基于組織蛋白酶催化的不凍液凍結中華管鞭蝦中肌原纖維蛋白氧化分析

許 丹，韓 悅，鄭 斌，鄧尚貴，陳雪昌,，張小軍,,*

（1.浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山 316021；2.浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江 舟山 316021；3.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022）

內源性蛋白酶是存在于水產品體內的蛋白酶，可水解蛋白質肽鍵，改變蛋白質構象，從而改變蛋白質的理化和功能特性。水產品死亡后內源性蛋白酶的活化和釋放會引起相應結構蛋白等底物的變性和水解，從而損害水產品品質[1]。研究表明，對這一過程影響最大的蛋白酶是基質金屬蛋白酶、鈣蛋白酶和組織蛋白酶[2-3]，其中又以組織蛋白酶B、L、H對肌肉蛋白質降解作用最為顯著，其可導致水產品死后凍藏期間肌球蛋白重鏈的降解[4-5]。蝦肉中的組織蛋白酶會隨著凍藏時間的延長不斷作用于肌肉蛋白質，導致細胞骨架和肌原纖維蛋白被破壞[6]。凍藏可延長水產品貯藏期，但在凍藏過程中，冰晶的生成可加速組織的破裂，溶酶體中組織蛋白酶轉移至線粒體的速度加快，使線粒體酶活性上升，隨著組織蛋白酶接觸并破壞線粒體結構，促使線粒體凋亡，最終導致整體酶活性呈下降趨勢。李志鵬等[6]研究發現，凍藏條件下兩組蝦組織蛋白酶H酶活整體低于冷藏條件下酶活。沈春蕾等[7]研究發現，凡納濱對蝦在凍藏過程中，蝦頭中部分蛋白酶可能會逐步遷移到蝦肌肉中，進而對肌肉品質產生較大影響。

不凍液凍結是一種新型快捷、高效安全的速凍方法，己經被廣泛應用于水產品凍藏保鮮。不凍液凍結速度快、耗時短、效率高，凍結后產品質量高，汁液損失少，能保持原有的質構、口感和外觀。不凍液是由安全的食品添加劑，如丙二醇、低聚糖等組成，具有成本低、可重復使用且縮短加工周期等優點[8]。不凍液的凍結過程是水產品通過與載冷劑直接或間接接觸，使其快速冷卻，是一種新型且理想的冷凍加工技術[9-10]。王雪松等[11]通過對低溫浸漬快速凍結的研究，優化出適用于-30 ℃以下的最優載冷劑，其由20% CaCl2、8%丙二醇、5%海藻糖和水組成。倪明龍[12]研究出了一種多元載冷劑凍結草魚，與空氣鼓風凍結進行對比，可以明顯改善凍結草魚的品質。

目前，蝦肌肉組織中內源性蛋白酶活性對其肌肉品質的影響，還存在較多不明之處，尤其關于中華管鞭蝦（Solenocera crassicornis）等海水蝦類中組織蛋白酶活性對其肌原纖維蛋白氧化的研究還鮮有報道。本研究以舟山海域捕撈的中華管鞭蝦為研究對象，比較分析不凍液凍藏和普通凍藏對其肌原纖維蛋白的影響，并對中華管鞭蝦的組織蛋白酶活性進行研究，分析其對蛋白結構和肌肉組織產生的影響。旨在為后續海水蝦類組織蛋白酶活性及其凍藏方式的選擇提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華管鞭蝦捕撈于舟山海域，體長平均（12.5±2.2）cm，體質量平均（15.5±2.3）g。捕撈后放入冰袋，置于保溫箱內，到岸后迅速送回實驗室。

五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、溴酚藍（均為分析純） 國藥集團化學試劑上海有限公司；牛血清蛋白（分析純） 北京索萊寶科技有限公司；Tris-馬來酸（分析純） 上海麥克林生化科技股份有限公司；ATP酶試劑盒、組織蛋白酶試劑盒、總巰基試劑盒 江蘇省南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Cary 50紫外-可見分光光度計 美國瓦里安公司；AvantiJXN-30離心機 美國貝克曼庫爾特公司；ME204E分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LPD2500渦旋混合儀 萊普特科學儀器（北京）有限公司；DLSB-30/40低溫冷卻液循環泵 浙江省杭州庚雨儀器有限公司；EVP MA25/LS25掃描電子顯微鏡 德國蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 原料的預處理

不凍液速凍：將配好的不凍液（乙醇∶甜菜堿∶丙二醇∶氯化鈉＝25∶10∶10∶6，m/m）分別預冷至-18 ℃和-30 ℃后，將密封袋中的中華管鞭蝦置于不凍液中進行凍結，分別標記為-18 ℃ QF和-30 ℃ QF。冰箱緩凍：將密封袋中的中華管鞭蝦直接分別置于-18 ℃和-30 ℃冰箱中凍結，分別標記為-18 ℃ SF 和-30 ℃ SF。當4 組樣品中心溫度為-18 ℃時取出，將凍結后的蝦體置于-18 ℃冰箱中凍藏120 d，間隔20 d取樣，將樣品于4 ℃環境中解凍并進行相關指標測定。

1.3.2 鹽溶性蛋白含量測定

采用劉書來等[13]的方法，并稍作修改。取5.0 g解凍后蝦肉，加入45 mL低離子強度磷酸鹽緩沖溶液（含0.025 mol/L NaH2PO4、0.025 mol/L Na2HPO4，pH 6.8），4 ℃、10000 r/min勻漿3 min。在4 ℃冰箱中抽提1 h，10000 r/min離心30 min。所得沉淀用9 倍體積的高離子強度磷酸鹽緩沖溶液（含0.025 mol/L NaH2PO4、0.025 mol/L Na2HPO4、0.6 mol/L KCl，pH 6.8）于4 ℃、10000 r/min勻漿30 s，4 ℃條件下抽提3 h，10000 r/min離心30 min。重復上述操作1 次，所得上清液即為鹽溶性蛋白質，采用雙縮脲法測定蛋白質含量。

1.3.3 肌原纖維蛋白的提取

采用Jiang Qixing等[14]的方法，并稍作修改。取10 mL鹽溶性蛋白，加入30 mL去離子冰水，稀釋上清液使肌原纖維蛋白沉淀，4 ℃、12000 r/min離心5 min，棄上清液。重復上述操作2 次，所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.3.4 表面疏水性測定

用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0、0.05 mol/L）將肌原纖維蛋白稀釋至2 mg/mL，取2 mL。加入40 μL 1 mg/mL溴酚藍溶液，混勻后靜置15 min，4 ℃、5000 r/min離心10 min。取上清液于595 nm波長下測定吸光度。空白組用磷酸緩沖液替代溴酚藍溶液，以溴酚藍結合量表示表面疏水性，按下式計算：

式中：A0為空白吸光度；A樣為樣品吸光度。

1.3.5 Ca2＋-ATPase活性測定

使用ATP酶測試盒，按照說明書進行測定。

1.3.6 總巰基含量測定

使用蛋白質總巰基測試盒，按照說明書進行測定。

1.3.7 組織蛋白酶活性測定

使用組織蛋白酶B、組織蛋白酶L和組織蛋白酶H試劑盒，按照說明書進行測定。

1.3.8 肌原纖維橫縱切面結構觀察

將蝦肉切成1 mm3左右的小塊，浸沒在2.5%戊二醛中，置于4 ℃冰箱中過夜。用不同體積分數的乙醇溶液（50%、70%、80%、90%）梯度脫水15 min，最后用無水乙醇脫水3 次，每次15 min。真空干燥后通過掃描電子顯微鏡在放大500 倍下觀察中華管鞭蝦的肌原纖維橫切面和縱切面結構。

1.4 數據處理

所有樣品做3 次平行。采用SPSS 23.0處理數據、Origin 8.5軟件繪圖，不同處理組間的比較采用最小顯著差異法，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同條件凍藏期間中華管鞭蝦鹽溶性蛋白含量變化

鹽溶性蛋白是中華管鞭蝦肌肉蛋白中最主要的蛋白質，其含量約為65%～75%[15]。肌肉中鹽溶性蛋白含量越低，冷凍變性程度越高[13]。如圖1所示，120 d凍藏期內，不同溫度凍藏下的中華管鞭蝦肉鹽溶性蛋白含量均有不同程度下降，-30 ℃凍藏組鹽溶性蛋白含量下降程度弱于-18 ℃凍藏組。凍藏至120 d時，-18 ℃ SF組、-30 ℃ SF組、-18 ℃ QF組和-30 ℃ QF組鹽溶性蛋白含量分別為72.40、77.90、92.7 mg/g和97.8 mg/g，與新鮮蝦（120.40 mg/g）相比分別下降了39.87%、35.30%、23.01%和18.77%，差異顯著（P＜0.05），該結果表明凍藏溫度越低，蛋白質凍結變性速度越緩慢，鹽溶性蛋白含量下降越緩慢。此外，QF組鹽溶性蛋白含量下降程度低于SF組，其原因可能為不凍液速凍時凍結速率較快，形成的冰晶均勻細小，對蝦肌原纖維造成的破壞較小，使鹽溶性蛋白含量下降緩慢。劉書來[13]和胡亞芹[16]等分別研究了凍結方式對烏鱧塊和帶魚品質的影響，發現凍結速率越快，其鹽溶性蛋白含量下降越慢，與本實驗結果相似。凍藏過程中鹽溶性蛋白含量下降的影響因素較多，如水產品肌肉中部分結合水發生冰晶沉淀，引起肌動球蛋白分子之間形成非共價鍵，從而形成大分子的不溶性凝集，造成肌動球蛋白溶出減少[17]。曾名勇等[18]研究發現，肌動球蛋白降解變性，生成堿性蛋白，這種蛋白在高離子濃度下不能溶解，但在堿性溶液中能溶解，從而降低了冷凍凍藏時的溶解性，使肌球蛋白重鏈聚合，鹽溶性蛋白含量下降。

圖1 中華管鞭蝦鹽溶性蛋白含量變化Fig.1 Changes in salt-soluble protein content of S.crassicornis

2.2 不同條件凍藏期間中華管鞭蝦表面疏水性變化

蛋白質表面疏水性的改變可以反映蛋白質分子表面疏水性氨基酸相對含量的改變，即可以衡量蛋白質的變性程度[19-20]。由圖2可知，凍藏前60 d，4 組凍藏條件下中華管鞭蝦肉蛋白質的表面疏水性均呈遞增趨勢，-18 ℃ SF組、-30 ℃ SF組、-18 ℃ QF組和-30 ℃ QF組依次由最初的310.2 μg上升至485.2、435.64、395.6 μg和386.7 μg，在凍藏第60天達到最大值。-18 ℃組凍藏期間蛋白質表面疏水性始終高于-30 ℃組，表明較低的凍藏溫度更能夠保護蛋白的空間構象不發生變化。凍藏0～60 d時，每組蛋白質表面疏水性上升趨勢較大，凍藏60～120 d時，表面疏水性呈先下降后平穩上升的趨勢，其原因可能為蛋白進一步氧化使疏水基團發生聚集[21]。SF組凍藏期間蛋白質表面疏水性均明顯高于QF組，說明冰箱緩凍較不凍液速凍下蝦肉的蛋白質結構發生了較大改變，尤其是-30 ℃ QF組，其蛋白質表面疏水性最低。表面疏水性的增加，是由于凍藏期間蛋白質在冷凍狀態下被氧化，導致結構發生變化，從而使疏水性脂肪酸和芳香族氨基酸暴露于蛋白質分子表面，破壞了蛋白質原先的排列方式[22-23]。

圖2 中華管鞭蝦肌肉蛋白的表面疏水性變化Fig.2 Changes in surface hydrophobicity of S.crassicornis protein

2.3 不同條件凍藏期間中華管鞭蝦Ca2＋-ATPase活性變化

Ca2＋-ATPase活性是反映肌球蛋白和肌原纖維蛋白分子完整性的重要指標[24]。如圖3所示，凍藏期間，中華管鞭蝦Ca2＋-ATPase活性明顯降低，表明其氧化過程在凍藏120 d期間一直持續，-18 ℃ SF組、-30 ℃ SF組、-18 ℃ QF組和-30 ℃ QF組的Ca2＋-ATPase活性由最初的0.98 U/mg依次下降至0.13、0.18、0.21 U/mg和0.32 U/mg，分別下降了86.73%、81.63%、78.57%和67.35%。-30 ℃低溫組和QF組的Ca2＋-ATPase活性均高于-18 ℃組和SF組。此外，凍藏前期Ca2＋-ATPase活性的降低趨勢快于后期，凍藏期間Ca2＋-ATPase活性的下降可能是由肌球蛋白頭部構象的改變及蛋白質的聚集引起[25]，這也表明低溫破壞了肌球蛋白的完整性，使蛋白發生變性，從而降低肌原纖維蛋白的功能特性，但不凍液速凍相較于冰箱緩凍，能夠在一定程度上抑制冰晶的增長，從而抑制蛋白氧化，減少蛋白結構損傷。

圖3 中華管鞭蝦肌肉蛋白的Ca2+-ATPase活性變化Fig.3 Changes in Ca2+-ATPase activity of S.crassicornis protein

2.4 不同條件凍藏期間中華管鞭蝦總巰基含量變化

總巰基含量的變化反映了蛋白質不可逆的氧化變性程度[26]。由圖4可知，4 組凍藏條件下中華管鞭蝦的總巰基含量均逐漸降低，凍藏0～60 d時，總巰基含量下降較快，這種變化是因為肌原纖維中某些巰基存在于分子外，在凍藏初期就會發生氧化，但是不會發生明顯的蛋白質結構改變[27]。-18 ℃組比較于-30 ℃組，溫度越高，總巰基含量減少越多，這說明凍藏溫度越低，越能保護蛋白的巰基不受氧化。此外，SF組總巰基含量明顯低于QF組，在凍藏前40 d和后20 d總巰基含量急劇下降，凍藏第120天時，-18 ℃ SF組、-30 ℃ SF組、-18 ℃ QF組和-30 ℃ QF組的總巰基含量依次降低了7.02%、6.26%、4.34%和3.35%，與初始值相比差異顯著（P＜0.05）。總巰基含量的降低會伴隨二硫鍵含量的升高，因此可以推測，在低溫凍藏過程中，埋藏在分子內部的巰基由于蛋白空間結構的改變而暴露，氧化成為二硫鍵[19]。圖3、4的結果表明，Ca2＋-ATPase活性降低和總巰基含量降低具有正相關，這也意味著肌球蛋白頭部的巰基直接影響Ca2＋-ATPase活性[19,28]。

圖4 中華管鞭蝦肌肉蛋白的總巰基含量變化Fig.4 Changes in total sulfhydryl content of S.crassicornis protein

2.5 不同凍藏條件下中華管鞭蝦組織蛋白酶活性變化

組織蛋白酶B、H、L是引起蝦死后肌肉降解的主要酶類[29]。由圖5可知，組織蛋白酶H活性相比于其他兩組酶活性明顯偏低，且相對于其他兩組變化不明顯，認為在冷凍凍藏期間，組織蛋白酶H對蝦肉中蛋白質的降解作用不大，因此不再對其進行探討。

由圖5a可知，組織蛋白酶B活性在凍藏第20天和第40天時，-30 ℃組比-18 ℃組、QF組比SF組的酶活性明顯偏低，表明低溫、不凍液凍藏對酶活性存在抑制作用；凍藏后期（第60天后），各組酶活性均呈上升趨勢，且不同貯藏條件組間無顯著差異（P＞0.05），該結果表明，短期低溫速凍能明顯抑制中華管鞭蝦的組織蛋白酶活力，但隨著冷凍時間的增加，組織蛋白酶B活性不再受到有效抑制。

由圖5c可知，組織蛋白酶L活性在凍藏前40 d，其活性呈下降趨勢，其原因可能為冷凍保存會降低酶活性，也有可能是因為溶酶體中的組織蛋白酶被釋放到其他亞細胞中[30]。凍藏第40天，4 組酶活性均比初始值低，凍藏后期（第60天后），4 組酶活性不斷上升，表明細胞膜的通透性增強，細胞的組織結構發生改變，導致肌原纖維蛋白發生降解[31]，這與Ca2＋-ATPase活性和總巰基含量變化相符。凍藏第120天，-18 ℃ SF組、-30 ℃ SF組、-18 ℃ QF組、-30 ℃ QF組4 組組織蛋白酶L活性依此由0.21 U/g上升至0.27、0.26、0.26、0.25 U/g，差異顯著（P＜0.05），但4 組之間無顯著差異（P＞0.05）。

對比分析圖5a、c的結果表明，組織蛋白酶L的活性高于組織蛋白酶B，這說明在凍藏過程中，組織蛋白酶L對肌肉組織的變化發揮著更主要的作用，這與Aoki等[32]的研究結果一致。

圖5 中華管鞭蝦肌肉蛋白的組織蛋白酶B（a）、H（b）、L（c）活性變化Fig.5 Changes in cathepsin B (a),H (b) and L (c) activity of S.crassicornis protein

2.6 不同條件凍藏期間中華管鞭蝦肌原纖維橫縱切面結構變化

如圖6、7所示，凍藏60 d時，QF組中華管鞭蝦肌原纖維橫切面無明顯變化，縱切面整齊，只有些許細胞間隙；而SF組中華管鞭蝦肌原纖維橫切面出現大量空隙，縱切面分布混亂，-18 ℃ SF組的蝦肉肌原纖維甚至出現了斷裂，這些間隙隨著蝦肉的汁液損失出現，蝦肉在凍結時，體內游離水被凍結成冰使體積變大，導致肌原纖維被擠壓，解凍后，肌肉中的冰又重新融化為水，使間隙變大[30,33]。凍藏120 d，4 組中華管鞭蝦的組織結構均呈現明顯改變，觀察橫切面發現，肌纖維表面出現顆粒狀，肌纖維之間的界限變得模糊，這說明肌內膜已斷裂，且與肌束膜發生分離[30]。SF組相較于QF組存在大范圍的肌纖維斷裂、肌節橫紋模糊，表明不凍液凍結凍藏有利于維持肌肉組織結構。快速凍結形成的冰晶小且分布均勻，不會對中華管鞭蝦的肌體造成機械損害，能有效抑制中華管鞭蝦的肌肉蛋白變性和降解，且-30 ℃ QF組比-18 ℃ QF組肌原纖維完整性更好，表明低溫有利于維持中華管鞭蝦肌原纖維的完整性。

圖6 中華管鞭蝦肌原纖維橫切面結構變化Fig.6 Changes in longitudinal cross-sectional structure of S.crassicornis myofibrils

圖7 中華管鞭蝦肌原纖維縱切面結構變化Fig.7 Changes in transverse cross-sectional structure of S.crassicornis myofibrils

3 結論

以舟山海域捕撈的中華管鞭蝦為原料，深入分析了不凍液速凍凍藏和冰箱緩凍凍藏條件下肌原纖維蛋白氧化的指標變化以及組織蛋白酶B、H、L活性的變化；通過肌原纖維微結構觀察，分析酶活性對肌原纖維蛋白水解產生的作用，并探討其與肌組織結構的相關性。經研究發現，不凍液凍結后的中華管鞭蝦，蛋白降解不嚴重，且組織結構保持相對較好，對肌肉的機械損傷小，對肌原纖維蛋白降解具有明顯抑制作用，對保持其肌纖維的完整性具有重要意義。本研究闡明了海捕蝦在凍結過程中的蛋白氧化情況及其體內組織蛋白酶的作用，揭示了蛋白氧化與組織蛋白酶活性的影響，為海捕蝦等海捕類水產品在凍藏過程中的蛋白氧化、品質控制和防腐保鮮提供一定理論依據，為海捕類水產品的加工凍藏開拓新思路。此外，研究還存在不足之處，還需進一步研究，如由于低溫冷卻液循環泵的溫度限制，實驗設計溫度指標較少；凍藏期間，蛋白質氧化和酶作用對其他蛋白質和結構的影響仍有待于進一步實驗和改進。