紅花復(fù)方劑健腦散、滌痰湯加減等就用于治療AD［14-15］。

本研究中，筆者篩選出21個(gè)紅花活性成分，羥基紅花黃色素A（HSYA）被認(rèn)為是紅花的重要成分，因此也將其補(bǔ)充納入［11］。槲皮素可以下調(diào)IL－6、IL－1β、TNF－α、COX－2、iNOS的基因表達(dá)，改善淀粉樣前體蛋白/早老素1（APP/PS1）小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力與炎癥反應(yīng)［16］。山柰酚可以抑制Caspase－3、Caspase－9以及AchE活性，抑制Aβ誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，減輕AD果蠅的神經(jīng)毒性運(yùn)動(dòng)與認(rèn)知障礙［17］。這表明紅花成分可以通過減緩神經(jīng)炎癥與氧化應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)腦組織的作用。KEGG顯示神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路與阿爾茨海默病信號(hào)通路中富集較多關(guān)鍵靶點(diǎn)。有研究表明，木脂素在OBX小鼠海馬組織中誘導(dǎo)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括蛋白激酶B（Akt）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），通過促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通路相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)水平來發(fā)揮治療作用［18］。木犀草素既可以上調(diào)海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)和激活A(yù)kt、ERK和CREB信號(hào)通路營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元，也可以通過阻斷核因子κB（NFκB）和激活蛋白－1（AP－1）信號(hào)通路以及下調(diào)Toll樣受體4和5在大鼠腦組織中的表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用［19-20］。由此可見，紅花的有效成分可通過Akt途徑對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路起調(diào)節(jié)作用。HSYA不僅可能通過血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）介導(dǎo)的磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路的激活，發(fā)揮對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，還可能通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，尤其是ERK1/2途徑和氨基酸激酶（JNK）途徑，發(fā)揮顯著抑制大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷引起的神經(jīng)功能損傷的作用［21-22］。黃芩素會(huì)抑制PI3K/Akt通路中p－PI3K、p－Akt、Caspase－3蛋白的表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡及氧化反應(yīng)，緩解Aβ對(duì)PC12細(xì)胞的損傷［23］。這表明紅花成分可以通過PI3K/Akt與MAPK途徑對(duì)阿爾茨海默病通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，另外這也提示了紅花成分對(duì)AD的調(diào)節(jié)可能具有雙向性，猜測(cè)紅花成分的劑量變化可能產(chǎn)生毒性作用，因此在制備紅花提取物時(shí)應(yīng)調(diào)整好劑量。

分子對(duì)接的結(jié)果顯示，木脂素與APP、MAPK、AKT等有較好的結(jié)合活性。研究發(fā)現(xiàn)，木脂素不僅能促進(jìn)Bcl－2并抑制Bax的表達(dá)，促進(jìn)p－Akt活性，還對(duì)APP代謝具有一定的調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮神經(jīng)損傷的保護(hù)作用［24-25］。另外，厚樸酚（新型木脂素）也可以通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶－3（PI3K/Akt/GSK-3）途徑抑制神經(jīng)炎癥，減輕Aβ沉積，發(fā)揮改善認(rèn)知缺陷的效果［26］。這提示了分子對(duì)接的準(zhǔn)確性。另外，分子對(duì)接中的其他成分Kinobeon A與Pyrethrin Ⅱ，前者顯示出了優(yōu)越的抗氧化性，且清除超氧陰離子的能力大于天然抗氧化劑木脂素或槲皮素［27］，提示Kinobeon A有治療氧化應(yīng)激損傷引起的疾病的潛力。而后者屬于除蟲菊酯的一種，研究認(rèn)為擬除蟲菊酯可使機(jī)體產(chǎn)生大量ROS，通過影響腦內(nèi)抗氧化物水平對(duì)腦組織造成氧化應(yīng)激損傷，但由于對(duì)Pyrethrin Ⅱ本身的研究甚少，因此其是否能作為治療AD的成分還有待考察［28］。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)紅花活血化瘀、改善微循環(huán)的作用，與發(fā)揮抗炎、抗氧化的生物活性密切相關(guān)。猜測(cè)其改善AD的機(jī)制為通過調(diào)節(jié)APP、CASP3、TNF等靶點(diǎn)，降低神經(jīng)炎癥水平，減緩腦損傷細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制自由基的產(chǎn)生，下調(diào)氧化應(yīng)激水平，并調(diào)控Akt與MAPK等途徑，發(fā)揮改善由血液循環(huán)障礙引起的腦細(xì)胞損傷的作用，減輕Aβ沉積，從而延緩AD的發(fā)生。另外，研究顯示擬除蟲菊酯會(huì)對(duì)腦組織起到負(fù)面影響，因此分子對(duì)接中的成分Pyrethrin Ⅱ還有待在未來做出進(jìn)一步的研究。