一株市場(chǎng)來源cfr陽性金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析

趙澤廣，李杰峰，張 寧，楊 威， 趙志強(qiáng)，孫艷玲，徐志媛，李 琴

（1.河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 056038；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所 071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 071000）

金黃色葡萄球菌是自然界中常見的一種致病菌，無芽孢﹑鞭毛，大多數(shù)無莢膜，革蘭氏染色陽性，可以引起嚴(yán)重感染[1-2]。近年來，金黃色葡萄球菌污染問題已經(jīng)成為了世界范圍內(nèi)影響公共衛(wèi)生與人類和動(dòng)物健康的重大問題。歐盟一些國(guó)家中由金黃色葡萄球菌引起的細(xì)菌性食物中毒事件占食源性疾病事件的5%[3-4]。我國(guó)金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第4位。隨著抗生素種類越來越多，使用越來越頻繁，金黃色葡萄球菌的耐藥性越來越嚴(yán)重。蔡霞[5]等人對(duì)2018年7月～2021年3月淮南市某教學(xué)醫(yī)院金黃色葡萄球菌臨床分布及耐藥性分析，結(jié)果顯示在160株金黃色葡萄球菌中有69株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）。洪小蘭[6]等在中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第910醫(yī)院2015年～2019年臨床標(biāo)本分離的1750株金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)728株MRSA。

生鮮肉在動(dòng)物屠宰﹑運(yùn)輸﹑儲(chǔ)存和售賣過程中，由于操作﹑溫度﹑環(huán)境等問題，金黃色葡萄球菌污染也很常見。闞浩鵬[7]等人在濟(jì)南各類型市場(chǎng)的180份市售生雞肉中檢測(cè)到55株金黃色葡萄球菌。田璐[8]等人以中國(guó)知網(wǎng)2000年～2019年文獻(xiàn)為基礎(chǔ)統(tǒng)計(jì)了生鮮肉微生物污染情況，結(jié)果顯示我國(guó)金黃色葡萄球菌在生鮮肉中檢出率為10.81%。

耐藥基因cfr是能夠介導(dǎo)噁唑烷酮類藥物﹑林可酰胺類藥物﹑截短側(cè)耳素類藥物﹑氯霉素類藥物以及鏈陽菌素A這五大類抗菌藥同時(shí)耐藥的多重耐藥基因[9]。由于cfr可介導(dǎo)惡唑烷酮類藥物—治療耐藥陽性菌最后一道防線，其已經(jīng)成為抗生素治療的嚴(yán)重威脅[10]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 肉樣

2022年采集的保定市售生鮮肉23份，其中豬肉8份，羊肉﹑牛肉4份，雞肉7份。

1.1.2 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯﹑7.5%氯化鈉肉湯﹑血平板﹑Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)﹑亞締酸鹽卵黃增菌液﹑凍干兔血漿均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；比濁管購(gòu)自比克曼生物科技有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；快速基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；M5 DL2000 DNA Maker﹑M5 DNA電泳用瓊脂糖﹑2× M5 HiPer HiFi PCR mix均購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；TSA（TSB與瓊脂糖比例為4:3）瓊脂為試驗(yàn)室配制。

1.2 方法

1.2.1 肉樣處理 無菌采集適量肉樣于1.5mL離心管中并加入200μL生理鹽水，使用組織研磨器將其研磨至勻漿，再加入500μL生理鹽水，振蕩混勻，8000r/min離心5min。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 取上清液接種于7.5%氯化鈉肉湯中。37℃培養(yǎng)24h。

1.2.3 細(xì)菌分離 將培養(yǎng)的菌液接種于Baird-Parker平板上，37℃培養(yǎng)24h。挑取圓形﹑表面光滑﹑凸起﹑濕潤(rùn)﹑大小為2mm～3mm的具有光澤的灰黑色或黑色并伴有淺色邊緣和不透明圈（沉淀）的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢記錄菌體特征，挑選革蘭氏陽性﹑成葡萄串狀排列的球菌接種于血平板，培養(yǎng)24h。挑取圓形﹑光滑﹑凸起﹑金黃色（白色）﹑具有β溶血特征的菌落凍存，以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 生化試驗(yàn) 將凍存的菌株復(fù)蘇后接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)物和無菌生理鹽水分別接種于細(xì)菌微量生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)24～72 h，觀察記錄結(jié)果。

1.2.5 血漿凝固酶試驗(yàn) 取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物0.5mL于凍干兔血漿，輕輕震蕩混勻，37℃培養(yǎng)，每半個(gè)小時(shí)觀察一次，觀察6 h，凝固則為金黃色葡萄球菌陽性。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 將營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物濃度調(diào)至1.5×108CFU/mL，根據(jù)2021年美國(guó)臨床和試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）進(jìn)行種抗生素藥敏試驗(yàn)，判讀結(jié)果。

1.2.7 耐藥基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)合成引物[11-13]（cfr﹑tetM﹑tetO﹑mecA﹑ermA﹑vanA﹑vanB），用分離菌培養(yǎng)菌液提取DNA進(jìn)行耐藥基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95℃ 5 min，（94℃1 min，Tm 1 min，72℃ 1 min）×35循環(huán)，72℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

表1 金黃色葡萄球菌耐藥基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

采集保定市售生鮮肉23份，進(jìn)行金黃色葡萄球菌分離鑒定，結(jié)果顯示有1株從雞肉中分離的細(xì)菌表現(xiàn)出金黃色葡萄球菌典型特征。分離菌在Baird-Parker平板上長(zhǎng)勢(shì)良好（圖1），表面凸起，光滑濕潤(rùn)，具有光澤，顏色黑色，同時(shí)伴有淺色邊緣和不透明光圈。血平板培養(yǎng)基上菌落較大，表面光滑，白色，凸起并伴有β溶血環(huán)。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢（圖2），結(jié)果顯示該分離菌呈葡萄串狀或鏈狀排列的圓形球菌。

圖1 分離菌菌落特征

圖2 分離菌革蘭氏染色

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌可分解葡萄糖﹑麥芽糖﹑乳糖﹑蔗糖﹑精氨酸﹑尿素﹑淀粉，甲基紅反應(yīng)陽性，V-P試驗(yàn)陽性，液化明膠，可在高鹽肉湯中生長(zhǎng)。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示（表3），該菌只對(duì)萬古霉素﹑利奈唑胺敏感，對(duì)頭孢曲松鈉﹑左氧氟沙星﹑卡那霉素中介，對(duì)頭孢噻肟﹑氨芐西林﹑四環(huán)素﹑林可霉素﹑阿奇霉素﹑環(huán)丙沙星耐藥，表現(xiàn)出多重耐藥。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 耐藥基因cfr檢測(cè)結(jié)果 耐藥基因cfr檢測(cè)結(jié)果顯示為陽性（圖3），目的條帶為746 bp。

圖3 cfr耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2.4.2 其他耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 （圖4）顯示，該菌株攜帶耐藥基因tetM，其目的條帶為406 bp。

圖4 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

3 討論

隨著我國(guó)社會(huì)的發(fā)展，食品安全已經(jīng)成為了社會(huì)關(guān)注度較高的問題，金黃色葡萄球菌作為食品中第二大致病菌[14]，對(duì)其監(jiān)測(cè)尤為重要。周勇[15]等對(duì)2009年～2018年廣州市即食食品中金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，從1399份食品中分離出157份陽性菌株，分離率為11.22%。2015年秦磊[16]等人對(duì)唐山市10個(gè)縣區(qū)不同場(chǎng)所的217份食品進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢測(cè)，陽性率為15.2%。

近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)金黃色葡萄球菌耐藥性的研究越來越多，但是對(duì)攜帶cfr耐藥基因的金黃色葡萄球菌研究較少，這可能因?yàn)閏fr耐藥基因檢出率較低。

多數(shù)抗生素通過與細(xì)菌核糖體結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成來達(dá)到抑菌效果[17]。但是，多重耐藥基因cfr通過編碼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)23S核糖體RNA的2503位嘌呤殘基進(jìn)行修飾，從而降低抗生素與細(xì)菌核糖體的肽基轉(zhuǎn)移酶中心的親和力，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)某些抗生素產(chǎn)生耐藥性[18]。另外，cfr基因是迄今為止唯一由包括質(zhì)粒在內(nèi)的可移動(dòng)元件介導(dǎo)的惡唑烷酮類耐藥基因[19]，然而惡唑烷酮類抗生素利奈唑胺作為臨床上治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌﹑耐萬古霉素腸球菌和耐青霉素肺炎球菌最后一道防線[20]，cfr基因可以使細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。因此，攜帶cfr耐藥基因的細(xì)菌傳播對(duì)公共衛(wèi)生安全形成了巨大隱患。cfr 多重耐藥基因陸續(xù)在包括動(dòng)物源和人源的葡萄球菌﹑腸球菌﹑巨型球菌﹑大腸埃希氏菌和變形桿菌等革蘭氏陽性和陰性菌株中均有報(bào)道[21-24]。尤其是在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌中更為常見[18]，且攜帶cfr的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌臨床治療的難度更大[25]。

本研究從保定市售生鮮肉中分離到一株攜帶cfr耐藥基因的金黃色葡萄球菌，但是mecA基因檢測(cè)結(jié)果為陰性，證明該菌不是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。分離菌對(duì)6種抗生素表現(xiàn)為耐藥，3種抗生素表現(xiàn)為中介，出現(xiàn)了多重耐藥的情況，但是萬幸的是該菌對(duì)萬古霉素和利奈唑胺敏感。其他耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，分離菌攜帶有tetM耐藥基因，藥敏試驗(yàn)中分離菌對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)出耐藥，耐藥表型與耐藥基因檢測(cè)結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從保定市售生鮮肉中分離得到了一株攜帶cfr耐藥基因的金黃色葡萄球菌，具有嚴(yán)重的多重耐藥性，且同時(shí)攜帶tetM耐藥基因，本株多重耐藥金黃色葡萄球菌對(duì)生鮮肉市場(chǎng)公共衛(wèi)生安全具有一定風(fēng)險(xiǎn)。