pH值偏移大豆油體-姜黃素復合乳液的物理特性及穩定性

康夢雪，孫禹凡，宋晗鈺，鐘明明，王 帥，齊寶坤

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

姜黃素是一種存在于姜黃根莖中的低分子質量親脂性多酚化合物[1]。姜黃隸屬于姜科，被東南亞等地用作香料、調味劑、著色劑、防腐劑和傳統藥物。姜黃素是姜黃中最具生物活性的成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗糖尿病、抗腫瘤和抗癌等活性；但其水溶性差、化學不穩定、光降解、代謝降解率較高、生物利用度較低等缺點阻礙著姜黃素在食品中的應用[2]。近年來，研究人員通過包埋，利用乳液、凝膠、脂質體、納米晶體等遞送體系穩定姜黃素，提高其生物利用度[3]。

油體是植物種子細胞中貯存脂質的細胞器，是具有內核為三酰甘油、被單層磷脂和蛋白質包裹、直徑為0.5～2 μm的球形結構，蛋白質、磷脂和油脂含量分別為0.59%～3.46%、0.59%～1.57%和94.28%～98.17%[4]。由于其天然單層磷脂-蛋白膜結構，油體能均勻分散在水中，形成天然水包油乳液且具有良好穩定性[5]。同時，油體的疏水內核可用于溶解油溶性維生素、多酚等非極性生物活性物質，為油體作為天然運載體提供了可能，但由于其穩定的結構較難封裝疏水性營養成分，使得該特性并未得到充分利用[6]。近年來，研究人員試圖利用油體作為載體，通過加熱法、pH值驅動法、油溶乳化等方法包埋營養成分進行應用[6-7]，但由于營養成分的不穩定性，探究如何將活性物質裝載到油體中仍具有重要意義。

pH值偏移法是一種有效改變蛋白質結構和功能的方法[8]。其通過將蛋白質等置于堿性或酸性環境，導致蛋白質構象發生變化，然后調整到中性環境，使蛋白質分子發生完全或部分展開和重新折疊[9]。蔣將[10]和Kuwajima[11]發現極端pH值偏移處理有效誘導了大豆蛋白熔球態，即一種處于變性與未變性之間的穩定態，具有與未變性蛋白相似的二級結構，但三級結構松散。Wang Yuying等[12]研究了pH值偏移處理過程中大豆蛋白的去折疊-重折疊過程，并成功制備姜黃素大豆蛋白納米顆粒。

本研究以大豆為原料，采用濕法磨漿的方式從原料中分離富集油體，試圖通過pH值偏移法使油體蛋白處于熔球態，制備姜黃素油體乳液，并探究不同pH值偏移法制備姜黃素油體乳液的包封率、粒子特性、顯微結構、蛋白質結構及穩定性，從而考察油體對親脂性多酚的包埋效果，為油體應用提供一種新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（東農52號） 東北農業大學大豆研究所；姜黃素 上海源葉生物科技有限公司；尼羅紅、尼羅藍美國Sigma公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；HK-02萬能粉碎機 廣州鴻興機械有限公司；JY92-IIN超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；F-4500型熒光分光光度計 日本Hitachi公司；Zetasizer Nano ZS9型粒度及電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；UV-6100紫外-可見分光光度計 日本島津公司；PHSJ-4A型實驗室pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；AUY120分析天平（0.0001 g） 北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油體的提取

參照Tzen[13]和李楊[14]等的方法，并稍作修改。清洗大豆，在4～6 ℃下與蒸餾水以1∶5（g/mL）的比例浸泡18～20 h，用組織搗碎機以18000 r/min磨漿5 min，用4 層脫脂紗布過濾，除去豆渣、收集濾液。向濾液中加入20%蔗糖溶液，冰水浴攪拌15 min，并用2 mol/L NaOH溶液將pH值調節至11.0，轉移至離心桶內，4 ℃、15000 r/min離心30 min，收集上層乳狀物，并重復此步驟2 次，獲得大豆油體富集物。用去離子水清洗大豆油體富集物即得大豆油體，置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 姜黃素-油體的制備

取適量姜黃素粉末分散于去離子水中，置于攪拌器上攪拌至分散均勻。用去離子水將油體稀釋，并用2 mol/L NaOH溶液將pH值調至11.0，攪拌均勻，分別用4 mol/L HCl溶液將pH值調至6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0。加入姜黃素分散液，充分攪拌混合、超聲（100 W，4 min）使其接觸均勻。用4 mol/L NaOH溶液將各樣品pH值調至中性，加去離子水至乳液中油體含量為10%、姜黃素質量濃度為2.4 mg/10 mL，并結合超聲（150 W，8 min）促使其作用均勻。4 ℃、2000 r/min離心2 min去除未包封姜黃素，透析2 d（截留分子質量8000 Da）去除乳液中鹽離子。

1.3.3 包封率的測定

參考Zheng Bingjing等[15]的方法，并稍作改動。取1 mL乳液與9 mL二甲基亞砜混合，3000 r/min離心10 min，離心后收集有機層，重復萃取2 次合并萃取液。將萃取液稀釋至適宜濃度，420 nm處測定其吸光度，根據標準曲線y＝0.1354x-0.0498，相關系數（R2）＝0.9991，計算姜黃素含量。

按式（1）計算包封率：

式中：CE為乳液中姜黃素的添加質量濃度/（mg/mL）；CI為樣品中測定的姜黃素質量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 粒徑、Zeta電位和多相分散指數的測定

將油體乳液均勻分散于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，利用Zetasizer Nano ZS90型粒度與電位分析儀于25 ℃下測定0.05%油體乳液Zeta電位、平均粒徑和多相分散指數（polydispersity index，PDI），分散相和連續相的折射率分為1.456和1.330。

1.3.5 超高分辨顯微鏡觀察

參考Sun Yufan等[16]的方法，并稍作改動。將制備好的樣品用PBS（pH 7.4，10 mmol/L）稀釋15 倍，將尼羅藍、尼羅紅溶于異丙醇中，制成1.0%尼羅藍染液和0.1%尼羅紅染液。向1 mL樣品中分別加入50 μL尼羅藍染液、50 μL尼羅紅染液，混合均勻，各避光15 min。將樣品置于載玻片上，蓋上蓋玻片，使用超高分辨率顯微鏡在488 nm和633 nm的激發波長下觀察脂滴形態、大小。

1.3.6 內源熒光光譜的測定

根據孫禹凡等[17]的方法，并稍作修改，測定油體乳液的內源熒光光譜。將樣品用10 mmol/L PBS釋至10 倍，將樣品放置在石英比色皿的固體樣品支架中，利用熒光分光光度計記錄內源熒光光譜。激發波長為280 nm，發射波長為300～400 nm，狹縫寬度為5 nm，掃描速率為600 nm/min。

1.3.7 油體表面蛋白提取及表征

參考Ding Jian等[18]的方法，并稍作改動。將樣品與丙酮1∶3（V/V）混合，室溫下緩慢搖晃30 min。12000×g離心15 min，收集下層物質，重復上述過程3 次。最終獲得油體表面蛋白，氮氣吹干，冷凍干燥。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離膠為12%、濃縮膠為5%，將油體表面蛋白溶于水至蛋白質量濃度為3 mg/mL，加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，上樣量15 μL，80 V運行30 min，120 V運行至結束。用考馬斯亮藍染液染色后脫色至條帶清晰，利用凝膠成像儀拍照保留。

1.3.8 油體乳析指數測定

將新制樣品置于帶塞試管，在常溫下放置14 d，放置后乳液分為兩層，上層為乳析層，下層為清液層。按式（2）計算乳析指數：

式中：HS為乳清層的高度；HE為玻璃管中乳液的總高度。

1.3.9 油體pH值穩定性的測定

用1 mol/L HCl或NaOH溶液將新制樣品的pH值分別調至2、4、6、8、10，利用Zetasizer Nano ZS90型粒度與電位分析儀在25 ℃條件下測定0.05%不同pH值下油體乳液的Zeta電位和平均粒徑。

1.3.10 油體氧化穩定性測定

將新制樣品乳液放置于45 ℃恒溫恒濕箱中，加速其氧化，利用紫外-可見分光光度計進行實驗測定。

1.3.10.1 氫過氧化物測定

參考Zhao Luping等[19]的方法，并稍作改動。取0.3 mL樣品加入至1.5 mL異辛烷-異丙醇（2∶1，V/V）中，旋渦振蕩30 s，2000×g離心2 min。取200 μL上層有機相加入至2.8 mL甲醇-正丁醇（2∶1，V/V）中，分別加入30 μL 3.94 mol/L硫氰酸鹽和0.072 mol/L Fe2＋，旋渦混合，避光反應20 min。使用紫外-可見分光光度計在510 nm波長處測定樣品的吸光度，以過氧化氫異丙苯作標準曲線。標準曲線為y＝0.419x-0.0658，R2＝0.990。

1.3.10.2 硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值測定

參考武利春等[20]的方法，并稍作改動。取1 mL樣品加入至2 mL硫代巴比妥酸測試液（由15%三氯乙酸、0.375%硫代巴比妥酸和0.25 mol/L HCl組成）中，旋渦混合，沸水浴30 min后冷卻至室溫，過0.22 μm濾膜。使用紫外-可見分光光度計在532 nm波長處測定樣品吸光度，以1,1,3,3-四乙氧基丙烷作標準曲線。標準曲線為y＝0.545x＋0.0732，R2＝0.991。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 姜黃素大豆油體乳液的包封率

如圖1所示，隨著pH值減小，油體中姜黃素的包封率由35.46%增加至65.55%。這可能因為隨著pH值降低，蛋白質結構發生去折疊現象，疏水性增強、二硫鍵打開，姜黃素進入油體油相內核，且處于極端酸性環境時，蛋白質疏水基團得以充分暴露，蛋白質具有相對柔性的構象，更多姜黃素進入油體內核油相中[21-22]。當pH值偏移為1.0時，油體包封率最高，為65.55%。這可能因為pH值偏移引起蛋白質產生的“熔球”狀態，相關蛋白質的側鏈相互作用變弱，結構充分展開，姜黃素溶于油體油相中，姜黃素包封率達到最佳[23-24]。

圖1 不同pH值偏移制備的姜黃素油體乳液的包封率Fig.1 Encapsulation efficiencies of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

2.2 姜黃素大豆油體乳液的物理特性分析

乳液中脂滴的Zeta電位和平均粒徑是衡量乳液穩定性的重要指標之一[25]。由表1可知，經pH值偏移處理后乳液Zeta電位絕對值顯著小于未處理樣品（P＜0.05）；除pH值偏移為6.0時，不同pH值偏移處理的乳液Zeta電位無顯著區別（P＞0.05）；處理后樣品PDI顯著大于未處理油體（P＜0.05）。這可能由于油體蛋白分子的N和C末端帶電荷，其正電荷指向內部，負電荷暴露于乳液微環境中；酸性條件下，油體相關蛋白發生質子化，產生正電荷，中性條件下時，蛋白發生去質子化；同時，酸性環境使油體蛋白結構擴展、表面蛋白結構打開，姜黃素得以進入油體油相中，但疏水基團等相關基團暴露，影響了電荷結合能力和表面電荷分布，從而導致當乳液環境回到中性時，表面負電荷減少，乳液穩定性下降[22,26]。

表1 不同pH值偏移制備的姜黃素油體乳液的性質表征Table 1 Characteristics of curcumin oil-loaded body emulsions prepared at different pH levels

由圖2可知，不同pH值偏移制備的姜黃素油體乳液粒徑分布形成的峰相似；當pH 1.0時，與其他pH值相比，粒徑明顯增大，粒徑分布形成的峰右移，并呈單峰分布。結合圖1可得，隨著pH值的降低，油體對姜黃素的包封率增大，內核油相中姜黃素含量增多，從而導致乳液粒徑增大[2]；而當pH值處在蛋白質等電點（pH 4.0～5.0）附近時，乳液液滴的雙峰分布可能是由于油體之間靜電斥力不足，其聚集行為使乳液穩定性喪失、產生絮凝和分層；pH值恢復至中性時，部分乳液因構象緊密，未實現全部分離[22,27]。故經pH值偏移后，油體乳液穩定性略有降低；而當pH值偏移為1.0時，乳液粒徑呈均勻的單峰分布，表明乳液再次重新排列成相對穩定的狀態。

圖2 不同pH值偏移制備的姜黃素油體粒徑體積分布Fig.2 Particle size volume distribution of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

2.3 姜黃素大豆油體乳液的微觀結構觀察

如圖3所示，乳液為O/W型，與Sun Yufan等[16]研究結果一致，油相基本成橢球形或球形，蛋白錨定在油相表面形成閉環，將油相包裹。

圖3 不同pH值偏移制備的姜黃素油體乳液的微觀結構Fig.3 Microstructure of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

由圖3可知，未處理油體脂滴呈球形分布、粒徑最小；當pH≤2.0時，乳液中脂滴分散良好，蛋白和油脂錨定緊實；當pH＞2.0時，脂滴出現聚集且多呈橢球狀或不規則狀分布，這與粒徑結果一致。當pH 5.0時，油脂和蛋白質分別聚集，部分蛋白質未包裹油相，這可能因為當環境接近油體蛋白等電點時，油體蛋白之間的靜電排斥不足以克服相互吸引作用，蛋白質發生絮集[22]。當pH 6.0時，部分蛋白成雙層殼形網狀結構，形成不規則橢球形，這可能由于pH值回歸中性時，蛋白質結構柔性降低，油脂聚集，為將油脂全部包裹，形成不規則橢球閉環；同時，部分小分子蛋白在閉環內部與其相連接，部分疏水端錨入油脂中，從而形成殼形網狀結構。當pH 1.0時，脂滴多呈球狀分布，這可能因為在短暫的極酸環境中，油體蛋白的二級結構保持相對完整，當恢復至中性環境時，蛋白結構得以恢復，使其結構與未處理油體結構相似[22,28]。

2.4 姜黃素大豆油體乳液油體的內源熒光光譜分析

內源熒光對色氨酸殘基微環境和蛋白質三級結構的變化高度敏感。通常，若色氨酸熒光λmax＜330 nm，則將色氨酸指定為掩埋且處于“非極性”環境中；若λmax＞330 nm，則色氨酸被指定為處于“極性”環境中。如圖4所示，姜黃素油體的發射熒光光譜在306 nm波長處有一個峰值（小于330 nm），因此油體的色氨酸基團處于“非極性”環境中[28]。

圖4 不同pH值偏移制備的姜黃素油體乳液的內源熒光光譜圖Fig.4 Endogenous fluorescence spectra of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

如圖4所示，當油體經極端酸性pH值偏移處理后，其最大波長未發生紅移、藍移，而當pH≥4.0時，λmax紅移1 nm。這可能由于蛋白質在極端酸性pH值偏移處理過程中更容易形成能保持蛋白質結構完整的“熔球”結構，從而減少蛋白質內部疏水氨基酸的暴露，這與Yan Shizhang等[24]的研究結果一致；而當偏移環境接近等電點時，蛋白分子部分發色基團暴露，色氨酸基團向更親水的微環境移動。pH 1.0時，熒光強度與未處理油體相似，這表明pH 1.0時，pH值偏移處理未破壞蛋白質的三級結構；而pH≥2時，與未處理油體相比，熒光強度增大，油體蛋白發生一定的變性和解離。這可能因為短暫的極酸環境未對油體蛋白結構造成不可逆影響，該結果與2.3節中推測結果一致；其他pH值下熒光強度增強，這是因為在正常情況下，發色團通常隱藏在分子內部，從而表現出較低熒光強度，經歷pH值偏移處理后，油體蛋白結構松散，蛋白質內部的色氨酸殘基等疏水基團暴露出來，從而使熒光強度增加[25]。

2.5 姜黃素大豆油體乳液油體蛋白的SDS-PAGE

油體表面蛋白在維持油體的穩定性和調整油體大小方面起重要作用，為進一步探明pH值偏移對姜黃素油體乳液穩定性的影響，不同pH值偏移得到的姜黃素油體相關蛋白的亞基結構如圖5所示。不同油體蛋白均顯示出內源蛋白（分子質量15～25 kDa）條帶和外源蛋白（分子質量＞33 kDa）條帶。

圖5 不同pH值偏移制備的姜黃素油脂體乳液油體蛋白的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE patterns of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

隨著pH值偏移的增加，外源蛋白含量逐漸增多，同時出現分子質量小于15 kDa的肽；這可能因為pH值偏移處理使蛋白質分子結構疏散，影響了蛋白質分子之間的相互作用，促使外源蛋白分子發生重排，形成亞基的交聯[10,29]。而pH 1.0時，蛋白質亞基的種類和含量未發生明顯改變；這可能因為極酸環境僅打開了蛋白質的表面結構，并在中性環境時發生重組、結構恢復[10]。故當pH值偏移為1.0時，蛋白質未發生實質性改變，與以上研究結果一致。

2.6 姜黃素大豆油體乳液的穩定性分析

2.6.1 貯藏穩定性分析

如圖6所示，與未處理油體乳液對比，經pH值偏移制備的姜黃素油體乳液貯藏穩定性較差，這與表1結果一致。這可能由于pH值偏移處理后，油體油-水界面被破壞，油體蛋白疏水基團等相關基團暴露，進而改變了乳液液滴表面電荷分布，表面負電荷減少，乳液穩定性下降，隨著貯藏時間延長，液滴間靜電相互作用減弱，乳液發生聚集和絮凝[17,22]。

圖6 不同pH值偏移制備的姜黃素油脂體乳液的貯藏穩定性Fig.6 Storage stability of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

2.6.2 pH值穩定性分析

如圖7所示，隨著pH值增加，乳液平均粒徑先增加后減小，Zeta電位逐漸減小。pH 4.0時，平均粒徑達到最大，Zeta電位絕對值最小，乳液表現出不穩定；pH 2.0和pH 6.0～10.0時，乳液表現出較低的平均粒徑和較大的Zeta電位絕對值，乳液較為穩定[30]。這是由于pH 4接近油體蛋白的等電點（pH 4.0～5.0），此時液滴表面電荷較少，液滴之間靜電相互作用較弱，導致顆粒聚集[7]。

圖7 不同pH值偏移制備的姜黃素油脂體乳液的pH值穩定性Fig.7 pH stability of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

同時，與未處理油體乳液對比，經pH值偏移處理的油體乳液具有較大的平均粒徑和較小的Zeta電位絕對值；此外，在不同pH值偏移處理的姜黃素油體乳液中，pH值偏移為1.0時，乳液具有較大的Zeta電位絕對值。結合圖5可知，因為pH值偏移為1.0時，未顯著破壞油體蛋白結構，對表面電荷分布的破壞較小，靜電相互作用較強，所以Zeta電位絕對值較大，乳液較為穩定[31]。

2.6.3 氧化穩定性分析

通過監測貯存期間油脂氧化的初級產物（氫過氧化物）和次級產物（TBARS）含量，反映不同pH值偏移制備的姜黃素油體乳液的氧化穩定性。

如圖8所示，隨著貯藏時間的延長，未處理油體氫過氧化物的含量隨貯藏時間延長，整體呈緩慢上升趨勢，處理過的油體呈先減少后增大趨勢，且油體氧化穩定性得以改善。這可能因為油體本身的特殊結構，其外層緊實的蛋白-磷脂層將內核油脂與外界環境相隔離，并含有少量的生育酚和植物甾醇等抗氧化物質[32]，部分結合在油體表面的姜黃素提供了一定的抗氧化能力[5]。貯藏4～10 d，pH 5.0的樣品中氫過氧化物含量上升趨勢明顯，而pH 1.0時的變化趨勢與未處理油體趨于一致。結合圖3研究，這可能由于pH 5.0時，油體聚集、部分油脂暴露于空氣中，加速油脂氧化，而pH 1.0時，姜黃素油體成球狀結構，蛋白質結構未發生顯著變化，氧化穩定性較好。同時，初始狀態下，處理過的油體氫過氧化物含量大于未處理油體，這可能由于經過處理的油體表面油水界面被破壞，導致氧化穩定性下降[33]。

由圖8可知，貯藏0～2 d，TBARS值快速增加；貯藏6 d后，全部油體TBARS值呈上升趨勢，此時，樣品出現乳析現象，油體穩定性喪失，氧化加速進行。貯藏2～6 d，樣品TBARS值整體呈下降趨勢；貯藏結束時，不同pH值處理過的油體TBARS值均低于未處理油體，這可能由于姜黃素改變了油體清除自由基和螯合金屬離子的能力，姜黃素將氫離子提供給過氧化自由基從而避免進一步降解，從而抑制油體次級氧化物的生成[5,34-35]。

圖8 不同pH值偏移制備的姜黃素油脂體乳液的氧化穩定性Fig.8 Oxidation stability of curcumin-loaded oil body emulsions prepared at different pH levels

3 結論

通過pH值偏移處理，姜黃素可成功被油體包埋，pH值偏移為1.0時，包埋效果及氧化穩定性最佳。包封特性研究表明，隨著pH值的減小，乳液包封率由35.46%增加至65.55%，脂滴聚集減少并逐漸呈均勻的橢球或球形分布。內源熒光光譜、SDS-PAGE結果表明，pH值偏移處理使油體蛋白結構疏散，發生一定解離，同時，促使外源蛋白分子發生重排，形成亞基交聯；但pH 1.0時，蛋白質結構未發生明顯變化，與天然油體蛋白結構相似。穩定性分析發現，pH值偏移法降低了油體的貯藏穩定性，油體pH穩定性略差，但姜黃素的存在提高了油體的氧化穩定性；pH值偏移為1.0時，氧化穩定性最佳。本實驗為設計姜黃素運載體系和開發油體遞送體系提供一定理論依據。