降解山楂汁中檸檬酸乳酸菌株篩選及降酸工藝優化研究

高 雅，王 琛，李 瀟，張曉黎，韓艷秋，吳興壯

（遼寧省農業科學院食品與加工研究所，沈陽 110161）

山楂果實中有機酸特別是檸檬酸含量很高[1]，很大程度影響加工成品的市場消費。為使山楂果汁達到合適的糖酸比例，在加工過程中會添加大量的糖來改善口感，但這樣會導致市場上的山楂果汁含糖量較高，與目前流行的低糖消費理念大相徑庭[2]。目前，果汁或果酒采用的降酸方法有化學降酸法、物理降酸法和生物降酸法，但化學降酸法對產品品質有較大影響，物理降酸法易導致產品穩定性變差，而生物降酸優勢則非常突出[3]。以植物乳桿菌、發酵乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌、檸檬明串珠菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌7種乳酸菌為研究對象，比較菌株在檸檬酸培養基中的生長曲線及其在山楂果漿中的生長情況和降酸效果，篩選出可代謝檸檬酸的乳酸菌，從而實現山楂汁的有效降酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂：購置于農貿市場；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LNJ005 由研究單位自行分離保存；發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）BNCC194390、短 乳 桿 菌（Lactobacillus brevis）BNCC337373、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）BNCC134415、檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）BNCC194779、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）BNCC186447、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）BNCC189793：購自北納創聯生物技術有限公司，菌種分別編號為G1-G7。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD 型單人單面工作凈化臺：上海滬凈醫療器械有限公司；CJ50-3疊加式培養箱：上海程捷儀器設備有限公司；YXQ-LS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；756型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；5975C 液相色譜-質譜聯用儀（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）：安捷倫科技有限公司。

1.3 培養基的制備

液體MRS 培養基配置：葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母浸粉0.4%，牛肉膏0.5%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸三銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸錳0.005%，硫酸鎂0.02%，吐溫-80取1 mL，121 ℃滅菌20 min。

檸檬酸液體培養基配置：在MRS 液體培養基的基礎上加20%檸檬酸。

1.4 試驗方法

1.4.1 基礎理化指標測定方法 pH 值用pHS-3C 雷磁pH計測定；總酸（以檸檬酸計）采用酸堿滴定法測定，參考GB/T 15038—1994；檸檬酸參照國家標準GB 5009.157—2016 食品中有機酸的測定（高效液相色譜法）；含量計算采用歸一化法。

1.4.2 山楂果漿制備方法 取市售無霉爛變質、成熟度基本一致的新鮮山楂，洗滌去核后按1∶1 加水，加熱軟化，隨后打漿。冷卻后加入果膠酶(1 mL/L)，再置于53 ℃水浴中浸提，經壓榨過濾制得山楂果漿。

1.4.3 試驗菌株生長曲線的測定 將7 株試驗菌株在液體MRS中活化培養24 h，調節OD600值為1.00，以2%（v/v）接種量將對數生長期的菌株擴大培養，再以2%的接種量接入檸檬酸培養基中。27 ℃下每隔2 h 測定OD600值，并繪制菌株生長曲線，從而對菌株進行篩選。

1.4.4 試驗菌株在山楂果漿中的生長情況 將7 株試驗菌株培養至對數生長期，以4%（v/v）的接種量接入山楂果漿中，接種后每隔24 h 取樣進行活菌計數，分析不同試驗菌株在山楂果漿中的生長能力。

1.4.5 試驗菌株在山楂果漿中的降酸效果 將7 株試驗菌株培養至對數生長期，以4%（v/v）的接種量接入山楂果漿中，接種后發酵12 d 取樣，測定其pH 值及總酸、檸檬酸含量，分析菌株對山楂果漿的降酸能力。降酸能力以檸檬酸的減少率來計算。

1.4.6 降酸工藝優化研究 取50 mL 山楂汁裝入錐形瓶中，并根據之前的篩選結果，選取具有較好降酸效果的菌株，再通過單因素分析來確定發酵溫度、發酵時長、菌株接種數量下降酸率的變化情況。選擇3種指標的優勢范圍，進行三因素三水平的降酸率分析。

1.4.7 數據處理 采用SPSS 19.0軟件進行相關數據分析。

2 結果與分析

2.1 試驗菌株的生長曲線

在檸檬酸液體培養基中開展菌株篩選試驗，發現共有7種菌株能與檸檬酸發生反應。繪制7種菌株的生長曲線，如圖1所示。

圖1 各菌株生長曲線Figure 1 Growth curves of each strain

從圖1中可以看出，菌株在24～28 h 的擴增數據較快，G7菌株在28～40 h擴增數據較快，調整期約為8 h，之后進入對數增長期，最后趨于穩定。G1 與G5菌株在液體培養基中菌數較多，而G3 和G4 最少，且生長能力弱、生長緩慢。因此，得出植物乳桿菌G1和檸檬明串株菌G5 生長能力較強，可作為降檸檬酸的菌株。

2.2 試驗菌株在山楂果漿中的生長情況

將7個菌株應用于山楂果汁中，可顯著改善其發酵性能，促進其發酵過程。乳酸菌發酵的活菌數變化情況如圖2所示。

圖2 乳酸菌發酵的活菌數變化Figure 2 Changes in the number of viable bacteria of lactobacillus fermentation

在山楂汁的發酵環境中表現出了足夠快的代謝速度和增殖速度，并保持了良好的生長勢頭。在培養初始狀態下，G5菌株的活菌數略高于其他菌株的活菌數。隨著培養時間的增加，7 種菌株的活菌數呈現出逐漸上升的趨勢，并逐漸接近，到達12 h 后，活菌數則呈現出下降趨勢，表明在一定時間內，菌株數量不再增加，但是G5 菌株的數量始終高于其他菌株，由此可以得出G5 菌株在山楂汁的發酵環境中表現出了足夠快的代謝速度和增殖速度。

2.3 試驗菌株在山楂果漿中的降酸效果

測定試驗菌株發酵后在山楂果漿中的酸性指標，見表1。

表1 試驗菌株發酵后在山楂果漿中的酸性指標Table 1 Acid index of test strains in hawthorn pulp after fermentation

由表1 可以看出，菌株發酵后，山楂果漿的總酸含量變化并不明顯，而pH值均高于對照組，表明發酵過程中微生物促使新的有機酸轉化產生。通常情況下，乳酸菌發酵代謝會產生乳酸，這就說明乳酸對降酸有一定的影響。各菌株在山楂果漿中的降酸率如圖3所示。

圖3 試驗菌株在山楂果漿中的降酸效果Figure 3 The acid lowering effect of the test strains in the hawthorn fruit pulp

由圖3 可知，植物乳桿菌和檸檬明串株菌的降酸率依然最好，可能因為這兩種菌在山楂果漿中具有生長優勢，對山楂果漿中的檸檬酸具有較好的轉化作用。

2.4 菌數降酸率響應面試驗

選取菌株G5檸檬明串株菌進行降酸響應面試驗研究，通過單因素試驗，分別選取發酵溫度（A），發酵時間（B），菌株接種量（C），并以降酸率（Y）為響應值。通過Box-Behnken法進行響應面試驗優化，各因素水平見表2。

表2 菌數降酸率響應面因素及水平Table 2 Factors and levels of acid reduction rate response surface of bacteria number

2.4.1 響應面試驗結果 響應面試驗設計表及結果見表3，回歸方程方差分析見表4。

表3 響應面試驗設計表及結果Table 3 Response surface test design table and results

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of the regression equations

通過Design-Expert 8.0 軟件對試驗數據進行了計算和分析，得出的三元二次回歸方程如下：降酸率=74.890 00+0.392 50×A-1.355 00×B-1.027 50×C-0.222 50×A×B-1.872 50×A×C-1.622 50×B×C-8.388 75×A2-5.268 75×B2-2.858 75×C2。

對于菌種降酸工藝優化模型的P＜0.05，此回歸模型顯著，失擬項（P=0.136 1＞0.05）不顯著，決定系數為R2=0.998 7，RAdj2=0.997 1，表明該模型與試驗擬合較好，可適用于分析乳酸菌種降酸工藝優化。從表4 可以看出，菌種接種量（A），P＜0.05 對曲面的影響效果顯著；發酵時間（B），發酵溫度（C），交互項AC、BC（P＜0.000 1），對曲面的影響效果極顯著；二次項A2B2C2（P＜0.000 1）極顯著。從表中F 值可以得出各個因素對降酸率的影響次序為：菌種接種量（A）＜發酵溫度（C）＜發酵時間（B）。

2.4.2 響應面分析 各因素交互作用對降酸率的影響響應面分析如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對降酸率的影響響應面分析圖Figure 4 Response surface analysis diagram of the interaction of various factors on acid reduction rate

由圖4 可知，隨著發酵時間與發酵溫度、菌種接種量與發酵溫度的逐漸增加，降酸率呈現先上升再平緩下降的拋物線；菌種接種量與發酵時間的增加，使降酸率迅速下降，證明了這些交互作用的因素對降酸率影響較大，這與表4顯示結果相呼應。

2.4.3 驗證試驗 通過響應面設計試驗結果分析，當菌種接種量為4.9%，發酵時間59 h，發酵溫度28.2 ℃，此時降酸率可達75.117%。為了使試驗操作更簡單易行，將最佳條件修正為：菌種接種量為5%，發酵時間60 h，發酵溫度28 ℃。經3次平行實驗，測得此時降酸率可達75.11%，由此可證明該響應面模型合理可靠。

3 結論

試驗通過比較7 種菌株在檸檬酸培養基中的生長曲線及其在山楂果漿中的生長情況和降酸效果，篩選出了最適合降低山楂汁中檸檬酸的乳酸菌。之后對檸檬明串珠菌G5 的降酸情況進行響應面試驗分析，結果表明：發酵溫度為28 ℃、發酵時間為60 h、菌株接種數量為5%的情況下，山楂汁降酸率均值達到75.11%。利用此項乳酸菌發酵工藝生產山楂汁，可以使山楂汁酸度降低，口味柔和。