抗抑制素α納米抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建

賈昊天，馬繼福，吾熱力哈孜·哈孜汗

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 832000）

抑制素主要是由性腺所分泌的一種糖蛋白激素，抑制素有兩種類型（抑制素A和抑制素B），兩者具有相同的α-亞基，而β-亞基因N-端氨基酸序列的差異而分為βA和βB，α-亞基和βA﹑βB通過二硫鍵連接分別形成抑制素A和抑制素B[1]。抑制素A和抑制素B具有相似的生物活性，均可選擇擇性地抑制SH的合成與分泌，從而降低血液中的FSH水平[2]。其中α-亞基上有兩個(gè)N端連接的糖基化位點(diǎn)，被認(rèn)為是抑制素發(fā)揮生物學(xué)功能的活性中心，已有研究表明抑制素在卵泡生長﹑發(fā)育﹑閉鎖和排卵過程中起重要作用[3-4]，此外國內(nèi)外大量研究人員利用抑制素α（INHα）免疫來提高動(dòng)物機(jī)體FSH水平，且有文獻(xiàn)證明INHα基因免疫不僅可以提高動(dòng)物體內(nèi)FSH水平，還可以提高排卵率和產(chǎn)仔數(shù)[5-8]。但由于目前所產(chǎn)生的INHα免疫制劑（INHα抗原和INHα抗體）由于產(chǎn)量低和免疫原性較差的問題，很難進(jìn)行推廣使用。

重鏈抗體（HCAb）是在駝?lì)悇?dòng)物血清中發(fā)現(xiàn)的一種特殊IgG，因其天然缺失輕鏈和第一恒定區(qū)（CHⅠ），所以被稱為重鏈抗體。重鏈抗體的N端區(qū)域?yàn)榭乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域（VHH），也被稱為納米抗體，與常規(guī)抗體中的Fab片段相比，VHH就是功能和結(jié)構(gòu)片段。納米抗體分子結(jié)構(gòu)的特殊性，使其具備了傳統(tǒng)抗體不具備的優(yōu)勢：即分子量小﹑免疫原性低﹑易于表達(dá)﹑組織穿透力強(qiáng)[9]﹑穩(wěn)定性強(qiáng)[10]﹑高抗原結(jié)合力。此外納米抗體能夠通過血腦屏障并遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織中[11]，這使得納米抗體具有很強(qiáng)的使用價(jià)值，在許多方面可替代普通抗體，彌補(bǔ)普通抗體的不足。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體 DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京索萊寶科技有限公司；克隆載體pMD19-T購自TaKaRa公司；真核表達(dá)載體PcDNA3.1由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)實(shí)驗(yàn)室保存；抗抑制素α納米抗體（Nb4）基因?yàn)楸菊n題組利用噬菌體展示技術(shù)從前期構(gòu)建的抗抑制素α納米抗體文庫中淘選獲得。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和HindIII﹑胰蛋白胨﹑瓊脂粉購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒﹑DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技。

1.1.3 主要儀器 普通PCR（labcyIer48）儀購自德國Sensoquest公司；冷凍高速離心機(jī)（legendmicro17R型）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Nb4基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1.1 引物的設(shè)計(jì) 使用雙峰駝納米抗體基因通用引物VHH-F與VHH-R，再設(shè)計(jì)出1對(duì)帶有 EcoR I 和 Hind III 2 個(gè)內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物，以與真核表達(dá)載體相連。序列信息見表 1：

表1 Nb4基因引物序列

1.2.1.2 Nb4基因的克隆 以實(shí)驗(yàn)室保存的pCantab 5E-Nb4模板用抗抑制素α納米抗體的特異性引物（上下游各引物分別加入EcoR I﹑Hand Ⅲ的酶切位點(diǎn)，上游：5′CCGGAATTCCGGCAGGTCCAACTGCAGGAGTCT3′；下游：5′CCCAAGCTTGG GTGAGGAGACGGTGACCTGGGT 3′）PCR擴(kuò)增目的基因，PCR體系（20μL）：模板2μL，上﹑下游引物各0.4μL，Mix 12.5μL，dd H2O 9.7μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s；57℃退火1min；72℃延伸30s；共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min；4℃保存，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和膠回收。

1.2.1.3 pMD19-Nb4重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 對(duì)PCR產(chǎn)物膠回收后與pMD19-T載體進(jìn)行16℃水中過夜連接，待連接反應(yīng)完成后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞中。挑取數(shù)個(gè)單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR，對(duì)含菌液PCR成功的單克隆菌落以1∶1000體積比，向氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中加入20μL單克隆菌液，適宜條件下過夜培養(yǎng)對(duì)過夜培養(yǎng)物進(jìn)行重組克隆質(zhì)粒的提取，將提取的重組質(zhì)粒用EcoRI和HindIII兩種限制性內(nèi)切酶37 ℃雙酶切3h，并對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后將目的基因條帶進(jìn)行膠回收。

1.2.1.4 PcDNA3.1-Nb4重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 對(duì)pMD19-Nb4重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切的同時(shí)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的PcDNA3.1菌株擴(kuò)繁后進(jìn)行質(zhì)粒提取。并使用EcoR I和HindIII限制性內(nèi)切酶雙重消化PcDNA3.1載體，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收目的消化產(chǎn)物。將回收的Nb4基因片段與回收的PcDNA3.1載體進(jìn)行16℃水浴過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布LB固體氨芐培養(yǎng)基，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑出單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，次日提取菌液質(zhì)粒，用雙酶消化鑒定。然后送至測序并與模板序列比對(duì)。將菌液PCR鑒定正確的菌液使用25%甘油管保存于-20℃。

2 結(jié)果

2.1 Nb4基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 Nb4基因克隆結(jié)果

PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示產(chǎn)生一條450 bp左右的特異性目的條帶（圖1），PCR產(chǎn)物與目的基因條帶大小相符。

圖1 Nb4基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.2 pMD19-Nb4重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定結(jié)果

將PCR擴(kuò)增的Nb4基因與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α感受態(tài)細(xì)胞后挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大小與NB4基因大小一致（圖2）。挑選其中陽性菌進(jìn)行擴(kuò)繁后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示出一條2600bp和一條450bp的條帶（圖3）。與目的基因條帶大小相符，初步判斷pMD19-Nb4重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 菌液PCR結(jié)果

圖3 pMD19-Nb4重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

2.1.3 PcDNA3.1-Nb4重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

將回收的Nb4基因片段與回收的PcDNA3.1載體進(jìn)行連接及轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α細(xì)胞后，對(duì)菌液PCR陽性的單菌落進(jìn)行擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示出一條5900bp和一條450bp的條帶（圖4），與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果顯示測序與Nb4基因序列完全一致，無突變情況，判斷成功構(gòu)建pET 32a-Nb4重組質(zhì)粒。

圖4 PcDNA3.1-Nb4重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)載體構(gòu)建的傳統(tǒng)流程，從克隆載體的連接到真核表達(dá)載體的構(gòu)建，不同于現(xiàn)在的直接連接真核表達(dá)載體，雖然多了一個(gè)連接克隆載體的步驟，但是可以保留克隆載體，以方便以后構(gòu)建其他載體時(shí)直接進(jìn)行酶切連接。