利用CRISPR/Cas9技術創制糯稻種質

陳峰姜艷芳焦曉真張華朱文銀姜明松徐建第

(1.山東省農業科學院濕地農業與生態研究所，山東 濟南 250100；2.中國水稻研究所，浙江 杭州 311401；3.郯城縣精華種業有限公司，山東 郯城 276000)

直鏈淀粉含量是決定稻米食味品質的重要性狀，由顆粒結合淀粉合成酶(GBSS)催化合成，主要受蠟質基因(Waxy，Wx)控制[1]。糯稻是指直鏈淀粉含量低于2.0%的水稻品種，糯米是制造粘性小吃、甜品和釀造甜米酒的主要原料，是一種重要的特色水稻類型[2]。

基因組編輯技術是指通過序列特異核酸酶(sequence-specific nucleases，SSNs)對基因組特定位點進行靶向修飾的技術，主要原理是通過SSNs特異切割DNA靶位點，產生DNA雙鏈斷裂，誘導自身的損傷修復機制，從而實現對基因組的定向編輯。基因編輯技術是近幾年發展起來的生命科學領域的革命性技術，成為水稻遺傳育種研究的重要手段[3]。傳統水稻品種改良主要是通過雜交、回交的方式將目標基因導入受體品種，實現優良基因的聚合，育種周期長，效率較低。而利用基因組編輯技術，可實現對基因組的定點修飾，克服傳統育種中的連鎖累贅，會大大提高育種效率。

CRISPR/Cas9系統是近幾年發展迅速的高效、準確、便捷的基因組編輯技術。周鑫等[4]用CRISPR/Cas9系統對哈勃601的Wx基因進行定向突變，獲得了糯性哈勃601材料。汪秉琨等[5]利用CRISPR/Cas9系統編輯水稻Wx基因，獲得了低直鏈淀粉含量的楚粳27突變體材料。馮璇等[6]利用CRISPR/Cas9介導基因組編輯，培育出糯稻不育系WX209A。黃李春等[7]利用CRISPR/Cas9技術編輯Wx基因創制了8種淀粉精細結構略區別于傳統糯稻的新型糯稻種質。范美英等[8]通過CRISPR/Cas9系統改良優質粳稻秀水134，獲得了糯稻新材料。目前，利用CRISPR/Cas9系統改良黃淮粳稻品種品質的研究報道較少。圣稻22是山東省水稻研究所培育的粳稻品種，具有優質、抗病、豐產性好、適應范圍廣等優點[9]。本研究利用CRISPR/Cas9系統編輯圣稻22的Wx基因位點，以期得到直鏈淀粉含量下降的糯稻種質，為糯稻育種提供新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料種植及性狀調查

本試驗選用的受體品種為山東省水稻研究所選育的粳稻品種圣稻22，該品種具有株型優良、抗性好、灌漿快、熟相好、出米率高等優點。基于圣稻22獲得的Waxy位點編輯材料于2020年6月至2021年12月種植于山東省農業科學院濕地農業與生態研究所植物生長室。

按照《國家水稻品種試驗觀察記載項目、方法標準》進行生育期、株高、有效穗、穗長、穗粒數、千粒重等農藝性狀調查。

1.2 基因敲除載體信息

大腸桿菌DH5α感受態細胞、EHA105農桿菌感受態細胞、CRISPR/Cas9載體由上海分生生物科技有限公司提供。使用的基因編輯載體為pRice-KO1(圖1)，載體中OsU6用于啟動sgRNA表達，玉米泛素基因啟動子UBI用于啟動Cas9表達。

圖1 基因敲除載體pRice-KO1信息

1.3 靶位點的選擇、sgRNA設計及載體構建

利用在線軟件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)[10]，在Wx基因(Os060133000)的第1外顯子設計引物的靶序列(GCATGAACGTCGTGTTCGT)，該靶序列GC含量為55%，特異性好(圖2)。

圖2 靶位點在Wx基因的位置信息(綠色箭頭指向的黃色框位置為靶序列)

根據所用敲除載體pRice-KO1的接頭序列，合成引物 sgRNA-F(5′-GTGTGGCATGAACGTCGTGTTCGT-3′)、sgRNA-R(5′-AAACACGAACACGACGTTCATGCC-3′)；將包含10 μmol/L sgRNA-F 1μL、10μmol/L sgRNA-R 1 μL、重蒸水8μL的PCR體系置于PCR儀上，于95℃溫育10 min使引物變性，然后以每秒0.1℃的變幅逐漸降低到20℃，使引物形成雙鏈。然后與經BsaⅠ酶切的pRice-KO1按照正常的酶切連接流程進行連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態Top10，挑取抗性菌落用通用引物M13F和sgRNA-R進行PCR鑒定，鑒定正確的克隆提質粒后送上海生工生物工程有限公司測序進一步確認。

1.4 農桿菌介導的遺傳轉化

2020年3月，載體構建成功后由上海分生生物科技有限公司通過農桿菌介導對水稻愈傷組織進行遺傳轉化。轉化步驟主要包括愈傷組織的誘導、愈傷組織的農桿菌侵染、抗性愈傷組織的篩選、抗性愈傷組織的分化及生根等，最終獲得T0代苗[11]。

1.5 突變位點和無標記突變后代檢測

CTAB法提取T0代轉基因株系基因組DNA[12]，設計特異性引物Waxy-D-F/Waxy-D-R(表1)，擴增sgRNA靶向位點序列，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，送上海生工生物工程有限公司通過常規Sanger法進行測序。測序結果通過Geneious軟件進行分析。

將T0代苗種植于溫室中并收獲種子，將種子種植后獲得T1代苗。CTAB法提取的T1代單株幼葉DNA，以pRice-KO1載體特異引物M13F/KO1-R(表1)進行PCR擴增。PCR擴增體系15μL:模板DNA 1μL、M13F引物1μL、KO1-R引物1 μL，2×Master Mix 7.5μL(南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供)、ddH2O 4.5μL。PCR反應條件為95℃5 min；95℃25 s，55℃30 s，72℃30 s，34個循環；72℃延伸7 min。PCR產物用1%瓊脂糖電泳檢測轉基因載體分離情況，獲得無標記突變后代。所用引物(表1)由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 本研究所用引物信息

1.6 直鏈淀粉含量測定

2020年10月，蠟熟期收獲T0代種子，晾干至14.5%含水量，用日本凱特Kett實驗用小型精米機加工成精米，用Retch-MM400型打樣機將精米打成米粉，過100目篩后用于直鏈淀粉含量測定。

稻米直鏈淀粉含量在揚州大學植物功能基因組學教育部重點實驗室測定，測定方法參照黃李春等[7]的方法，RVA譜特征值的測定參照郭濤等[13]的方法。

2 結果與分析

2.1 T0代材料突變頻率與類型

通過農桿菌介導法將Wx基因敲除載體轉入受體材料后，共獲得T0代獨立株系20株(命名為C721-1—C721-20)。測序結果表明，共有16株發生突變，突變率為80%，其中純合及雙等位突變株4株(通過在線分析軟件DSDecodeM分析，http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)；突變類型包括堿基缺失、插入等。部分株系的測序峰圖見圖3。

圖3 部分T0代Wx基因敲除株系測序峰圖

2.2 突變體直鏈淀粉含量和淀粉粘滯性譜測定

16個T0代突變株系中，有3個株系長勢弱未收到種子，其余13個株系均收獲種子且具有明顯的糯稻表型，部分株系的稻米外觀見圖4。選7個結實正常、長勢良好的株系，收獲種子用于直鏈淀粉含量和RVA譜特征值測定，結果(表2)顯示，C721-4、C721-11、C721-12直鏈淀粉含量降至2.0%以下，達到糯稻品質標準；另4個株系直鏈淀粉含量在2.10%～3.51%之間，也均顯著低于野生型；稻米RVA譜特征值中的最高粘度、熱漿粘度、冷膠粘度、回復值均明顯低于對照品種。

表2 對照與T0代突變株系直鏈淀粉含量及RVA譜特征值

圖4 部分T0代Wx基因敲除株系稻米外觀

2.3 T1代轉基因載體檢測和無標記突變單株的選擇

提取T1代單株幼葉DNA，以基因編輯載體特異引物進行PCR擴增，產物用1%瓊脂糖電泳檢測，能擴增出載體序列的為陽性(含載體序列)，不能擴增出載體序列的為陰性(無載體序列)，共檢測T1代240株，其中陽性單株208株，不含載體序列的單株32株(圖5)。

圖5 部分T1代基因編輯單株載體序列PCR檢測結果

2.4 T1代突變株系的農藝性狀鑒定

對32株不含標記序列的T1代突變單株進行農藝性狀考查和糙米外觀品質檢測，其中10個T1代突變單株的抽穗期、株高、穗長、千粒重等與圣稻22相似，綜合農藝性狀優良，糙米外觀品質檢測均為糯米表型(表3)。

表3 部分T1代株系農藝性狀與糙米外觀表現鑒定

3 討論與結論

我國科學家在水稻遺傳學和功能基因組學領域已取得矚目成就，發掘克隆出多個水稻產量、品質及抗性重要功能基因，為開展水稻分子設計育種奠定了基礎。基因組編輯技術是研究基因功能和生物體改造的重要工具。CRISPR/Cas系通過一段向導RNA和配套的核酸酶就可對特定的基因組序列進行定點編輯，具有簡單高效、應用廣泛的特點，受到了生物學家的廣泛關注，已廣泛應用于玉米、小麥和水稻等作物改良[14-22]。

直鏈淀粉含量與稻米品質直接相關，Wx基因是控制水稻直鏈淀粉合成的主效基因，通過對Wx基因定點編輯可以獲得穩定遺傳、直鏈淀粉含量適宜的突變體。周鑫等[4]在Wx基因的第2、7、8、10、11、12外顯子區域設計6個靶位點，構建CRISPR/Cas9基因編輯表達載體，通過基因編輯粳稻品種哈勃601，獲得5份純合T2突變體，直鏈淀粉含量由親本的15.5%降至2.0%～2.6%，接近或達到糯稻水平。汪秉琨等[5]構建CRISPR/Cas9表達載體pGK03-Wx-gRNA(靶點1和2分別在Wx基因第1和第2外顯子)，利用工程菌EHA105遺傳轉化超級稻楚粳27，稻米直鏈淀粉含量從17.5%降到1.93%。黃李春等[7]編輯Wx基因編碼的GBSSI蛋白C末端非關鍵位點(Wx基因第12和第13外顯子)，利用CRISPR/Cas9技術進行編輯粳稻品種日本晴，直鏈淀粉含量從野生型的16.79%下降到3.69%～4.44%。本研究利用CRISPR/Cas9系統，以Wx基因(靶點位于第1外顯子)為編輯對象構建敲除載體，利用農桿菌介導法轉化優質粳稻品種圣稻22，共獲得T0代獨立株系20株，測序結果表明16個株系實現了對Wx基因的定點編輯，突變率為80%，純合及雙等位率為20%；T0代稻米外觀品質檢測表明13個株系外觀呈現糯稻表型，直鏈淀粉含量測定表明有3個株系的直鏈淀粉含量降至2.0%以下。

綜上，利用CRISPR/Cas9對Wx基因進行定向突變可以快速改良品種的直鏈淀粉含量目標性狀，獲得糯性水稻材料，在水稻品種的定向改良方面具有巨大的應用潛力。但在利用該技術培育新品種時，需要選擇適當的靶位點并培育較多的突變體，才能從中選到符合國家標準的糯稻品種。另外本研究僅對T0代和T1代進行了遺傳分析及表型鑒定，后續可對T2代株系進行進一步的基因型與表型鑒定，以獲得穩定遺傳、農藝性狀優良的糯性種質。